鵝源巴氏桿菌的分離鑒定及體外抑菌試驗(yàn)

周亞南，文東旭，區(qū)海蘊(yùn)，高蕊，劉雨星，李歡，黃靖文，朱芝秀

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西南昌330045)

鵝巴氏桿菌病又叫做鵝出血性敗血癥，是由于感染多殺性巴氏桿菌而引起的一種急性、接觸性、敗血性傳染病[1]。該病主要癥狀包括急性敗血癥以及全身各組織器官出血，肝組織腫脹凝固性壞死灶，伴發(fā)明顯的下痢等，是目前危害禽類養(yǎng)殖業(yè)的多種嚴(yán)重疫病中的主要疾病之一，給養(yǎng)禽業(yè)帶來了非常大的損失[2]。鵝可發(fā)生外源性感染和自體感染，外源性感染主要指的是通過采食污染巴氏桿菌的飲水或者飼料引起，自體感染則因動(dòng)物上呼吸道巴氏桿菌數(shù)量急劇增加所致[3]。

多殺性巴氏桿菌是多種動(dòng)物都易感共患的一種毒力較強(qiáng)的病原菌，在添加了哺乳動(dòng)物血清或血液的培養(yǎng)基上可以生長良好[4～5]。本試驗(yàn)通過對患病鵝心臟、肝臟進(jìn)行病原菌分離鑒定及體外抑菌等試驗(yàn)，給臨床上該病的診治提供相應(yīng)數(shù)據(jù)及有效的方法，進(jìn)一步促進(jìn)健康、科學(xué)養(yǎng)鵝的發(fā)展。

1 材料及方法

1.1 病料及試驗(yàn)動(dòng)物

病鵝：2 只，江西省南昌市某鵝場提供；試驗(yàn)小白鼠：25 只，18～22 g/只，購于南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室。

1.2 主要試劑及儀器

主要試劑有：5%兔血瓊脂培養(yǎng)基(自制)、瑞氏染色液(自制)、革蘭氏染色液(自制)、細(xì)菌微量生化鑒定管購自杭州微生物試劑有限公司；藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；雞唾液乳酸桿菌(J2-100-R2) 由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)教研室保存并提供；豬小腸乳酸桿菌(ZCR1-2)由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)教研室保存并提供。

主要儀器有：牛津杯購自上海申源科學(xué)儀器有限公司；COCI 光學(xué)顯微鏡購自重慶光學(xué)儀器廠；電子數(shù)顯游標(biāo)卡尺購自上海美耐特旗艦店；PCR 儀購自Bio-Rad 公司；電泳儀購自Bio-Rad 公司；凝膠成像系統(tǒng)購自Bio-Rad 公司。

1.3 臨床剖檢

將病死的鵝在新潔爾滅消毒液中浸泡表面消毒后，腹部朝上置于解剖盤中，將下腹部皮膚提起剪開一小口，沿開口處撕開皮膚，觀察胸腹部皮下與肌肉出血狀況，打開胸腹腔，觀察胸腹腔臟器病變狀況；剪開頸部皮膚，觀察頸部皮下與肌肉出血狀況，從肋骨處向上剪開頸部，觀察食管與氣管環(huán)出血狀況，從食管處往下依次剪開所有消化道，觀察其黏膜病變狀況同內(nèi)容物的性質(zhì)。取肝組織觸片瑞氏染色，干燥鏡檢。

1.4 細(xì)菌分離培養(yǎng)

無菌取患病鵝的肝臟組織與心臟組織接種于5%兔血瓊脂培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，無菌挑選單個(gè)優(yōu)勢菌落，進(jìn)行革蘭氏染色境檢，并接種于5%兔血瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行純化培養(yǎng)，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，純培養(yǎng)物置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 細(xì)菌生化鑒定

取分離菌純培養(yǎng)物,接種于微量生化鑒定管,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 ～48 h,觀察并對照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》判定反應(yīng)結(jié)果。

1.6 細(xì)菌16S rRNA 基因序列分析

參照文獻(xiàn)方法[6]，采用細(xì)菌16S rRNA 通用引物，27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，引物由湖南擎科生物技術(shù)有限公司合成，目的片段1 500 bp 左右。將分離菌進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，取2 μL 純培養(yǎng)菌液為模板，PCR 反應(yīng)體系 50 μL：ddH2O 37.5 μL、dNTP 4 μL、10X Buffer 5 μL、Taq 酶 0.5 μL、上下游引物各 0.5 μL 以及模板 2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性 1 min，55 ℃退火 1 min，72 ℃延伸2 min，共進(jìn)行 35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 8 min。取 5 μL PCR 產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析；剩余的PCR 產(chǎn)物送到湖南擎科生物技術(shù)有限公司測序，將測序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST 同源性比對。選取同源性較高菌株的16S rRNA 基因序列, 應(yīng)用Mega 7.0 軟件中的NJ 方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.7 分離菌藥敏試驗(yàn)

參照參考文獻(xiàn)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[7]，用滅菌棉簽沾取活化的分離菌培養(yǎng)液，均勻涂布于5%兔血平板，用無菌眼科鑷將藥片均勻放置其上，輕按紙片使其與瓊脂表完全接觸，置于37 ℃恒溫溫箱培養(yǎng)24 h，記錄各藥敏紙片的抑菌圈直徑大小。

1.8 體外抑制試驗(yàn)

按照參考文獻(xiàn)[7]，將分離菌血清肉湯培養(yǎng)物均勻涂布5%兔血培養(yǎng)基，培養(yǎng)基上等距離放置2 個(gè)牛津杯，牛津杯內(nèi)分別滴加J2-100-R2 菌液和ZCR1-2 菌液，每孔 280 μL 菌液，置于 4 ℃冰箱過夜后，置于37 ℃恒溫溫箱培養(yǎng)24 h，測量并記錄抑菌圈直徑大小。

1.9 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

將試驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為4 組試驗(yàn)組，1 組對照組(5 只/組)。試驗(yàn)組分別腹腔注射分離菌血清肉湯培養(yǎng)物(0.1 mL/只)，對照組注射等量的0.85%生理鹽水，做好標(biāo)記后放入鼠籠中，時(shí)刻觀察并記錄動(dòng)物的發(fā)病死亡情況，及時(shí)剖檢死亡的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，取肝臟處組織觸片瑞氏染色，分離培養(yǎng)細(xì)菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床剖檢

死亡白鵝頭頸呈反弓狀(圖1)；剖檢后可見病鵝多處皮下與肌肉出血；在其肝臟可見大量白色壞死灶(圖2)；剖開胸腔可見心冠脂肪有大量出血斑(圖 3)，心包大量積液(圖 4)，氣管環(huán)出血(圖 5)，肺部多處出血，喉頭處水腫，腸道彌漫性出血(圖6)，內(nèi)容物呈綠色稀狀，。取其肝臟組織觸片后瑞氏染色，油鏡下可見大量兩端濃染的橢圓形桿菌(圖 7)。

2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)

血清平板有大量單個(gè)光滑、濕潤，圓形、凸起的小菌落，在燈光下觀察泛藍(lán)色熒光(圖8)；血平板上生長成灰白色、濕潤、粘黏的1 mm 左右的圓形不溶血菌落(圖9)；麥康凱瓊脂平板上不能生長。分離菌分別命名為 BE-X-1、BE-X-2、BE-G-1、BE-G-2，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，均呈革蘭氏陰性小球桿狀(圖 10)。

2.3 細(xì)菌生化鑒定

生化鑒定結(jié)果見表1，分離菌分解甘露醇、葡萄糖產(chǎn)酸，但卻不能分解乳糖，與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》對照，可能是巴氏桿菌屬。

圖1 角弓反張

圖2 肝臟壞死點(diǎn)

圖3 心冠脂肪出血斑

圖4 心包積液

圖5 氣管環(huán)出血

圖6 腸道彌漫性出血

圖7 瑞氏染色(10 ×100)

圖8 血清平板上的菌落

圖9 血平板上的菌落

圖10 革蘭氏染色鏡檢(10×100)

表1 4 株分離菌生化結(jié)果

2.4 細(xì)菌16S rRNA 基因序列分析

分離菌的PCR 產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳結(jié)果，在1 400 bp 處有目的條帶出現(xiàn)(圖11)。將測序結(jié)果與 GenBank 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行 BLAST 比對(圖 12)，4 株分離菌與多殺性巴氏桿菌 (GenBank 登錄號：MN080875.1) 相似性分別達(dá)到99%以上。采用MEGA7.0.26 軟件中的Neighbor-Joining Tree 程序制作分離菌基因序列進(jìn)化樹 (圖13)，結(jié)果BE-X-1、BE-X-2、BE-G-1、BE-G-2 與多殺性巴氏桿菌為一支。

圖11 分離菌電泳結(jié)果

圖12 分離菌16S rDNA 核苷酸同源性

圖13 分離菌16S rDNA 序列進(jìn)化樹

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表2，分離菌的高敏藥物有阿莫西林等；對萬古霉素等藥物中等敏感；低敏藥物有乙酰螺旋霉素等。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 mm

2.6 乳酸菌體外抑制試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果見表3：雞唾液乳桿菌、豬小腸乳桿菌發(fā)酵液具有抑菌效果，其中雞唾液乳桿菌效果更佳。

表3 體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果 mm

2.7 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

12 ～24 h 內(nèi)攻毒小白鼠全部死亡，對照組小白鼠活潑健康。從試驗(yàn)死亡鼠中分離病原菌、染色鏡檢，發(fā)現(xiàn)所分離的細(xì)菌與原分離株形態(tài)一致，瑞氏染色呈兩端濃染，革蘭氏染色呈陰性短桿菌。

3 討論

根據(jù)臨床剖檢所見病理學(xué)特征、病原菌的分離培養(yǎng)特性以及生化特性等，初步診斷分離菌為巴氏桿菌。使用分子生物學(xué)法鑒定后，確定該分離菌為多殺性巴氏桿菌，該鵝所患疾病是由多殺性巴氏桿菌引起的鵝巴氏桿菌病。

將分離菌的測序結(jié)果通過NCBI 的Blast 系統(tǒng)進(jìn)行同源性分析, 是分子水平進(jìn)行細(xì)菌分類鑒定的一個(gè)十分有力的工具[6]，對于病原追本溯源具有重要意義。

分離菌生化試驗(yàn)結(jié)果，能分解甘露糖產(chǎn)酸，不能分解乳糖，與秦緒偉等人發(fā)表的論文結(jié)果相似[8]；靛基質(zhì)等陽性，與武春燕發(fā)表的論文結(jié)果有差異[9]；MR、VP 陰性，與張邑帆等發(fā)表的論文結(jié)果基本一致[10]。分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果，高敏藥物為阿莫西林等，中等敏感藥物為萬古霉素等，低敏藥物為乙酰螺旋霉素等，與之前劉燕發(fā)表的論文結(jié)果大致相似[7]，但沈國安等發(fā)表的論文的結(jié)果差異較大[11]，可能是菌株差異造成。目前，動(dòng)物用抗生素市場秩序仍舊不夠規(guī)范、飼料的生產(chǎn)和養(yǎng)殖環(huán)節(jié)抗生素用藥還不盡合理、安全使用抗生素的意識不夠強(qiáng)等諸多問題比較突出[12]，細(xì)菌耐藥性越來越強(qiáng)，所以臨床一定要掌握科學(xué)合理的用藥原則，能用低級抗生素治療的絕不用高級抗生素[13]。在對病鵝進(jìn)行治療時(shí)，首先對小群進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，并根據(jù)結(jié)果選擇使用最敏感的藥物[14]。乳桿菌是消化道中的優(yōu)勢菌群,且其能產(chǎn)強(qiáng)酸抑制病原菌生長，維持其長期的益生作用[15]，與分離菌體外抑菌結(jié)果一致，雞唾液乳桿菌、豬小腸乳桿菌可用于由巴氏桿菌所致疾病的防治，減少抗生素的使用。

鵝巴氏桿菌病的急性病例傳播迅速、發(fā)病急、死亡快,常造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，鵝巴氏桿菌病的預(yù)防十分重要，養(yǎng)殖人員、獸醫(yī)師堅(jiān)持定期檢疫，遵循早發(fā)現(xiàn)早治療的原則,以達(dá)到降低養(yǎng)殖損失的目的[16]。臨床上應(yīng)用效果較佳的疫苗用于預(yù)防該?。呵莼魜y弱毒疫苗G190E40 菌苗，肌注2 mL，有效免疫期為6 個(gè)月，同時(shí)可將乳酸菌等微生態(tài)制劑預(yù)防性投喂[17]。

4 結(jié)論

從江西省南昌市某鵝場提供的2 只病死鵝的肝臟和心臟中分離純化得到4 株多殺性巴氏桿菌，對頭孢曲松等藥物高敏，通過動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)可知其均具有致病性且致病性較強(qiáng)。建議立即將病鵝隔離，抗生素治療，在整個(gè)鵝群中進(jìn)行預(yù)防性投喂阿莫西林、頭孢類藥物。