棉花枯萎病生防菌的篩選及其抑菌機(jī)理初探

賈熙超，楊淑珂，孫紅煒，徐曉輝，李凡，路興波

(1. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，山東 濟(jì)南 250100; 2. 山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014)

棉花(GossypiumhirsutumL.)[1]是全球重要的作物，中國(guó)的棉產(chǎn)量居世界前列[2]。山東的產(chǎn)棉量位居全國(guó)第二，種植面積占全國(guó)的15%。作為主要的經(jīng)濟(jì)作物，棉花是農(nóng)民和地方政府財(cái)政收入的重要來(lái)源，為當(dāng)?shù)氐陌l(fā)展提供了強(qiáng)有力的支持[3]。

棉花枯萎病的病原菌是一種尖鐮孢菌萎蔫?；蚚Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum(Atk.) Snyder et Hansen]，屬鐮刀菌屬，其侵染的絕大部分是野生植物[4]。由其分泌的鐮刀菌酸是一種特異性毒素，該毒素具有耐高溫、耐稀釋、耐儲(chǔ)藏和快速致病的能力，可同時(shí)破壞植物的碳、氮循環(huán)系統(tǒng)，并且能夠使葉綠素的合成受阻，從而影響光合效率。該病原菌通過(guò)侵染棉花的維管束等部位，導(dǎo)致導(dǎo)管的阻塞從而影響水分以及養(yǎng)分的運(yùn)輸，并最終抑制棉花的新陳代謝系統(tǒng)，進(jìn)而使其葉片脫落、枯死[5]。

多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)在很早以前被歸類為芽孢桿菌屬(Bacillus)，直到1994年才被重新分類為類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)。它屬于促進(jìn)植物生長(zhǎng)的根際細(xì)菌(PGPR)，能夠產(chǎn)生許多有益的生物活性物質(zhì)，包括具有廣譜抗菌活性的抗菌素多粘菌素fusaricidins和抗微生物蛋白質(zhì)，以促進(jìn)植物生長(zhǎng)[6]。

目前，國(guó)際以及國(guó)內(nèi)對(duì)棉花枯萎病的防治主要還是采用化學(xué)農(nóng)藥，防治效果并不理想，還會(huì)帶來(lái)環(huán)境污染、病原菌耐藥性等問(wèn)題[7]。相比于化學(xué)農(nóng)藥，生物防治具有專一性強(qiáng)、環(huán)境友好的特點(diǎn)。

本試驗(yàn)從山東省棉花枯萎病的病田中采集根際土壤，并篩選其中的生防菌，對(duì)抑菌效果較好的菌株進(jìn)行鑒定，并對(duì)其抑菌機(jī)理進(jìn)行初步探究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株 病原菌株：尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)，由山東棉花研究中心惠贈(zèng)。

抑菌譜用真菌：瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)、終極腐霉(Pythiumultimum)、灰葡萄孢(Botrytiscinerea)、離蠕孢菌(Bipolarissorokiniana)、禾谷鐮刀菌(F.graminearum)、子囊菌(Ascomycetesp.)，均由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所病理室惠贈(zèng)。

抑菌譜用細(xì)菌：金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、沙門氏菌(Salmonella)、弧菌(Vibrio)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 土樣 采集山東省東營(yíng)市(10份)、聊城市(8份)、濟(jì)寧市(14份)、德州市(6份)、濟(jì)南市(9份)等棉田中發(fā)生枯萎病且生長(zhǎng)健壯植株根際土壤(距地表10～20 cm)。

1.1.3 培養(yǎng)基 PDA液體培養(yǎng)基：去皮土豆200 g，可溶性葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然，121℃高壓蒸汽滅菌25 min。固體培養(yǎng)基中加入15 g瓊脂。

LB液體培養(yǎng)基：酵母抽提物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，蒸餾水 1 000 mL，pH自然，121℃高壓蒸汽滅菌25 min。固體培養(yǎng)基中加入15 g 瓊脂。

NA液體培養(yǎng)基：牛肉浸膏3 g，胰蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然，121℃ 0.1 MPa滅菌30 min。固體培養(yǎng)基中加入15 g 瓊脂。

幾丁質(zhì)酶鑒定培養(yǎng)基：膠體狀幾丁質(zhì)10 g，KCl 0.2 g，NH4H2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，去離子水1 000 mL，瓊脂20 g，pH自然，121℃高壓蒸汽滅菌25 min。

蛋白酶鑒定培養(yǎng)基：脫脂奶粉15 g，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL，121℃高壓蒸汽滅菌25 min。

果膠酶鑒定培養(yǎng)基[8]：酵母提取物5 g，CaCl2·2H2O 0.5 g，瓊脂8 g，聚果膠酸鈉10 g，蒸餾水1 000 mL，NaOH(1 mol/L) 9 mL，0.2%溴百里酚藍(lán)12.5 mL。為讓聚果膠酸鈉充分溶解，必須盡可能地?cái)嚢枧囵B(yǎng)基，用熱水溶解各組成成分，121℃高壓滅菌不超過(guò)5 min，倒平板。

纖維素酶鑒定培養(yǎng)基[9]：(NH4)2SO40.2 g，MgSO40.05 g，KH2PO40.1 g，NaCl 0.05 g，纖維素粉2 g，剛果紅0.02 g，瓊脂2 g，去離子水100 mL，pH自然，121℃高壓蒸汽滅菌25 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生防菌株的篩選 采用稀釋涂布法[10]：準(zhǔn)確稱取棉花根際土樣10 g于加有90 mL蒸餾水的250 mL錐形瓶中，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中180 r/min振蕩20 min制備土壤懸液，之后靜置沉淀10 min。吸取1 mL土壤懸液上清，加入到9 mL蒸餾水中渦旋振蕩直至均勻，此為10-1，按照同樣的方法制備10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的稀釋液。取不同稀釋濃度的菌懸液200 μL，均勻涂布于固體NA培養(yǎng)基中，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)。將涂布好的平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

將長(zhǎng)出的單菌落點(diǎn)接到中央接種有尖孢鐮刀菌的PDA平板上，進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)，對(duì)具有抑菌效果的菌株進(jìn)行菌種保藏。

1.2.2 生理生化特征及分子生物學(xué)鑒定 將菌株在LB液體培養(yǎng)基中活化，取1 mL菌懸液至盛有50 mL LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中(250 mL)，30℃、180 r/min進(jìn)行培養(yǎng)，每隔2 h取樣一次，測(cè)定其在600 nm下的光吸收值[11]。

將篩選的生防菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，28℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600為1.28，取1 mL注入到含有50 mL LB的液體培養(yǎng)基中，分別置于25、28、31、34、37、40、43℃條件下，200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，測(cè)其OD600。根據(jù)OD值大小判定最適生長(zhǎng)溫度。

對(duì)生防菌株進(jìn)行淀粉水解試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)，以及NaCl耐受性試驗(yàn)，鑒定其生理生化特征。

將生防菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至菌懸液渾濁，收集菌體。用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取菌體總DNA，利用通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系(20 μL)：Mix 10 μL，ddH2O 7 μL，引物27F 1 μL，引物1492R 1 μL，DNA 1 μL。PCR擴(kuò)增程序：95℃ 3 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。將PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，用回收試劑盒回收目的條帶，送至鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序。將反饋回來(lái)的16S rDNA數(shù)據(jù)與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)，并用MEGA 6.0軟件的NJ算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.3 生防菌株抑菌譜的測(cè)定 采用平板對(duì)峙法：在PDA固體培養(yǎng)基中央接種直徑為1 cm的待測(cè)病原菌絲塊；同時(shí)，在距離菌絲塊2 cm的四周接種生防菌株，28℃恒溫培養(yǎng)4～5 d，觀察并測(cè)量抑菌圈大小。

1.2.4 生防菌株抑菌物質(zhì)檢測(cè) (1)揮發(fā)性物質(zhì)檢測(cè)：于PDA平板中心接種尖孢鐮刀菌菌絲塊，分別在LB、PDA和NA平板上劃線接種生防菌株，將兩個(gè)培養(yǎng)皿口對(duì)口對(duì)接，并用封口膜封上，30℃條件下培養(yǎng)3 d，同時(shí)設(shè)置不接生防菌株的空白對(duì)照。培養(yǎng)時(shí)尖孢鐮刀菌平板在上方，生防菌株平板在下方[12]。

(2)幾丁質(zhì)酶檢測(cè)：將生防菌株在NA固體培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，將活化好的單菌落點(diǎn)接到幾丁質(zhì)酶鑒定培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)6 d，檢測(cè)透明圈的有無(wú)[13]。

(3)蛋白酶檢測(cè)：將菌株在NA固體培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，然后用接種環(huán)挑取單菌落到蛋白酶鑒定培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)48 h，檢查透明圈的有無(wú)[14]。

(4)果膠酶檢測(cè)：在果膠酶鑒定培養(yǎng)基上接種生防菌株，培養(yǎng)3 d，觀察培養(yǎng)基有無(wú)凹陷，凹陷則說(shuō)明菌株產(chǎn)生了果膠酶。

(5)纖維素酶檢測(cè)：挑取活化后的生防菌單菌落到纖維素酶鑒定培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)5 d，查看是否產(chǎn)生水解圈。

1.2.5 菌株JNJX-2發(fā)酵上清液對(duì)病原菌孢子、菌絲的影響 (1)對(duì)孢子萌發(fā)的影響：將病原菌活化后接入PDA液體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)5 d，得到的菌懸液用3層紗布過(guò)濾，制成孢子懸浮液，無(wú)菌水調(diào)整孢子濃度到1×107個(gè)/mL。選用PDA液體培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基，按照1%的接種量進(jìn)行接種，28℃、180 r/min連續(xù)培養(yǎng)5 d。將菌懸液在4℃、8 000 r/min條件下離心25 min，得發(fā)酵上清液。取100 μL孢子液與等量的JNJX-2發(fā)酵上清液混勻，28℃保溫培養(yǎng)，每隔12 h在顯微鏡下計(jì)數(shù)，檢查孢子的萌發(fā)情況[15]，蒸餾水處理做空白對(duì)照。

萌發(fā)率(%)=已萌發(fā)孢子數(shù)/(已萌發(fā)孢子數(shù)+未萌發(fā)孢子數(shù))×100。

(2)對(duì)菌絲的抑制作用：將尖孢鐮刀菌接種到PDA固體培養(yǎng)基上，在其四周接種生防菌株，28℃培養(yǎng)3 d。顯微鏡下觀察抑菌圈處菌絲的變化，同時(shí)設(shè)置不接種生防菌為空白對(duì)照。

1.2.6 抑菌粗提物的制備 將發(fā)酵上清液與乙酸乙酯等體積加入分液漏斗中，搖晃均勻，然后靜置沉淀過(guò)夜。重復(fù)萃取3次，合并萃取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40℃條件下進(jìn)行旋蒸，旋瓶轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)為87 r/min，真空泵壓力為-0.095 MPa，冷凝水溫度調(diào)節(jié)為4℃。期間不斷調(diào)節(jié)旋瓶與水面的高度，防止爆沸。旋瓶底部的粗提物用甲醇進(jìn)行溶解、提取，最后收集粗提物到離心管。

1.2.7 粗提物的性質(zhì)測(cè)定 將尖孢鐮刀菌孢子液調(diào)整到1×107個(gè)/mL，取200 μL注入到PDA平板并用滅菌棉簽涂抹均勻，之后對(duì)平板打孔供對(duì)峙使用。每個(gè)處理重復(fù)3次。

(1)熱穩(wěn)定性：將粗提物分別在60、80、100、121℃條件下處理25 min，使用平板對(duì)峙法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

(2)紫外線穩(wěn)定性：將粗提物分別在紫外燈下照射4、6、8、10、12 h，取處理后的粗提物進(jìn)行平板對(duì)峙。

(3)蛋白酶穩(wěn)定性：將粗提物分別與胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶混勻，使酶的最終濃度為1 mg/mL，水浴鍋中溫浴1～2 h，之后進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

(4)不同pH條件下的穩(wěn)定性：使用HCl與NaOH將粗提物的pH調(diào)整為4、5、6、7、8、9、10，于室溫下靜置一段時(shí)間，注入PDA平板進(jìn)行對(duì)峙，觀察抑菌活性大小。

抑菌活性(%)=處理后的抑菌圈半徑/無(wú)處理的抑菌圈半徑×100。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用DPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的形態(tài)學(xué)特征

菌株JNJX-2在固體PDA培養(yǎng)基上單菌落呈圓形，不透明，淡黃色，菌落表面隆起，邊沿較為整齊(圖1)。

圖1 菌株JNJX-2的單菌落形態(tài)

2.2 菌株生理生化特征

2.2.1 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 菌株JNJX-2在4～12 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)菌株高速生長(zhǎng)；12 h以后進(jìn)入穩(wěn)定期；20 h以后進(jìn)入衰退期(圖2)。因此要獲取最有活力的菌株，應(yīng)選在4～12 h之間。

圖2 菌株JNJX-2的生長(zhǎng)曲線

2.2.2 最適生長(zhǎng)溫度的測(cè)定 菌株JNJX-2的菌懸液隨著溫度的上升，光吸值先上升后下降，37℃下OD600值最大(圖3)，即菌懸液的濃度最大，說(shuō)明37℃是菌株的最適培養(yǎng)溫度。

圖3 菌株JNJX-2的最適生長(zhǎng)溫度

2.2.3 生理生化指標(biāo) 菌株JNJX-2的各項(xiàng)生理生化指標(biāo)(表1)與多粘類芽孢桿菌在淀粉水解試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)結(jié)果[16]一致，只有NaCl耐受性不同。

表1 菌株JNJX-2的生理生化特征

2.3 生防菌株16S rDNA的序列分析

將擴(kuò)增片段在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，檢測(cè)結(jié)果顯示(圖4)，目的片段在1 400 bp左右，符合預(yù)期大小。

M: DL 4500 DNA Marker。

在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中將16S rDNA基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，利用MEGA 6.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建，結(jié)果(圖5)顯示，菌株JNJX-2與多粘類芽孢桿菌在同一分支上。

通過(guò)生理生化特征與分子生物學(xué)方法，鑒定菌株JNJX-2為多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)。

2.4 菌株JNJX-2的抑菌譜

菌株JNJX-2對(duì)病原真菌的抑菌效果如圖6所示。對(duì)灰葡萄孢和離蠕孢菌的抑制效果最好，抑菌半徑都達(dá)到0.75 cm；對(duì)瓜果腐霉和終極腐霉沒有抑菌效果(表2)。在與常見病原細(xì)菌的對(duì)峙中，JNJX-2對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果最好，抑菌半徑達(dá)到0.85 cm；對(duì)銅綠假單胞菌和弧菌沒有抑制作用。綜上所述，多粘類芽孢桿菌JNJX-2是一株抑菌譜較為廣泛的生防菌。

Paenibacillus polymyxa: 多粘類芽孢桿菌; Brevibacillus fulvus: 黃褐色短芽孢桿菌; Brevibacillus limnophilus: 嗜湖短芽孢桿菌; Sporolactobacillus terrae: 土乳芽孢桿菌; Amphibacillus xylanus: 木雙歧桿菌; Aneurinibacillus migulanus: 米氏硫胺素芽孢桿菌; Aneurinibacillus thermoaerophilus: 嗜熱厭氧桿菌; Halobacillus profundi: 深鹽桿菌; Bacillus licheniformis: 地衣芽孢桿菌; Bacillus subtilis: 枯草芽孢桿菌; Bacillus anthracis: 炭疽桿菌; Bacillus cereus: 蠟樣芽孢桿菌。

圖6 菌株JNJX-2對(duì)不同植物病原真菌的抑制效果

表2 菌株JNJX-2對(duì)不同病原菌的抑制效果

2.5 菌株JNJX-2抑菌物質(zhì)測(cè)定

2.5.1 揮發(fā)性抑菌物質(zhì)測(cè)定 在不同培養(yǎng)基上接種多粘類芽孢桿菌JNJX-2，上層PDA平板中的尖孢鐮刀菌都正常生長(zhǎng)，與不接菌的空白對(duì)照沒有任何區(qū)別(圖7)，說(shuō)明菌株JNJX-2不能產(chǎn)生可以抑菌的揮發(fā)性物質(zhì)。

圖7 菌株JNJX-2在不同培養(yǎng)基下產(chǎn)揮發(fā)性抑菌物質(zhì)測(cè)定

2.5.2 水解酶檢測(cè) 如圖8所示，在幾丁質(zhì)酶鑒定培養(yǎng)基、蛋白酶鑒定培養(yǎng)基、果膠酶鑒定培養(yǎng)基、纖維素酶鑒定培養(yǎng)基中均產(chǎn)生了透明水解圈，說(shuō)明菌株JNJX-2可以產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、蛋白酶、果膠酶以及纖維素酶。

A: 幾丁質(zhì)酶鑒定培養(yǎng)基; B: 蛋白酶鑒定培養(yǎng)基; C: 果膠酶鑒定培養(yǎng)基; D: 纖維素酶鑒定培養(yǎng)基。

2.6 發(fā)酵上清液對(duì)尖孢鐮刀菌孢子的影響

經(jīng)過(guò)菌株JNJX-2發(fā)酵上清液處理過(guò)的病原菌孢子表現(xiàn)為輪廓模糊，芽孢壁破碎不完整，而且不萌發(fā)(圖9A)。對(duì)照組孢子則出現(xiàn)孢子管，孢子輪廓也較清晰(圖9B)。通過(guò)發(fā)酵上清液處理后的尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)率降低，60 h的萌發(fā)率為52.67%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)照組的93.00%(圖10)。

A: 上清液中的尖孢鐮刀菌孢子; B: 正常尖孢鐮刀菌孢子。

2.7 菌株JNJX-2對(duì)尖孢鐮刀菌菌絲的抑制情況

由圖11可以看出，與正常菌絲相比，產(chǎn)生抑菌圈部分的菌絲生長(zhǎng)受到抑制，發(fā)生不規(guī)則卷曲，并且菌絲細(xì)短、生長(zhǎng)雜亂，易于斷裂，原生質(zhì)發(fā)生凝集，菌絲頭部膨大、分節(jié)，出現(xiàn)溶菌現(xiàn)象。正常菌絲表面光滑，細(xì)長(zhǎng)不溶斷，表現(xiàn)出很好的生長(zhǎng)趨勢(shì)。

圖10 菌株JNJX-2的發(fā)酵上清液對(duì)尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)率的影響

2.8 萃取旋蒸法制備抑菌粗提物

將菌株JNJX-2的發(fā)酵上清液進(jìn)行萃取、旋蒸，得到黃色油狀粗提物。將得到的粗提物過(guò)0.22 μm的細(xì)菌過(guò)濾器，得粗提物濾液。將粗提物濾液、粗提物、粗提物的抽提試劑甲醇及無(wú)菌水分別加入PDA固體培養(yǎng)基中，觀察抑菌效果，如圖12所示。粗提物與粗提物濾液具有相同的抑菌效果，說(shuō)明粗提物內(nèi)的有效成分可以穿過(guò)0.22 μm的細(xì)菌過(guò)濾器，其應(yīng)該是一種小分子化合物；甲醇沒有抑菌效果，說(shuō)明甲醇不會(huì)對(duì)粗提物產(chǎn)生影響。

A: 對(duì)峙圖; B: 抑菌圈邊緣處菌絲; C: 正常菌絲。

A: 甲醇; B: 粗提物; C: 粗提物濾液; CK: 無(wú)菌水。

2.9 粗提物的性質(zhì)

如圖13所示，粗提物經(jīng)不同溫度處理后，抑菌活性基本保持不變，說(shuō)明粗提物具有一定的耐熱性。經(jīng)不同時(shí)間紫外線照射后，粗提物的抑菌活性基本沒有變化(圖14)，說(shuō)明紫外線的照射并不能影響粗提物的抑菌活性。與對(duì)照CK相比，使用胰蛋白酶、胃蛋白酶以及蛋白酶K處理過(guò)的粗提物的抑菌活性并沒有受到影響(圖15)，說(shuō)明粗提物中沒有蛋白類的有效成分，而是其他物質(zhì)在發(fā)揮作用。不同pH條件會(huì)對(duì)粗提物產(chǎn)生不同的影響(圖16)，當(dāng)pH為7時(shí)活性最高；堿性環(huán)境對(duì)粗提物的影響大于酸性環(huán)境。說(shuō)明粗提物具有一定的耐酸能力，但耐堿性較弱。

圖13 溫度對(duì)粗提物抑菌活性的影響

圖14 紫外線照射對(duì)粗提物抑菌活性的影響

圖15 不同蛋白酶對(duì)粗提物抑菌活性的影響

圖16 不同pH值對(duì)粗提物抑菌活性的影響

3 討論與結(jié)論

棉花枯萎病作為常見的土傳真菌病害，其在土壤中的存活時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)棉花產(chǎn)量構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。利用生防菌防治棉花枯萎病，可以有效減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，是一種極具應(yīng)用潛力的防治方法[17]。

本試驗(yàn)從棉花根際土中篩選出一株對(duì)棉花枯萎病具有良好防效的生防菌株JNJX-2，鑒定為多粘類芽孢桿菌。該菌對(duì)植物病原真菌灰葡萄孢和離蠕孢菌的防效較好；對(duì)細(xì)菌中金黃色葡萄球菌的防效較好，大腸桿菌及沙門氏菌次之。JNJX-2菌株能夠分泌溶解病原真菌細(xì)胞壁的酶類，這與相關(guān)文獻(xiàn)上報(bào)道的芽孢桿菌可以產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、β-1, 3-葡聚糖酶的結(jié)論相吻合[18，19]。有報(bào)道表明，芽孢桿菌是通過(guò)抑制病原菌絲和孢子發(fā)揮作用的，抑菌物質(zhì)使菌絲發(fā)生溶斷、原生質(zhì)溢出、孢子壁破碎，病原菌因此無(wú)法再侵染宿主植物[20]。通過(guò)萃取與旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)相結(jié)合的方法，從其發(fā)酵液的萃取液中分離出具有較強(qiáng)抑菌能力的粗提物，該物質(zhì)色澤發(fā)黃，伴有刺鼻氣味。粗提物對(duì)溫度、紫外線、水解酶類都不敏感，對(duì)酸性環(huán)境的耐受性好于堿性環(huán)境，與韋巧婕[21]的研究結(jié)果相似。

多粘類芽孢桿菌可以產(chǎn)生多種抗菌脂肽，且在芽孢桿菌中最具代表性，是自然界抗菌素的天然寶庫(kù)。其分泌的活性物質(zhì)不僅對(duì)許多細(xì)菌和真菌有抑制活性，還能提高植物的抗病能力，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高產(chǎn)量，并能產(chǎn)生多肽類抗菌物質(zhì)。傳統(tǒng)農(nóng)藥的使用極易導(dǎo)致致病菌產(chǎn)生抗藥性，造成惡性循環(huán)，降低農(nóng)藥效率，因此高效安全的微生物農(nóng)藥具有十分廣闊的應(yīng)用前景。