一例豬鏈球菌病的診斷及其病原分離鑒定

胡換儀，林敏，劉小蘭，劉昌錦，聶佳婷，鄧舜洲

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西南昌330045）

豬鏈球菌病是由多種不同群的鏈球菌引起的不同臨診類(lèi)型傳染病的總稱。侵害各種年齡的豬只，通常以敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎和淋巴結(jié)炎為主要特征。一年四季均可發(fā)生，通常在夏秋炎熱季節(jié)出現(xiàn)大面積流行，發(fā)病多，死亡率高[1]。根據(jù)莢膜抗原的差異，豬鏈球菌有35 個(gè)血清型（1～34 及1/2）及相當(dāng)數(shù)量無(wú)法定型的菌株，其中1、2、7 和9 型是豬的常見(jiàn)致病菌，而2 型豬鏈球菌是可致病的豬源鏈球菌中最常見(jiàn)的一種，不僅能引起豬只急性敗血死亡，同時(shí)又能通過(guò)皮膚傷口感染人群甚至致死[2～3]。

2020 年12 月，某規(guī)模化豬場(chǎng)的保育仔豬出現(xiàn)零星發(fā)病死亡，臨床癥狀以體溫升高，不能站立，角弓反張和眼球震顫等神經(jīng)癥狀為主。通過(guò)對(duì)該豬場(chǎng)送檢病料進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，確診為豬鏈球菌感染。

1 材料與方法

1.1 病料

某豬場(chǎng)的一份表現(xiàn)為神經(jīng)癥狀的保育仔豬腦組織病料。

1.2 主要試劑及培養(yǎng)基

TSA 培養(yǎng)基和瓊脂粉購(gòu)自Solarbio 公司；馬丁肉湯液體培養(yǎng)基和瓊脂糖購(gòu)自金克隆（北京）生物技術(shù)有限公司；藥敏紙片、鏈球菌細(xì)菌生化編碼鑒定管、鏈球菌編碼冊(cè)、顯色指示劑液體石蠟和VP（甲液、乙液）等均購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司；DL2000 DNA Marker 、10× PCR buffer 和 rTaq酶購(gòu)自Takara 公司；dNTPs 購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；檢測(cè)引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3 分離鑒定

無(wú)菌條件下挑取病豬腦組織劃線接種于TSA血清平板（含10%新生牛血清）中，37℃恒溫培養(yǎng)24～48h。觀察并記錄菌落形態(tài)特征，挑取單個(gè)優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，可疑菌落再次劃線接種TSA 血清平板進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.4 生化鑒定

用接種環(huán)取純培養(yǎng)的菌落4～5 個(gè)接種到細(xì)菌微量生化反應(yīng)管內(nèi)并加入1 滴小牛血清，置滅菌平皿內(nèi)放入37℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，18～24h 觀察并記錄觀察結(jié)果。將試驗(yàn)結(jié)果分為4 組，每組對(duì)應(yīng)1 個(gè)數(shù)字，可得到1 個(gè)4 位數(shù)的編碼，在鏈球菌編碼冊(cè)檢索該編碼，得出鑒定結(jié)果。

1.5 PCR

根據(jù)Genbank 中豬鏈球菌16S rRNA 序列設(shè)計(jì)并合成 1 對(duì)檢測(cè)引物， 上游引物：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'， 下 游 引 物 ：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1500bp。參考文獻(xiàn)提取細(xì)菌DNA用于PCR 檢測(cè)[4]。PCR 反 應(yīng) 體 系 ：ddH2O 17μL ，10 × PCR buffer 2.5μL，dNTPs 2μL，上下游引物（20nmol/mL）各0.5 μL ，DNA 模板 2μL，rTaq 酶 0.5μL。PCR 反應(yīng)程序：95℃ 預(yù)變性 5min，95℃變性 30s，52℃退火30s，72℃ 延 伸 90s， 共 32 個(gè) 循 環(huán) ，72℃ 總 延 伸8min。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳后送南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。將測(cè)序結(jié)果與NCBI GenBank 中的參考序列進(jìn)行同源性比對(duì)并繪制進(jìn)化樹(shù)。

1.6 藥敏試驗(yàn)

挑取純培養(yǎng)的菌落4～5 個(gè)，接種于馬丁肉湯液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。用滅菌棉簽蘸取菌液少許，均勻涂于TSA 血清平板上，取藥敏紙片均勻貼于培養(yǎng)基表面，37℃培養(yǎng)24～48h，測(cè)量抑菌圈直徑并判斷細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性。

2 診斷結(jié)果

2.1 臨床癥狀和病理剖檢

發(fā)病豬為保育仔豬，出現(xiàn)后肢癱瘓、角弓反張和眼球震顫等神經(jīng)癥狀（圖1）。剖檢發(fā)現(xiàn)病豬腦膜充血明顯，呈樹(shù)枝狀（圖2）。結(jié)合臨床癥狀和剖檢病變懷疑為豬鏈球菌病。

圖1 發(fā)病保育仔豬

圖2 腦部剖檢病變

2.2 細(xì)菌形態(tài)特征

分離菌株在TSA 血清平板中長(zhǎng)出表面光滑，針尖大小的灰白色透明菌落；在5%綿羊血平板中呈現(xiàn)α 溶血。挑取純培養(yǎng)的菌落進(jìn)行革蘭氏染色，光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)革蘭氏染色陽(yáng)性，圓形或卵圓形菌體，成雙或成鏈狀排列（圖3）。

圖3 分離菌革蘭氏染色（1000 倍）

2.3 生化試驗(yàn)結(jié)果

分離菌株生化試驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌對(duì)精氨酸、DPP、七葉靈、TMZ、蕈糖和蔗糖等反應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性，對(duì) PYR、VP、PMG、MAG、山梨醇等反應(yīng)結(jié)果為陰性，溶血反應(yīng)為非乙型溶血。按照鏈球菌編碼冊(cè)得到一組四位數(shù)編碼1534，在編碼本中檢索該編碼，結(jié)果為好鑒定，豬鏈球菌2 認(rèn)定指數(shù)85。

2.4 測(cè)序結(jié)果分析

用16S rRNA 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，圖4 可見(jiàn)擴(kuò)增條帶大小1500bp，與預(yù)期一致。運(yùn)用DNAstar 軟件將上述PCR 產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與Genbank 中10 株國(guó)內(nèi)外的豬鏈球菌參考序列（主要是常見(jiàn)的致病血清型）進(jìn)行同源性比較并繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。由圖5 可知，分離菌株與 2 型豬鏈球菌 P1/7 株、SC84 株、BM407 株、A7 株、GZ1 株、98HAH33 株和 05ZYH33 株等親緣關(guān)系最近，位于一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的分支，同源性100%，與 1 型豬鏈球菌 ST1 株、7 型豬鏈球菌 D9 株和9 型豬鏈球菌D12 株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，同源性99.3%～99.7%。綜合染色鏡檢、生化鑒定和測(cè)序結(jié)果，確定該分離菌株為2 型豬鏈球菌，命名為JX-N2。

圖4 細(xì)菌16S rRNA 檢測(cè)結(jié)果

圖5 16S rRNA 基因核苷酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，該分離菌株對(duì)多種抗生素藥物敏感（表1）。其中，對(duì)青霉素、恩諾沙星、氨芐西林、氟苯尼考、頭孢噻肟、阿莫西林、氧氟沙星、諾氟沙星等高度敏感；對(duì)復(fù)方新諾明、多西環(huán)素、土霉素、頭孢曲松、丁安卡那等中度敏感，對(duì)磺胺異惡唑耐藥。

表1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 mm

3 討論

從某豬場(chǎng)送檢的腦組織病料中分離到了一株革蘭氏陽(yáng)性鏈狀球菌，其生理生化和培養(yǎng)特性與大多數(shù)豬鏈球菌的基本一致[5～8]，PCR 測(cè)序結(jié)果顯示該分離菌株與2 型豬鏈球菌親緣關(guān)系最近，結(jié)合流行病學(xué)和病理特征確定該豬場(chǎng)發(fā)病原因?yàn)樨i鏈球菌感染。

由于日常生產(chǎn)過(guò)程中抗生素的不合理使用和飼料中長(zhǎng)期添加抗生素，使豬場(chǎng)出現(xiàn)了大量多重耐藥菌株[9]。本試驗(yàn)分離的菌株僅對(duì)磺胺異惡唑完全耐藥，對(duì)土霉素輕度耐藥，對(duì)其他大多數(shù)抗生素藥物保持敏感，耐藥情況較輕微，臨床治療選用阿莫西林效果良好。在實(shí)際治療中，即使使用強(qiáng)效阿莫西林治療能取得理想效果，但是由于病菌的持續(xù)存在和強(qiáng)傳播性，單純的對(duì)病豬進(jìn)行強(qiáng)效阿莫西林治療并不能有效殺滅豬鏈球菌，而是要采取綜合性治療的措施，為了避免耐藥菌株的產(chǎn)生，需要選擇敏感藥物合理搭配使用[10]。

規(guī)?；i場(chǎng)在高度重視豬病毒性疫病防控的同時(shí)，一定要加強(qiáng)豬群中細(xì)菌性疫病的防控，確保豬只健康生長(zhǎng)，以提高養(yǎng)豬生產(chǎn)效率與經(jīng)濟(jì)效益。目前，我國(guó)豬群中單獨(dú)發(fā)生鏈球菌病較少見(jiàn)，疫情趨于平穩(wěn)，但在豬群中發(fā)生藍(lán)耳病、豬瘟、圓環(huán)病毒感染及偽狂犬病等疫病時(shí)，常見(jiàn)有鏈球菌和其它細(xì)菌繼發(fā)感染，使病情復(fù)雜化，發(fā)病率與死亡率增高[11]。為了減少豬鏈球菌病的發(fā)生，豬場(chǎng)應(yīng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，改善飼養(yǎng)環(huán)境，提高豬只免疫力，定時(shí)對(duì)豬群中細(xì)菌性疾病和病毒性疾病進(jìn)行監(jiān)測(cè)，防患于未然。