編輯MSTN半胱氨酸節(jié)基元促進(jìn)兩廣小花豬肌肉生長(zhǎng)

彭定威，李瑞強(qiáng)，曾武，王敏，石翾，曾檢華，劉小紅，陳瑤生，何祖勇

研究報(bào)告

編輯MSTN半胱氨酸節(jié)基元促進(jìn)兩廣小花豬肌肉生長(zhǎng)

彭定威1，李瑞強(qiáng)1，曾武1，王敏1，石翾1，曾檢華2，劉小紅1，陳瑤生1，何祖勇1

1. 中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，有害生物控制與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006 2. 廣東壹號(hào)食品股份有限公司，廣州 510620

肌生長(zhǎng)抑制素(myostatin, MSTN)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (transforming growth factor-β, TGF-β)家族成員之一，是一種肌肉生長(zhǎng)抑制因子。解除MSTN的生長(zhǎng)抑制功能是提高畜禽肌肉產(chǎn)量的一種有效途徑。TGF-β的半胱氨酸節(jié)結(jié)構(gòu)基元(cystine knot motif) 能夠穩(wěn)定MSTN蛋白結(jié)構(gòu)，對(duì)MSTN生物學(xué)功能的發(fā)揮具有重要調(diào)控作用。本研究應(yīng)用CRISRP/Cas9基因編輯技術(shù)在兩廣小花豬腎細(xì)胞(Liang Guang small spotted pig kidney cells, LPKCs)中對(duì)基因外顯子3進(jìn)行編輯，破壞了其半胱氨酸節(jié)基元，以解除MSTN對(duì)靶基因的抑制功能。將流式分選獲得的混合陽性MSTN編輯LPKCs作為供體細(xì)胞進(jìn)行核移植和胚胎移植，獲得8頭基因編輯兩廣小花豬仔豬，其中2頭存活至10日齡，經(jīng)鑒定這2頭均為基因編輯雜合子，它們?cè)跇?gòu)成MSNT蛋白半胱氨酸節(jié)基元的兩個(gè)半胱氨殘基C106和C108編碼序列附近分別發(fā)生堿基的缺失與替換，導(dǎo)致移碼突變，使C106和C108突變?yōu)槠渌被??；蚓庉媰蓮V小花豬雜合子肩部和臀部肌肉較為發(fā)達(dá)。H&E切片分析顯示，基因編輯豬肌纖維橫截面積顯著減少，肌纖維數(shù)量顯著增多。Western Blot分析結(jié)果顯示，C106和C108缺失對(duì)MSTN蛋白表達(dá)無顯著性影響，但顯著促進(jìn)其靶基因和等成肌相關(guān)因子的表達(dá)。本研究獲得的基因編輯豬模型沒有造成MSTN表達(dá)完全缺失，可保留MSTN其他生物學(xué)功能，在促進(jìn)兩廣小花豬肌肉生長(zhǎng)的同時(shí)還消除了MSTN完全缺失可能對(duì)小花豬造成的潛在影響。

；CRISPR/Cas9；兩廣小花豬；基因編輯

肌肉生長(zhǎng)抑制素(myostatin, MSTN)，又稱生長(zhǎng)與分化因子8 (growth and differentiation factors 8, GDF8)，屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族(transforming growth factor-β, TGF-β)成員，是肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子[1]。敲除基因的小鼠()體重顯著增加，肌肉肥大，肌纖維數(shù)量顯著增多[2]。研究表明，在人()、綿羊()、牛()和狗()等多個(gè)物種中發(fā)生刪除或點(diǎn)突變，均可表現(xiàn)出骨骼肌顯著增加的表型[3~6]?；蛴?個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成[7]。豬()基因定位于15號(hào)染色體上，全長(zhǎng)6.7 kb，cDNA 序列長(zhǎng)度為1756 bp，表達(dá)的MSTN蛋白前體由375個(gè)氨基酸組成[8]。與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β超家族其他成員相似，MSTN首先由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核糖體合成出一條52 kDa的無活性前體肽，含有起分泌作用的信號(hào)肽、N端前導(dǎo)肽(26 kDa)和C端成熟肽(12.5 kDa)[9]。MSTN前體肽需經(jīng)過一系列水解加工后才能形成具有生物學(xué)活性的成熟蛋白：首先由信號(hào)肽酶切除由24個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽；然后由弗林轉(zhuǎn)化酶在N端前導(dǎo)肽和C端成熟肽之間的精氨酸–絲氨酸–精氨酸–精氨酸位點(diǎn)切割，產(chǎn)生N端前導(dǎo)肽和C端成熟肽，但兩者仍然以非共價(jià)鍵結(jié)合，形成無活性的潛伏型蛋白[10]；最后，無活性的潛伏型蛋白的N端前導(dǎo)肽在胞外經(jīng)金屬蛋白酶BMP1/Tolloid的剪切激活，釋放出有活性的C端成熟肽[11]。C端成熟肽通過二硫鍵形成二聚體，成熟肽中的9個(gè)半胱氨酸殘基形成TGFβ超家族特有的半胱氨酸節(jié)基元(cystine knot motif)，是MSTN與受體結(jié)合所必需的一種結(jié)構(gòu)，它能夠通過影響MSTN的穩(wěn)定性和共價(jià)二聚性來抑制其作為肌肉生長(zhǎng)分化負(fù)調(diào)控因子的作用[12]。皮埃蒙特牛(Piedmontese cattle)MSTN蛋白313位的半胱氨酸突變會(huì)產(chǎn)生雙肌表型，與野生型MSTN蛋白相比，C313Y突變的MSTN蛋白的共價(jià)二聚化顯著降低，同時(shí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性下降，對(duì)其他半胱氨突變體C313A和C374A的生化分析表明，完整的半胱氨酸結(jié)基序是MSTN穩(wěn)定性和共價(jià)二聚的主要決定因素[13]。

利用CRISPR/Cas9 (clustered regularly inter-spaced short palindromic repeats/CRISPR associated proteins 9)敲除可顯著提高中國地方豬種的產(chǎn)肉量[14]，但表達(dá)缺失使其喪失其他重要的生物學(xué)功能，可能會(huì)對(duì)基因敲除豬健康造成潛在的不利影響。因此，利用CRISPR/Cas9對(duì)中國地方豬種MSTN的半胱氨酸節(jié)基元進(jìn)行修飾是否能夠獲得類似皮埃蒙特?；駽313Y突變所產(chǎn)生的促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)的效果，值得進(jìn)行研究。兩廣小花豬屬于我國華南型地方豬種，具有肉質(zhì)鮮美、肉色鮮紅、肌內(nèi)脂肪含量高、系水力強(qiáng)和肌纖維直徑小等優(yōu)點(diǎn)，但也存在生長(zhǎng)速度緩慢和產(chǎn)肉量偏低的缺點(diǎn)[15]。因此，本研究利用CRISPR/Cas9對(duì)MSTN的半胱氨酸節(jié)基元進(jìn)行編輯，分析其對(duì)兩廣小花豬肌肉生長(zhǎng)的影響，以期為今后培育高產(chǎn)肉量的兩廣小花豬新品種提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

兩廣小花豬腎細(xì)胞系(Liang Guang Small Spotted pig kidney cells, LPKCs)由本實(shí)驗(yàn)室建立保存，CRISPR/Cas9表達(dá)質(zhì)粒pSpCas9(BB)-2A-GFP (pX458) (Plasmid #48138)購自美國Addgene組織。

1.2 靶向MSTN基因外顯子3的CRISPR/Cas9表達(dá)載體構(gòu)建與活性驗(yàn)證

靶向基因外顯子3的sgRNA3-3設(shè)計(jì)及其在兩廣小花豬胎兒成纖維細(xì)胞(porcine embryonic fibroblast, PEF)中的活性驗(yàn)證參考本團(tuán)隊(duì)前期的報(bào)道[14]。sgRNA3-3的靶位點(diǎn)具體序列見圖1。

1.3 兩廣小花豬腎細(xì)胞(LPKCs)培養(yǎng)

從液氮罐中取出需要復(fù)蘇的LPKCs，根據(jù)“緩凍速融”原則，將取出的細(xì)胞迅速置于預(yù)熱好的37℃水浴鍋，2~3 min后待凍存液完全融化，將凍存管內(nèi)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管內(nèi)，并加入1 mL的DMEM稀釋凍存液中的DMSO濃度，降低對(duì)復(fù)蘇后細(xì)胞的傷害。1000×離心去除上清液后加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，混勻后接種到培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，復(fù)蘇約24 h 后更換新鮮培養(yǎng)液。待細(xì)胞密度為80%~90%左右進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.4 質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染

準(zhǔn)備好待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pX458-gRNA3-3后，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的10代以內(nèi)的LPKCs，確定細(xì)胞數(shù)量(每100 μL體系需要細(xì)胞數(shù)目為100萬個(gè)左右)。電轉(zhuǎn)染參數(shù)設(shè)置為1400 V、10 ms、3次脈沖進(jìn)行電轉(zhuǎn)染。將電轉(zhuǎn)后的LPKCS接種至6孔板中，輕輕混勻，放入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后熒光顯微鏡下觀察拍照，48 h后待狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行流式分選。

圖1 MSTN基因結(jié)構(gòu)和gRNA序列

紅色DNA序列為設(shè)計(jì)的gRNA序列，黃色字體表示PAM位點(diǎn)；紫色氨基酸為參與形成半胱氨酸結(jié)節(jié)結(jié)構(gòu)基元的半胱氨酸殘基。

1.5 流式分選獲得增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enha-nced green fluorescent protein, EGFP)陽性細(xì)胞

準(zhǔn)備好待分選的轉(zhuǎn)染后的LPKCs和未轉(zhuǎn)染的陰性對(duì)照LPKCs。用陰性對(duì)照LPKCs對(duì)流式細(xì)胞儀進(jìn)行校準(zhǔn)，設(shè)置分選參數(shù)，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中EGFP陽性細(xì)胞分選出來，收集到預(yù)先加入培養(yǎng)基的6孔板中，放入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；24 h后換液，此后按細(xì)胞培養(yǎng)的方法進(jìn)行培養(yǎng)傳代。流式分選后，擴(kuò)大培養(yǎng)分選出的細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)至足夠量時(shí)，分離一部分提取基因組，進(jìn)行T7E1實(shí)驗(yàn)和TA克隆實(shí)驗(yàn)。

1.6 T7E1實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證打靶效率

設(shè)計(jì)引物-E3 (F: 5′-AGGGTAGGAAAG-TGATTCAGGATC-3′；R: 5′-GTAGCATACTCCAG-GCATGTAGC-3′)擴(kuò)增打靶位點(diǎn)，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增片段大小，通過膠回收得到純化的PCR產(chǎn)物，將其置于95℃變性10 min，然后按–5℃/1 min的降溫速度下降至25℃，完成程序性退火，接著在反應(yīng)體系中加入0.5 μL T7E1酶，置于37℃水浴30 min。酶切產(chǎn)物在10% PAGE膠中經(jīng)120 V恒壓電泳90 min。電泳結(jié)束后小心取出PAGE膠，經(jīng)EB溶液染色15 min后，使用蒸餾水漂洗3次，置于凝膠成像儀中拍照；Image J軟件掃描電泳條帶灰度值，根據(jù)公式

計(jì)算打靶效率，其中、為切割峰面積，為主峰面積[16]。

1.7 TA克隆驗(yàn)證編輯效率

將得到的純化PCR產(chǎn)物經(jīng)TA克隆連接到pMD-18T載體上。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5α中，LB搖菌1 h，涂板37℃培養(yǎng)過夜，挑取單克隆搖菌送測(cè)，測(cè)定20個(gè)單克隆。將測(cè)序結(jié)果與野生型豬基因組進(jìn)行比對(duì)，確定CRISPR/Cas9在基因中誘導(dǎo)產(chǎn)生的突變位置和突變類型。計(jì)算發(fā)生編輯的克隆占總測(cè)序克隆數(shù)的百分比，得出基因編輯效率。

1.8 MSTN基因編輯克隆豬的生產(chǎn)

從屠宰場(chǎng)采集母豬卵巢，用37℃的生理鹽水清洗，從卵巢中分離出卵母細(xì)胞進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)，然后選擇成熟的卵母細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞核移植。將編輯型的LPKCs放入含有透明質(zhì)酸酶和細(xì)胞松弛素的核移植操作液內(nèi)，卵母細(xì)胞則放入另一鄰近的含7.5 μmol/mL細(xì)胞松弛素B (cytochalasin B, CCB)的操作液滴內(nèi)，并用礦物油覆蓋操作液滴，以防止水分蒸發(fā)。在顯微注射儀下，吸除卵母細(xì)胞的細(xì)胞核及第一極體，并用注射針在去核的位置向卵母細(xì)胞的卵周隙注入狀態(tài)良好的單個(gè)LPKCs。然后用融合儀以1.2 kV/cm的單個(gè)直流電脈沖電擊30 ms，使卵質(zhì)與供體細(xì)胞融合并激活胚胎發(fā)育。融合后，轉(zhuǎn)移到PZM-5培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。待發(fā)育到2-細(xì)胞期后，挑選發(fā)育狀態(tài)較好的胚胎，進(jìn)行胚胎移植。選取經(jīng)產(chǎn)的待孕大白母豬，通過手術(shù)法將2-細(xì)胞期克隆胚胎植入輸卵管中，30 d后經(jīng)B超檢查胚胎發(fā)育情況，懷孕約114 d后接產(chǎn)。

1.9 新生仔豬基因型鑒定

剪取剛出生的基因編輯克隆豬耳樣組織并進(jìn)行標(biāo)記編號(hào)如3-1等。取5 mg耳樣組織按Omega組織DNA提取試劑盒(美國Omega Bio-tek公司)說明書操作步驟提取組織DNA。利用-E3引物對(duì)擴(kuò)增打靶位點(diǎn)序列，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，并通過TA克隆測(cè)序鑒定基因編輯克隆豬基因型。

1.10 基因編輯克隆豬背最長(zhǎng)肌H&E染色

選取10日齡基因編輯豬和野生型豬各一頭，屠宰后取背最長(zhǎng)肌組織，在4%多聚甲醛中4℃固定24 h，然后轉(zhuǎn)移至70%的酒精中，并放入4℃冰箱進(jìn)行長(zhǎng)期保存。利用自動(dòng)脫水機(jī)對(duì)固定的肌肉組織進(jìn)行脫水，并使用石蠟包埋機(jī)進(jìn)行包埋，包埋好的石蠟塊用切片機(jī)進(jìn)行切片。在進(jìn)行H&E染色前需進(jìn)行脫蠟復(fù)水處理，即先將切片置于烘箱中65℃烘烤30 min，隨后將切片分兩次浸泡于兩缸二甲苯中脫蠟，每次10 min。脫蠟完成后進(jìn)行梯度濃度乙醇復(fù)水，復(fù)水完成后進(jìn)行H&E染色。染色結(jié)束后進(jìn)行脫水處理并晾干，最后采用中性樹膠進(jìn)行封片，置于顯微鏡下觀察拍照。

1.11 Western Blot

選取10日齡基因編輯豬和野生型豬各一頭，取背最長(zhǎng)肌組織樣品提取總蛋白，使用12%的PAGE膠進(jìn)行電泳分離蛋白，按照80 V×30 min和120 V×60 min 的程序進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，按25 V恒壓條件轉(zhuǎn)膜35 min。轉(zhuǎn)膜完成后，迅速將PVDF膜取出浸入3% BSA溶液中，放在搖床上室溫封閉1 h，后將膜放入含有一抗的溶液中，置于搖床上，以60 r/min，4℃孵育過夜；次日將膜取出放入TBST中，置于搖床上，室溫下，以120轉(zhuǎn)/min漂洗4次，每次5 min；然后將膜放入含有二抗的溶液中，置于搖床上，室溫下，以60 r/min孵育1 h；孵育完成后，將膜放入TBST中，置于搖床上，室溫下，以120 r/min漂洗4次，每次5 min。按照1∶1的比例配制ECL曝光液，將膜平鋪在曝光板上，加上曝光液曝光，于BLT GelView 6000 Pro曝光成像儀中進(jìn)行曝光拍照。本研究中使用的一抗包括 anti-MSTN (abcam)、anti-Myf5 (abcam)、anti-MyoD (abcam)、anti-Myogenin (abcam)和anti-GAPDH (abcam)，稀釋比皆為1∶500；二抗包括anti-Mouse (abcam)和anti-Rabbit (abcam)，稀釋比皆為1∶5000。

1.12 統(tǒng)計(jì)分析

定量實(shí)驗(yàn)包括至少3個(gè)獨(dú)立重復(fù)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。數(shù)據(jù)分析采用檢驗(yàn)或單因素方差分析，再進(jìn)行鄧肯檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 LPKCs中高效編輯MSTN基因

分選得到的EGFP陽性LPKCs繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，取一部分細(xì)胞提取基因組DNA，利用引物對(duì)-E3進(jìn)行PCR擴(kuò)增靶位點(diǎn)序列，然后通過T7E1酶切實(shí)驗(yàn)檢測(cè)pX458-sgRNA3-3的打靶效率。結(jié)果顯示，sgRNA3-3打靶效率為17.2% (圖2)。TA克隆測(cè)序結(jié)果顯示，sgRNA3-3的打靶效率為33.3% (圖3)。

2.2 高效獲得MSTN基因編輯兩廣小花豬

將981枚克隆胚胎移植到5頭代孕母豬體內(nèi)，最終有4頭母豬懷孕到終期，分娩出13頭克隆豬，其中12頭活仔，編輯型兩廣小花豬的初生重為0.885±0.3 kg，野生型兩廣小花豬初生重為0.725± 0.2 kg，兩者體重?zé)o差異顯著性(= 0.3303)，24 h后剩余10頭健仔(表3)。出生的12頭活仔，經(jīng)基因型鑒定，有8頭是編輯個(gè)體，編輯效率達(dá)66.7% (圖4)。

圖2 T7E1酶切鑒定結(jié)果

M：DNA Marker；箭頭代表T7E1酶切后預(yù)期產(chǎn)物所在位置；Indel(%)表示隨機(jī)插入或缺失的比例。

圖3 sgRNA打靶效率測(cè)序結(jié)果

MSTN gRNA3-3誘導(dǎo)產(chǎn)生的隨機(jī)插入與缺失的效率達(dá)33.3%(6/20)。紅色字母表示sgRNA序列；黃色字母表示PAM序列；虛線代表缺失堿基；WT：野生型序列；+：堿基插入，–：堿基缺失。

出生后第10 d，只剩下3頭存活仔豬，處死兩頭偏弱的個(gè)體進(jìn)行采樣。最后一頭編輯豬3周后死亡。與野生型相比，編輯豬的肩部和臀部、背部肌肉較為發(fā)達(dá)(圖5)?；蛐丸b定結(jié)果顯示，3-1為野生型；3-2的一個(gè)等位基因發(fā)生2 bp缺失(c.1113_ 1114del)，導(dǎo)致翻譯產(chǎn)物中含有半胱結(jié)基序的C-G-C-S-Ter突變?yōu)閃-V-L-M，并產(chǎn)生一段含有45個(gè)氨基酸的延長(zhǎng)序列；3-3則為一個(gè)等位基因發(fā)生1 bp插入以及一個(gè)G堿基替換為A堿基，結(jié)果導(dǎo)致翻譯產(chǎn)物中含有半胱結(jié)基序的C-G-C-S-Ter突變?yōu)長(zhǎng)-L-W-V-L，并產(chǎn)生一段含有46個(gè)氨基酸的延長(zhǎng)序列，兩者皆導(dǎo)致MSTN成熟肽C端的半胱氨酸結(jié)基序的破壞(圖6)。

表3 SCNT產(chǎn)生的MSTN編輯豬

*僅展示出生第1 d健康豬的數(shù)據(jù)。

圖4 MSTN基因編輯兩廣小花豬基因型鑒定

紅色字母表示sgRNA序列；黃色字母表示PAM序列；虛線代表缺失的堿基；WT：野生型序列；3-1至3-12代表同一窩的12個(gè)不同的個(gè)體，WT序列下方的數(shù)字表示每一個(gè)體所測(cè)的TA克隆數(shù)。

圖5 MSTN基因編輯兩廣小花豬表型

黃色箭頭表示基因編輯型豬比野生型豬肌肉發(fā)達(dá)的部位；WT：野生型；3-3為基因編輯豬；10 day表示日齡。

2.2 MSTN基因編輯豬雜合子的肌纖維數(shù)量顯著增多

對(duì)10日齡基因外顯子3編輯型兩廣小花豬雜合子3-3及其野生型小花豬3-1的肩胛部位的三角肌進(jìn)行H&E切片染色，肌纖維數(shù)量通過隨機(jī)選取3個(gè)單位面積(mm2)的橫截面切片視角，采用軟件Photoshop進(jìn)行肌纖維計(jì)數(shù)，并使用顯微鏡相機(jī)自帶軟件進(jìn)行肌纖維面積統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示，基因編輯兩廣小花豬雜合子肌纖維數(shù)量顯著大于野生型豬，而肌纖維面積顯著小于野生型豬 (圖7)，表明破壞MSTN蛋白C端的半胱氨酸結(jié)基序可顯著促進(jìn)肌纖維增生。

2.3 MSTN基因編輯豬雜合子的成肌調(diào)控因子表達(dá)顯著上調(diào)

取10日齡野生型(3-1)和編輯雜合子(3-2)的背最長(zhǎng)肌肉組織，通過Western Blot檢測(cè)MSTN及關(guān)鍵成肌調(diào)控因子的表達(dá)水平。Western Blot結(jié)果則采用軟件Image J掃描3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果中條帶的灰度值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，編輯豬的MSNT表達(dá)無顯著性變化，但是其關(guān)鍵成肌調(diào)控因子Myf5、MyoD和Myogenin的表達(dá)水平均顯著上調(diào)(圖8)，表明破壞MSTN蛋白C端的半胱氨酸結(jié)基不影響MSTN蛋白表達(dá)，但可顯著提高成肌分化潛能。

圖6 MSTN基因編輯豬基因型鑒定結(jié)果

紅色字母表示sgRNA序列；黃色字母表示PAM序列；虛線代表缺失的堿基；個(gè)體編號(hào)后的括號(hào)內(nèi)顯示的是基因型，個(gè)體編號(hào)下方括號(hào)內(nèi)顯示推測(cè)的翻譯后蛋白序列型；WT：野生型序列，WT序列下方的數(shù)字表示每一個(gè)體所測(cè)的TA克隆數(shù)。

圖7 10日齡外顯子3編輯豬肌纖維H&E染色結(jié)果

A：肌肉橫截面切片HE染色圖。3-1、3-2表示野生型及克隆豬的編號(hào)；標(biāo)尺=100 μm。B：肌纖維數(shù)量和肌纖維面積統(tǒng)計(jì)柱狀圖；**：<0.01，****：<0.0001；WT：野生型兩廣小花豬(3-1)；Edited：編輯型兩廣小花豬(3-3)。

圖8 Western Blot檢測(cè)MSTN及關(guān)鍵成肌調(diào)控因子的蛋白表達(dá)量

A：Western Blot檢測(cè)結(jié)果。WT為野生型，+/–為雜合子基因編輯豬，左側(cè)為條帶對(duì)應(yīng)的蛋白名稱。B：蛋白條帶灰度掃描統(tǒng)計(jì)結(jié)果；ns：>0.05，**：<0.01，***：<0.001。

3 討論

本研究利用CRISPR/Cas9對(duì)兩廣小花豬MSTN蛋白C端的半胱氨酸節(jié)基元進(jìn)行編輯，以EGFP陽性的混合細(xì)胞群作供體進(jìn)行核移植，獲得的12頭活仔中有8頭是基因編輯個(gè)體，編輯效率達(dá)66.7%，與本團(tuán)隊(duì)前期利用類似方法獲得基因編輯豬效率相當(dāng)[17]。本研究中基因編輯兩廣小花豬在出生后存活率較低，僅有3頭存活到10日齡以上，這可能跟代孕豬場(chǎng)是專業(yè)飼養(yǎng)瘦肉型商品豬，飼養(yǎng)員對(duì)兩廣小花豬新生仔豬的護(hù)理缺乏經(jīng)驗(yàn)，以及該品種易患喘氣綜合征等因素相關(guān)，這與本團(tuán)隊(duì)前期構(gòu)建的基因編輯兩廣小花豬模型出現(xiàn)的高死亡率情況類似[17]。但是MSTN蛋白C端的半胱氨酸節(jié)基元的編輯是否也對(duì)兩廣小花豬的死亡造成影響，有待后續(xù)深入研究。

對(duì)一頭存活到10日齡的基因外顯子3編輯雜合子的肌肉組織進(jìn)行切片，分析結(jié)果表明破壞MSTN蛋白C端的半胱酸節(jié)基元可顯著促進(jìn)肌纖維增生，達(dá)到與基因雙敲除類似的效果[18]。通過Western Blot對(duì)MSTN及成肌調(diào)節(jié)因子的分子表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果表明破壞MSTN蛋白C端的半胱酸節(jié)基元不影響MSTN蛋白的表達(dá)，但可顯著促進(jìn)關(guān)鍵成肌調(diào)節(jié)因子的蛋白表達(dá)，這與皮埃蒙特牛中基因半胱氨酸節(jié)基元中發(fā)生的C313Y突變不影響MSTN蛋白表達(dá)，但卻能顯著增強(qiáng)其肌肉發(fā)育相似[19]，表明改變MSTN半胱氨酸節(jié)基元可顯著促進(jìn)動(dòng)物肌肉生長(zhǎng)發(fā)育。本研究的基因編輯并沒有完全敲除，而只改變了MSTN的半胱氨酸節(jié)基元，顯著促進(jìn)了肌纖維增生，同時(shí)有可能保留了MSTN的其他重要生物學(xué)功能，有利于維持家豬的生理健康，為培育高產(chǎn)肉量的兩廣小花豬提供研究基礎(chǔ)。

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Editing the cystine knot motif of MSTN enhances muscle development of Liang Guang Small Spotted pigs

Dingwei Peng1, Ruiqiang Li1, Wu Zeng1, Min Wang1, Xuan Shi1, Jianhua Zeng2, Xiaohong Liu1, Yaoshen Chen1, Zuyong He1

Myostatin (MSTN) is a member of the transforming growth factor-β (TGF-β) family, and functions as an inhibitor of muscle growth. Disrupting the inhibitory effect of MSTN on growth can provide an effective way to increase the muscle yield of livestock and poultry. The cysteine knot motif of TGF-β can stabilize the structure of MSTN protein and plays an important regulatory role in the biological function of MSTN. Accordingly, in this study, we used the CRISRP/Cas9 to edit the exon 3 of MSTN in the kidney cells of Liang Guang Small Spotted pig (LPKCs), in order to disrupt the cysteine knot motif of MSTN and remove the inhibitory effect of MSTN on its target genes.-edited LPKCs were obtained through fluorescence-activated cell sorting (FACS) and used as donor cells for somatic cell nuclear transfer (SCNT) to generate cloned embryos, which were then transferred to surrogate sows to finally obtain eight-edited Liang Guang Small Spotted piglets. Among them, two survived to 10 days old. Genotyping revealed that these two piglets were gene edited heterozygotes with base deletion and substitution occurred within the coding sequence of C106 and C108 at the cystine knot motif of MSTN. These changes resulted in frameshift mutations, and conversion of C106 and C108 to other amino acids. More developments of muscles were observed at the shoulders and hips of the heterozygotes of-edited Liang Guang Small Spotted pigs. H&E analysis showed that the cross-sectional area (CSA) of myofiber in-edited pigs was significantly decreased, and the number of myofiber were significantly increased. Western blot analysis showed that the disruption of C106 and C108 did not affect the expression of MSTN protein, but significantly up-regulated the expression of its target genes such as,,and other myogenic regulatory factors. In summary, the gene-edited pig model obtained in this study did not cause complete loss of MSTN expression, and could retain other biological functions of MSTN, thereby promoting muscle growth while minimizing the potential adverse effects on complete loss of MSTN in the Liang Guang Small Spotted pigs.

; CRISPR/Cas9; Liang Guang Small Spotted pig; gene editing

2020-07-15;

2020-12-24

國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)(編號(hào)：2016ZX08006003-006)和廣東省重點(diǎn)領(lǐng)域研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2018B020203003)資助[Supported by the National Transgenic Major Program (No. 2016ZX08006003-006) and the Key R&D Program of Guangdong Province (No. 2018B020203003)]

彭定威，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。E-mail: 840450611@qq.com 李瑞強(qiáng)，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。E-mail: 1584896796@qq.com曾武，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。E-mail: 1045044813@qq.com彭定威、李瑞強(qiáng)和曾武為并列第一作者。

何祖勇，博士，副教授，研究方向：動(dòng)物遺傳與育種。E-mail: zuyonghe@foxmail.com

10.16288/j.yczz.20-222

2021/2/5 14:47:17

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.r.20210203.1205.002.html

(責(zé)任編委: 趙要風(fēng))