南昌白豬大腸桿菌的分離鑒定及體外抑菌試驗(yàn)

李歡，黃婧文，梁潤利，萬樂，吳晨曉，張羿洋，肖芬，萬振鵬，朱芝秀

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西南昌330045）

大腸桿菌普遍存在于人和動(dòng)物的腸道內(nèi)，是一種常見的人畜共患病條件型致病菌[1]，某些血清型致病性的大腸桿菌及其毒素可引起的白豬大腸桿菌病[2],是危害仔豬生長發(fā)育的主要疫病之一[3],該病主要表現(xiàn)為腸系膜淋巴結(jié)腫大、充血；心、肝、腎有不同程度的變性和小的凝固性壞死灶[4]。2020 年10月，江西省某養(yǎng)豬場(chǎng)一頭白豬因腹瀉死亡。對(duì)疑似大腸桿菌感染的病例進(jìn)行臨床解剖。對(duì)從病變內(nèi)臟中分離出的細(xì)菌進(jìn)行鑒定和體外抑菌試驗(yàn)，探討對(duì)該病有效的防治方法

1 材料

1.1 病料和試驗(yàn)動(dòng)物

病料：江西省某豬場(chǎng)患病死亡豬。實(shí)驗(yàn)小白鼠：20g 左右，南昌大學(xué)動(dòng)物養(yǎng)殖室提供。

1.2 試驗(yàn)試劑及器材

NA 培養(yǎng)基、EMB 培養(yǎng)基、MACC 培養(yǎng)基、TSI 培養(yǎng)基，購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；5%兔血培養(yǎng)基，自行配制；藥敏試紙、腸桿菌生化鑒定微量管，購自杭州天和微生物有限公司；牛津杯，購自上海申源科學(xué)儀器有限公司；數(shù)顯游標(biāo)卡尺，購自上海上工儀器有限公司；超凈工作臺(tái)，購自蘇州凈化集團(tuán)。

1.3 試驗(yàn)用菌

乳酸菌 T-C-7-R1、T-C-7-R2、T-C-7-R3：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室保存。

2 方法

2.1 細(xì)菌分離鑒定

2.1.1 臨床診斷。觀察心、肺、肝器官的病變情況；觀察腸系膜淋巴結(jié)、各腸段的病變情況。截取脾臟、肺、小腸等器官的病變部位進(jìn)行瑞氏染色鏡檢。

2.1.2 分離培養(yǎng)。從豬脾臟、小腸、肺等病變部位中勾取病料，接種于5%的兔血平板，37℃培養(yǎng)24h后，篩選單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，察看細(xì)菌在油鏡下的整體外形；純化接種在普通瓊脂培養(yǎng)基上,獲得分離菌 D2、D3、D4；將 D2、D3、D4 進(jìn)行鑒別培養(yǎng)，分別在EMB 培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、TSI 瓊脂斜面培養(yǎng)基上劃線接種后于37℃培養(yǎng)24h，觀察菌落形態(tài)。

2.1.3 生化鑒定。將D2、D3、D4 分別接種于腸桿菌科的生化鑒定微量管中，37℃培養(yǎng)24～48h，觀察反應(yīng)，加入生化反應(yīng)指示劑。對(duì)結(jié)果進(jìn)行記錄和分析。

2.2 體外抑菌試驗(yàn)

2.2.1 藥敏試驗(yàn)。依據(jù)紙片擴(kuò)散法[5]，無菌操作將D2、D3、D4 接種于普通肉湯中，37℃培養(yǎng) 24h，將發(fā)酵液均勻涂布于EMB 培養(yǎng)基上，藥敏紙片按序貼于培養(yǎng)基表面，記錄藥敏紙片藥物名稱，在37℃恒溫箱中靜置24h，觀察并記錄結(jié)果，游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈的直徑。

2.2.2 乳酸菌體外抑菌試驗(yàn)。按照牛津杯擴(kuò)散法，無菌條件下將 D2、D3、D4 接種普通肉湯，37℃靜置培養(yǎng)24h，均勻涂抹于EMB 培養(yǎng)基表面，等距將牛津杯放置在平板上，將T-C-7 培養(yǎng)液用注射器緩慢注入牛津杯，置4℃冰箱待乳酸菌全部擴(kuò)散后，正放于37℃溫箱培養(yǎng)24h 后，測(cè)量記錄抑菌圈大小。

2.3 動(dòng)物試驗(yàn)

無菌條件下，將D2、D3、D4 接種于普通肉湯，37℃培養(yǎng)24h 備用。將適應(yīng)環(huán)境一周后的實(shí)驗(yàn)小白鼠隨機(jī)分為4 組（4 只/組）。3 組試驗(yàn)組分別腹部注射 D2、D3、D4 發(fā)酵液（0.5mL/只），1 組對(duì)照組用同樣方式注射等量生理鹽水。每天觀察記錄小白鼠的發(fā)病情況，具備典型病狀的死亡小白鼠進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

3 結(jié)果

3.1 臨床診斷結(jié)果

肺纖維素滲出（圖1），腹股溝淋巴結(jié)大理石樣變（圖2），腸淋巴結(jié)腫大（圖3），取豬肺病變部位進(jìn)行瑞氏染色油鏡觀察，為兩端鈍圓的直桿型菌（圖4）。

3.2 分離培養(yǎng)結(jié)果

圖1 肺纖維素滲出

圖2 腹股溝淋巴結(jié)大理石樣

圖3 腸淋巴結(jié)腫大

圖4 瑞氏染色結(jié)果

D2、D3、D4 菌落在5%兔血平板上中等大小不溶血，EMB 培養(yǎng)基上閃現(xiàn)金屬光澤（圖5），麥康凱培養(yǎng)基上呈粉紅色（圖6）；TSI 斜面培養(yǎng)基無黑色沉淀（圖7），經(jīng)過革蘭染色鏡檢，為G- 直桿菌（圖8）。

圖5EMB 菌落

圖6 麥康凱菌落

圖 7TSI 瓊脂

圖 8 染色結(jié)果（10×100）

3.3 生化鑒定結(jié)果

D2、D3、D4 生化結(jié)果見表1，分離菌靛基質(zhì)試驗(yàn)呈陽性；發(fā)酵木糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不能分解棉子糖和側(cè)金盞花醇，MR 陽性，VP 陰性。

表1 生化試驗(yàn)結(jié)果

3.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表2，對(duì)頭孢曲松高度敏感，對(duì)氨芐西林等完全耐藥。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 mm

3.5 乳酸菌抑菌試驗(yàn)結(jié)果

抑菌試驗(yàn)結(jié)果見表 3，乳酸菌對(duì) D2、D3、D4 有明顯的抑制效果

表3 乳酸菌體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果 mm

3.6 動(dòng)物致病性試驗(yàn)

試驗(yàn)組小白鼠一周之內(nèi)，出現(xiàn)拉稀的現(xiàn)象，體型逐漸消瘦。對(duì)照組的生理狀態(tài)正常。分離典型病變小鼠肝臟中的病原菌，染色鏡檢結(jié)果與原分離菌形態(tài)一致。

4 分析討論

4.1 菌種分析

根據(jù)D2、D3、D4 的培養(yǎng)特點(diǎn)、鏡檢結(jié)果和生化特性，通過比對(duì)《Bergey＇s Manual of Systemaic Bacteriology》[6]，確定 D2、D3、D4 為大腸埃希氏菌。

4.2 臨床癥狀和生化特性

本次病例臨床診斷結(jié)果與病理解剖結(jié)果與姚淑紅報(bào)道的大腸桿菌病臨床診斷一致[7]，D2、D3、D4生化特性與徐海生發(fā)表的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[8]。

4.3 體外抑菌試驗(yàn)分析

分析藥敏試驗(yàn)結(jié)果可知，分離菌對(duì)頭孢曲松高敏，但對(duì)氨芐西林等耐藥[9]，與孫曉莉，陳敏卿等發(fā)表的論文結(jié)果有部分不符[10～11]，可能是地區(qū)用藥習(xí)慣不同造成[12]。體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果證明乳酸菌對(duì)大腸桿菌有較強(qiáng)的抑制作用，與易力、陸克文等發(fā)表的論文結(jié)果一致[13～14]，乳酸菌可配合抗生素使用[15]。

近年來我國養(yǎng)豬業(yè)的規(guī)?；l(fā)展,白豬大腸桿菌的發(fā)生與流行有明顯增加的趨勢(shì)[16]。養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)該加強(qiáng)防范，科學(xué)管理，以防范為主，定時(shí)消毒、通風(fēng)，保證豬場(chǎng)的衛(wèi)生良好。治療可用肌肉注射頭孢類抗生素并飼料中添加的乳酸菌配合以增強(qiáng)療效。一旦發(fā)現(xiàn)病豬應(yīng)立即隔離，謹(jǐn)防傳染。