GCN5調(diào)控sublytic C5b?9誘導(dǎo)大鼠腎小球系膜細胞表達Cyclin D1及致SOX9的乙酰化修飾

郭苗苗，劉龍飛，謝夢曉，吳志皎，羅 燦，彭明玉，趙 聃，張 婧，邱 文，王迎偉

南京醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)系，江蘇 南京 211166

系膜增生性腎炎（mesangial proliferative glomer?ulonephritis，MsPGN）是人類常見的腎小球疾病，其病變特征是腎小球系膜細胞（glomerular mesangial cell，GMC）的異常增生和細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的過量堆積，最終可致腎纖維化和硬化［1］。大鼠Thy?1N 是一種普遍用于MsPGN 研究的動物模型［2］。本課題組以往研究已表明，Thy?1N 發(fā)病具有亞溶解C5b?9（sublytic C5b?9）的依賴性。體外用sublytic C5b?9 刺激GMC 后可引起細胞增生和產(chǎn)生促炎因子等［3-4］，但截至目前，有關(guān)sublytic C5b?9促進GMC增生的分子機制并不十分清楚。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在Thy?1N大鼠發(fā)病早期的腎組織和受sublytic C5b?9 刺激的GMC 中，具有組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferase，HAT）活性的GCN5和轉(zhuǎn)錄因子SOX9以及Cyclin D1的表達均同期上調(diào)。已知GCN5既可乙?；揎椊M蛋白和非組蛋白（如轉(zhuǎn)錄因子），又能作為輔助激活因子促進靶基因的轉(zhuǎn)錄［5］。再者，SOX9也可促進腫瘤細胞的增殖［6-7］，而Cyclin D1 的表達升高則能誘導(dǎo)細胞從G1期進入S期［8］。提示這3種基因的表達上調(diào)均是細胞增殖重要的調(diào)控因子。鑒于GCN5和SOX9分別是一種兼有HAT的轉(zhuǎn)錄輔激活因子和含鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，而Cyclin D1又是細胞周期家族的一個成員，故在sublytic C5b?9刺激的GMC中升高的GCN5 對Cyclin D1 基因表達有何影響，以及GCN5可否乙?；揎桽OX9目前并不知曉，本研究對此進行了探討。

1 材料和方法

1.1 材料

大鼠GMC細胞株（HBZY?1）購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。pIRES2/GCN5（帶Flag標簽）和pcDNA3.1?SOX9（帶HA 標簽）過表達質(zhì)粒、GCN5酶活性失活突變質(zhì)粒（570 位谷氨酸突變?yōu)楸彼?，簡稱ΔGCN5）均由本課題組劉龍飛博士構(gòu)建并惠贈。此外，pGL3?Cyclin D1 啟動子全長（+105～+130 nt）質(zhì)粒由本課題組謝夢曉博士構(gòu)建并惠贈。

多克隆兔抗Thy?1 Ab由本實驗室制備保存［3-4］。補體來自健康志愿者新鮮血清（normal human se?rum，NHS）。人補體C6 缺陷血清（C6DS，Comple?ment Technology 公司，美國）。補體熱滅活血清（heat inactive serum，HIS）是指56 ℃30 min 滅活的正常人血清。重組人C6（北京義翹神州生物技術(shù)有限公司）。單克隆GCN5 抗體（C26A10）、乙?；贵w（Ac?K?103）（CST公司，美國）。單克隆SOX9抗體（sc?166505，Santa Cruz 公司，美國）。多克隆Cyclin D1抗體（Abcam公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠GMC的培養(yǎng)

將大鼠GMC 細胞株接種于含有MEM 完全培養(yǎng)液（10%胎牛血清）中培養(yǎng)48 h。當細胞融合度達到80%～90%時，行細胞傳代并繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 Sublytic C5b?9刺激GMC最佳劑量的確定

將GMC 種于MEM 完全培養(yǎng)液中，當融合達60%時，用不同濃度的Thy1Ab 致敏30 min，再用不同濃度的NHS（含補體）進行孵育。然后，采用乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）法檢查GMC 溶解的百分率。GMC 溶解率小于5%稱為亞溶解（sublytic）劑量［3-4］。本研究最終確定以5%Thy1Ab與3%NHS作為形成sublytic C5b?9的最佳劑量。

1.2.3 GMC中GCN5、SOX9和Cyclin D1表達水平的測定

GMC 分組處理：將GMC 分為6 組（n=3），即①MEM 組：僅用MEM 培養(yǎng)；②Thy?1Ab 組：給Thy?1 Ab（50 μL/mL）致敏30 min，緩沖液洗滌后加MEM培養(yǎng)；③Thy?1 Ab+HIS 組：用同量Thy?1 Ab 致敏30 min，洗滌后加HIS（30 μL/mL）繼續(xù)培養(yǎng)；④Thy?1 Ab+C6DS 組：同量Thy?1 Ab 致敏30 min，洗滌后加C6DS（30 μL/mL）繼續(xù)培養(yǎng)；⑤Thy?1 Ab+C6DS+C6組：同上Thy? Ab 致敏30 min，洗滌后加入C6DS（30 μL/mL）及C6 蛋白（2 mg/L）再培養(yǎng)；⑥Sublytic C5b?9 組：加同量Thy?1 Ab 致敏30 min，洗滌后加NHS（30 μL/ml，提供補體）繼續(xù)培養(yǎng)。

Western blot 實驗：上述分組GMC 在實驗3 h 時提取蛋白，用Western blot 檢測GCN5、SOX9 和Cy?clin D1的表達。將GMC裂解物離心10 min，取20 μg蛋白行SDS?PAGE 膠電泳，先45 V恒壓濃縮再120 V電泳2 h，接著用0.3 A 恒流濕轉(zhuǎn)120 min，將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF 膜上。之后分別加入GCN5、SOX9、Cy?clin D1一抗，4 ℃過夜。漂洗后用HRP 標記的二抗孵育1 h，最后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑檢測［3-4］。

1.2.4 過表達或沉默GCN5對Cyclin D1基因啟動子活性的影響

GMC 分組處理：將GMC 轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒進行分組（n=3）：①pIRES2 組；②pIRES2?GCN5 組；③shC?TR 組；④shCTR+sublytic C5b?9 組；⑤shGCN5+sub?lytic C5b?9 組。①、②組用Lipofectamine 2000 將pIRES2 或pIRES2?GCN5 質(zhì)粒單獨或分別與含有Cyclin D1 啟動子序列的熒光素酶報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染GMC后48 h，而③、④、⑤組則同法將shCTR 或shGCN5質(zhì)粒單獨或分別與含有Cyclin D1啟動子序列的熒光素酶報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染GMC 48 h，再行sublytic C5b?9 刺激3 h（過表達和小干擾質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率驗證以檢查GCN5的表達水平確定）。

熒光素酶報告實驗：用1×被動裂解緩沖液（PLB）裂解處理后的GMC，行熒光素酶報告實驗測定Cyclin D1 啟動子活性。步驟：先在檢測管中加入25 μL 熒光素酶檢測試劑Ⅱ，放入熒光發(fā)光儀中，接著轉(zhuǎn)移2.5 μL PLB 裂解的細胞液到檢測管中，混合后檢測螢火蟲熒光素酶的活性，最后加入25 μL Stop&Glo?Reagent 檢測海腎熒光素酶的活性。螢火蟲熒光值/海腎熒光值的比值即為最終結(jié)果［3-4］。

1.2.5 過表達或沉默GCN5對Cyclin D1基因轉(zhuǎn)錄與表達的檢查

Cyclin D1 mRNA水平的測定：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染GMC的分組同1.2.4。用Primer Premier 5 軟件設(shè)計大鼠Cy?clin D1和β?actin qPCR引物。引物序列如下：Cyclin D1上游5′?AGAGGGAGATTGTGCCATCC?3′，下游5′?ACAAGA?ACCGGTCCAGGTA G?3′；β?actin 上游5′?TCACCCACACTGTGCCCATCTATGA?3′，下游5′?CATCGGAA?CCGCTCATTGCCGATAG?3′。提取GMC總RNA，取500 ng 總RNA 作模板，行逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA。Real?time PCR反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃，10 s預(yù)變性；95 ℃，5 s，60 ℃，31 s，共40 個循環(huán)。用β?actin作內(nèi)參基因，計算公式為：2-ΔΔCT。Cyclin D1 蛋白表達的測定同1.2.3所述。

1.2.6 Sublytic C5?9 刺激的GMC 中SOX9 乙?；降蔫b定

GMC分組處理同前1.2.3。SOX9乙?；接妹庖吖渤恋恚–o?IP）和Western blot 實驗檢測。按說明書操作，每6孔板GMC加入200 μL IP 裂解液（含PMSF 和磷酸酶抑制劑），提取蛋白后行Western blot檢測，一抗為乙酰化抗體（Ac?K?103），實驗步驟見1.2.3描述。

1.2.7 過表達GCN5和酶活性突變質(zhì)粒（ΔGCN5）或沉默GCN5基因影響SOX9乙?；臋z查

GMC 分組處理：過表達GCN5 和ΔGCN5 的分組是：①HA?SOX9+pIRES2組，②HA?SOX9+Flag?GCN5組，③HA?SOX9+ΔGCN5組。分別轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒于GMC中48 h。另沉默GCN5基因的分組是：①shCTR組；②shCTR+sublytic C5b?9組；③shGCN5+sublytic C5b?9 組。將shCTR 或shGCN5 質(zhì)粒單獨轉(zhuǎn)染GMC后48 h，②和③組再行sublytic C5b?9 刺激3 h（所有分組n=3）。SOX9乙?；降臏y定同1.2.6所述。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有實驗均獨立重復(fù)3 次，所得定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤（）表示，組間比較則采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法。應(yīng)用GraphPad?prism軟件（版本5.01）進行統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Thy?1N 大鼠腎組織中GCN5、SOX9 和Cyclin D1基因的表達

取Thy?1N大鼠發(fā)病3 h和正常兔血清（NRS）對照鼠3 h 的腎組織進行檢查顯示，Thy?1N 組的GCN5、SOX9 和Cyclin D1 表達明顯升高（P＜0.05，圖1）。

圖1 Thy?1N大鼠腎組織中GCN5、SOX9和Cyclin D1蛋白的表達Figure 1 GCN5，SOX9 and Cyclin D1 expression in the renal tissues of Thy?1N rat

2.2 Sublytic C5b?9 刺激的GMC 中GCN5、SOX9 和Cyclin D1蛋白的表達

將GMC 分為MEM、Thy?1 Ab、Thy?1 Ab+HIS、Thy?1 Ab+C6DS、Thy?1 Ab+C6DS+C6和sublytic C5b?9 組。Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)，3 h 時，sublytic C5b?9組和Thy?1 Ab+C6DS+C6組的GCN5、SOX9和Cyclin D1表達明顯增加（P＜0.05或P＜0.01，圖2）。

圖2 不同處理3 h的GMC中GCN5、SOX9和Cyclin D1蛋白的表達Figure 2 GCN5，SOX9 and Cyclin D1 protein expression at 3 h in the GMC by different treatment

2.3 過表達或沉默GCN5對Cyclin D1基因啟動、轉(zhuǎn)錄和表達的影響

將pGL3?Cyclin D1 啟動子質(zhì)粒分別與pIRES2/GCN5 或shGCN5 共轉(zhuǎn)染GMC。在轉(zhuǎn)染后48 h，pIRES2/GCN5 組不予刺激，而轉(zhuǎn)染shGCN5 質(zhì)粒的GMC 培養(yǎng)36 h，用無血清饑餓12 h，再給予sublytic C5b?9 刺激3 h。結(jié)果顯示，過表達GCN5 基因明顯上調(diào)Cyclin D1 的啟動子活性，而沉默GCN5 基因后由sublytic C5b?9 上調(diào)的Cyclin D1 啟動子活性顯著下降（P＜0.05或P＜0.01，圖3）。

圖3 過表達或沉默GCN5 對GMC 中Cyclin D1 基因啟動子活性的影響Figure 3 Effects of GCN5 overexpression or knockdown on the activity of Cyclin D1 promoter in GMC

GMC 處理后提取總RNA 和蛋白，real?time PCR和Western blot 檢測顯示，過表達GCN5 可顯著增加Cyclin D1 的mRNA 和蛋白水平，而沉默GCN5 基因則可抑制sublytic C5b?9 誘導(dǎo)的Cyclin D1 表達（P＜0.05或P＜0.01，圖4）。

2.4 Sublytic C5b?9 刺激大鼠GMC 后SOX9 乙?；男揎?/h3>

實驗證實，sublytic C5b?9和Thy?1 Ab+C6DS+C6組，SOX9 的乙?；斤@著增加，且SOX9 的蛋白表達也明顯升高（圖5）。

過表達GCN5基因?qū)OX9乙?；揎椀挠绊懀簽榱俗C明GCN5 可對SOX9 進行乙?；揎棧瑢IRES2、Flag?GCN5 過表達質(zhì)粒及ΔGCN5 分別與HA?SOX9 過表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染GMC 48 h，行Co?IP/Western blot 檢測證實，過表達GCN5可增強SOX9的乙?；^表達ΔGCN5則對SOX9乙?；綗o明顯影響（圖6）。

沉默GCN5 基因?qū)ublytic C5b?9 誘導(dǎo)SOX9 乙?；揎椀挠绊懀簽榱诉M一步明確GCN5 能乙酰化修飾SOX9，將shGCN5及對照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染GMC再行sublytic C5b?9刺激3 h，用Co?IP/Western blot實驗發(fā)現(xiàn)，沉默GCN5基因后確能明顯降低sublytic C5b?9誘導(dǎo)SOX9的乙?；揎棧▓D7）。

圖6 過表達GCN5或ΔGCN5影響SOX9乙?；揎椀淖饔肍igure 6 Effects of GCN5 or ΔGCN5 overexpression on SOX9 acetylation

3 討論

圖7 沉默GCN5 基因后影響sublytic C5b?9 誘導(dǎo)SOX9 乙酰化的修飾Figure 7 Effects of GCN5 gene silencing on SOX9 acetyla?tion induced by sublytic C5b?9

人類MsPGN 發(fā)病率約占臨床腎病綜合征的30%，其組織病變的主要特征是，GMC 的過度增生和ECM 的大量積聚，最終可致腎小球纖維化，引起患者腎功能衰竭而死亡［1］。大鼠Thy?1N 是當今研究MsPGN 公認的動物模型［2］。以往實驗已表明，Thy?1N的發(fā)病具有sublytic C5b?9的依賴性，即當其GMC膜表面形成sublytic C5b?9后，它可作為細胞的刺激原激活某些信號通路及上調(diào)多種轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄輔激活因子，進而促使相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄與表達，最終引起GMC的凋亡、炎癥或增生反應(yīng)［3-4，9］。

就Thy?1N大鼠GMC的增生而言，不僅需要sub?lytic C5b?9的插膜刺激，也需要轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄輔激活因子和促增生基因的共同參與［10-12］。本課題前期實驗已確證，無論是Thy?1N 大鼠發(fā)病3 h 的腎組織（體內(nèi)），還是在受sublytic C5b?9 刺激3 h 的GMC 中（體外），GCN5、SOX9 和Cyclin D1 的表達均明顯上調(diào)。此外，本課題組還發(fā)現(xiàn)，Cyclin D1 表達的高峰時相稍晚于GCN5和SOX9，且GCN5與SOX9的表達峰值基本同步，加之SOX9 的上調(diào)能促進Cyclin D1基因轉(zhuǎn)錄，故這些結(jié)果提示，GCN5、SOX9 和Cyclin D1之間可能存在著密切的關(guān)系。

由于本課題組過去的實驗已發(fā)現(xiàn)，SOX9 對Cyclin D1的表達有調(diào)控效應(yīng)（待發(fā)表）。因此，本研究著重探討了在GMC 中過表達或沉默GCN5 對Cyclin D1 基因激活的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達GCN5 能提高Cyclin D1 的啟動子活性、mRNA 和蛋白水平，而沉默GCN5基因則能降低由sublytic C5b?9 刺激導(dǎo)致的Cyclin D1 基因的啟動與表達。提示，GCN5確能促進Cyclin D1基因的表達。

文獻報道，GCN5 作為一個兼有HAT 活性的轉(zhuǎn)錄輔激活因子，其表達升高時既能乙?；揎椊M蛋白，又能乙?；揎椃墙M蛋白（如轉(zhuǎn)錄因子），以增強其自身的活性，最終有利于靶基因的轉(zhuǎn)錄［5，13-15］。本研究為了觀察受sublytic C5b?9刺激的GMC中SOX9能否與GCN5結(jié)合并被GCN5乙酰化修飾，在體外進行了Co?IP/Western blot 實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用sublytic C5b?9 刺激GMC 后，其SOX9 確可與GCN5 結(jié)合，且其乙?；矫黠@增加。另外，在GMC 中過表達GCN5 能明顯提高SOX9 的乙?；?，而在GMC中轉(zhuǎn)染酶活性缺失的ΔGCN5 質(zhì)粒后，SOX9 的乙酰化水平則無明顯變化。再者，沉默GCN5 基因也可下調(diào)sublytic C5b?9誘導(dǎo)的SOX9乙?；纳?。提示，sublytic C5b?9刺激細胞后，GCN5確能乙?；揎桽OX9，且其作用依賴于GCN5的HAT活性。

綜上所述，本研究在確證了Thy?1N大鼠的腎組織和受sublytic C5b?9 刺激的GMC 中GCN5、SOX9、Cyclin D1蛋白表達均已增加的基礎(chǔ)上，進一步探討了GCN5 對Cyclin D1 表達的影響，以及GCN5 對SOX9的乙?；揎椬饔?。研究揭示，GCN5既能促進Cyclin D1 基因的表達，又能乙?；揎桽OX9。本研究結(jié)果為今后深入研究Thy?1N 的發(fā)病機制提供了有用的實驗依據(jù)。