金蟬口服液抗呼吸道合胞病毒感染的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

★ 王雪 史敏（.蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院藥劑科 江蘇 蘇州 5003；.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院/蘇州市吳門醫(yī)派研究院中藥臨床藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室 江蘇 蘇州 5009）

呼吸道 合 胞病毒（Respiratory Syncytial Virus，RSV）是嬰幼兒急性下呼吸道感染最常見的病原體，主要病變累及毛細(xì)支氣管，亦累及氣管和肺泡而導(dǎo)致RSV肺炎。臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難、喘憋等。目前尚無抗RSV感染的特效藥物和疫苗，臨床上仍以對癥治療和支持治療為主?；純涸谑褂美晚f林、干擾素、支氣管擴(kuò)張劑、激素類藥物時(shí)，常出現(xiàn)發(fā)熱、過敏等藥物不良反應(yīng)［1］。金蟬口服液是由金銀花、黃芩、柴胡、蟬蛻提取物制成的中藥制劑，在體內(nèi)外對流感病毒具有良好的抑制作用［2］，同時(shí)對治療小兒呼吸道合胞病毒（RSV）肺炎的有效性與安全性也得到證實(shí)，但作用機(jī)制尚不明確［3］。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法分析金蟬口服液抗RSV感染的作用機(jī)制，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 金蟬口服液有效成分的篩選 借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析數(shù)據(jù)庫 TCMSP Version: 2.3（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），分別以“金銀花”“黃芩”“柴胡”“蟬蛻”為關(guān)鍵詞，共得到736種藥物成分信息。以生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥ 30% 和類藥性（Drug-likeness，DL）≥0.18以及Caco-2≥0為篩選閾值。其中蟬蛻為動物藥，將查詢得到8種化合物全部納入分析。

1.2 靶點(diǎn)蛋白的篩選 首先將1.1中篩選到的化合物 從 PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/） 數(shù)據(jù)庫中確定活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)式，得到其結(jié)構(gòu)的SMILES格式?；诮Y(jié)構(gòu)相似性原則，借助Swiss Target Prediction［4］（http://www.swisstargetprediction.ch/）和 STICH［5］（http://stitch.embl.de/）數(shù)據(jù)庫，獲得對應(yīng)化合物的潛在靶點(diǎn)。整理并刪去重復(fù)靶點(diǎn)，共篩選得到22種活性化合物對應(yīng)的102個靶點(diǎn)。通過檢索疾病數(shù)據(jù)庫GAD（https://geneticassociationdb.nih.gov/）和DisGeNET （http://www.disgenet.org/）數(shù)據(jù)庫，輸入“respiratory syncytial virus”“RSV”為關(guān)鍵詞收集 RSV感染相關(guān)的靶基因。為便于分析，均將上述所有靶基因轉(zhuǎn)化為Uniprot 數(shù)據(jù)庫識別碼格式。將活性化合物預(yù)測的靶基因與疾病靶基因合并取交集，篩選得到的共同的靶基因可能是金蟬口服液抗呼吸道合胞病毒感染的直接作用靶點(diǎn)。

1.3 靶蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 STRING11.0（https://string-db.org/）數(shù)據(jù)庫可以通過對蛋白質(zhì)之間直接或間接的相互作用進(jìn)行打分，打分值越高說明蛋白質(zhì)相互作用置信度越高。將1.2中收集到金蟬口服液直接作用抗呼吸道合胞病毒感染蛋白輸入到STRING11.0數(shù)據(jù)庫中，物種設(shè)為“Homo sapiens”，最低相互作用選擇 confidence ≥ 0.7（medium confidence），其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置。網(wǎng)絡(luò)連線的粗細(xì)代表相互作用力強(qiáng)弱。將互作關(guān)系數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.2.1中作進(jìn)一步分析，靶點(diǎn)的度值（Degree）表示相互作用的靶點(diǎn)個數(shù)。

1.4 基因本體（GO）分析和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 應(yīng)用Cytoscape3.2.1軟件中的ClueGo插件對收集到的共同靶基因進(jìn)行GO生物過程富集分析和KEGG通路富集分析（P≤0.05），用來進(jìn)一步探究金蟬口服液抗RSV感染的潛在核心通路的作用機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 金蟬口服液中抗RSV靶點(diǎn)的活性成分 將金蟬口服液中22種活性化合物對應(yīng)的102個靶基因與收集到的RSV靶基因映射后，篩選得到具有抗RSV作用的直接靶點(diǎn)的活性成分有11種。分析發(fā)現(xiàn)金蟬口服液中四味藥材都有貢獻(xiàn)，其中有2種成分來自金銀花：木犀草素（luteolin）和山奈酚（kaempferol），其中山奈酚為金銀花和柴胡共有成分。7 種成分來自黃芩：黃芩素（Baicalein）、5，2"-二羥基-7，8-二甲氧基黃酮（Panicolin）、黃芩新素Ⅱ千層紙素 A（oroxylin a）、刺槐素（acacetin）、鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯（bis［（2S）-2-ethylhexyl］benzene-1,2-dicarboxylate）、表 兒 茶 素（ent-Epicatechin）、漢黃芩素（Wogonin）；其余2種成分來自蟬蛻，見表1。

表1 金蟬口服液抗RSV有效活性成分

2.2 共同靶點(diǎn)的篩選及構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 將金蟬口服液預(yù)測靶基因與RSV感染相關(guān)疾病靶基因進(jìn)行映射，得到22種共同基因確定為金蟬口服液的抗RSV感染的直接作用靶點(diǎn)，見表2。同時(shí)，構(gòu)建活性化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果見圖1。

表2 金蟬口服液抗RSV直接作用的靶點(diǎn)

（續(xù)表）

注：菱形節(jié)點(diǎn)代表活性成分，圓形節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)蛋白。

2.3 靶蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析顯示金蟬口服液抗呼吸道合胞病毒直接作用的靶點(diǎn)有22個，共有114條相互作用連線。其中度值較大有degree=17的白介素6（IL6），degree=15的前列腺素G/H合成酶2（PTGS2）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1），degree=14的有血管內(nèi)皮生長因子A （VEGFA）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1-α/β（STAT1）、趨化因子配體2（CCL2）、白介素10（IL10），見圖2。

圖2 靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 基因本體（GO）分析和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 將金蟬口服液抗RSV直接作用的靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1，采用ClueGo插件進(jìn)行Go生物學(xué)過程分析（P≤0.05）得到互作網(wǎng)絡(luò)圖和餅狀圖，結(jié)果見圖3、圖4，其中不同的顏色代表不同的生物學(xué)過程。主要涉及單核細(xì)胞的分化、髓系白細(xì)胞分化的正調(diào)控、免疫分子介質(zhì)產(chǎn)生的調(diào)節(jié)以及內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)等，這體現(xiàn)了金蟬口服液可能通過調(diào)控多個復(fù)雜的生物過程產(chǎn)生抗RSV感染的作用。KEGG通路富集分析（P≤0.05）結(jié)果見圖5、圖6，其中不同的顏色代表不同的信號通路并且這些通路間存在著復(fù)雜的相互作用關(guān)系。金蟬口服液可能主要通過IL17信號通路以及Th1/Th2細(xì)胞分化信號通路來調(diào)節(jié)RSV感染過程中產(chǎn)生的免疫反應(yīng)。

圖3 ClueGO功能分析生物學(xué)過程分析互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 ClueGO功能分析生物學(xué)過程餅狀圖

圖5 ClueGO KEGG通路富集分析互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖6 ClueGO KEGG通路富集分析餅狀圖

3 討論

RSV屬副粘病毒科肺炎病毒屬的單股負(fù)鏈RNA病毒，其編碼G蛋白和F蛋白是病毒主要保護(hù)性抗原。RSV感染后，體內(nèi)先天性免疫和獲得性免疫以及神經(jīng)免疫機(jī)制激活，引起氣道高反應(yīng)性以及炎癥因子的釋放，導(dǎo)致嬰幼兒毛細(xì)支氣管炎、RSV肺炎，同時(shí)與哮喘發(fā)生有一定的關(guān)聯(lián)性。

金蟬口服液具有疏風(fēng)透表，解肌清熱的功效，臨床常用于流感病毒引起的呼吸道感染。本研究篩選出了復(fù)方中11種活性成分。馬雙成等人對金銀花中抗呼吸道合胞病毒感染的黃酮類成分進(jìn)行分離、結(jié)構(gòu)鑒定和體外抗病毒活性實(shí)驗(yàn)，分離得到2種黃酮類化合物為木犀草素（MOL000006）和木犀草苷［6］。黃芩中的漢黃芩素［7］（MOL000173）、 黃芩素［8］（MOL002714）、千層紙素a［9］（MOL002928）都具有抗呼吸道合胞病毒的作用，與文獻(xiàn)報(bào)道中相一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)黃芩中的刺槐素（MOL001689）、表兒茶素（MOL000073）等也具有抗RSV的靶點(diǎn)。柴胡注射液具有顯著的抑制RSV作用［10］。徐樹楠等人對蟬蛻進(jìn)行了藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其具有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘的作用，并推測平喘作用機(jī)制可能與抑制過敏介質(zhì)的釋放來發(fā)揮效應(yīng)，但其有效成分尚不清楚［11］，本研究篩選出MOL011681和MOL011682推測可能為蟬蛻抗RSV的核心成分。因此，金蟬口服液4味藥材在物質(zhì)的基礎(chǔ)上具有協(xié)同抗RSV病毒的作用。

本研究篩選出的金蟬口服液抗RSV的直接作用靶基因有22個。通過構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)，其中PTGS2對應(yīng)4種活性成分，MOL000073 和MOL000173來自黃芩， MOL011682和MOL011681來自蟬蛻； MOL001689對應(yīng)6個靶基因（IL5、IL13、VEGFA、SELE、STAT1、JUN）。通過構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)更直觀的發(fā)現(xiàn)存在單一靶點(diǎn)對應(yīng)多種成分，也存在單一成分對應(yīng)多個靶點(diǎn)，體現(xiàn)了金蟬口服液抗RSV感染的作用多成分多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。

在PPI網(wǎng)絡(luò)中，出現(xiàn)頻次較高的有IL6，PTGS2，MAPK1等，是整個網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)蛋白，說明金蟬口服液活性成分與其有較高的結(jié)合活性，可作為金蟬口服液抗RSV感染的潛在靶點(diǎn)。ClueGo生物功能分析顯示，金蟬口服液抗RSV感染的潛在靶點(diǎn)與單核細(xì)胞的分化、髓系白細(xì)胞分化的正調(diào)控、免疫分子介質(zhì)產(chǎn)生的調(diào)節(jié)以及內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)過程相關(guān)。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)與抗RSV有關(guān)的信號通路主要有IL17信號通路以及Th1/Th2細(xì)胞分化信號通路。IL17由輔助性T細(xì)胞（Th17）及先天性免疫細(xì)胞分泌，是一種促炎癥細(xì)胞因子，在多種炎性反應(yīng)及自身免疫性疾病病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。趙茜葉等人發(fā)現(xiàn)Th17及IL17可能參與RSV毛支急性期氣道炎癥反應(yīng)過程，并與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)［12］，因此金蟬口服液可能通過IL7信號通路參與RSV感染的炎癥反應(yīng)過程。CD4+T淋巴細(xì)胞根據(jù)其功能分為Th1和Th2細(xì)胞。Th1細(xì)胞主要分泌IL-2，IFN-γ，TNF等參與細(xì)胞免疫及遲發(fā)型超敏性炎癥的形成；Th2細(xì)胞主要分泌IL5，IL6，IL10等，主要功能為刺激B細(xì)胞增殖并產(chǎn)生抗體，與體液免疫相關(guān)。已有研究證實(shí)RSV感染與Th1/Th2亞群比例失衡有關(guān)，感染后Th1/Th2比值向Th2偏移［13］。因此金蟬口服液可能通過調(diào)節(jié)IL5，IL6，IL10等潛在靶點(diǎn)參與Th1/Th2細(xì)胞分化信號通路參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮抗RSV感染的作用。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對金蟬口服液抗RSV感染的物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制進(jìn)行探析。發(fā)現(xiàn)復(fù)方中4味藥材發(fā)揮協(xié)同抗RSV病毒的作用。除金銀花、黃芩、柴胡外，蟬蛻作為動物藥，篩選出2種抗RSV核心成分。本文從更深層次的分子生物學(xué)角度篩選出復(fù)方抗RSV的核心靶基因。靶基因參與多種生物學(xué)過程或通路大多與炎性細(xì)胞因子的分泌或者炎性介質(zhì)信號通路有關(guān)，因此，金蟬口服液可能通過抑制病毒感染過程中產(chǎn)生的促炎因子以及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)參與抗RSV感染的作用。中藥復(fù)方具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑治療疾病的特點(diǎn)，本研究為其他中藥復(fù)方抗RSV感染提供思路借鑒。然而，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)無論從數(shù)據(jù)挖掘以及靶點(diǎn)預(yù)測均存在諸多不足，篩選出的靶點(diǎn)及通路尚需進(jìn)一步計(jì)算分析及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。