MC1-R在人病理性瘢痕組織中的表達(dá)及臨床意義＊

劉毅 蔡瓊珠 吳小雅 楊習(xí)端 陳超明 黃華森

病理性瘢痕又稱異常瘢痕，包括增生性瘢痕（HS）和瘢痕疙瘩（K），其形成機(jī)制尚未明確。作為整形外科的世界性難題，病理性瘢痕的形成一直困擾著整形外科醫(yī)生，而臨床上也未有行之有效的治療措施[1-2]。因此，研究病理性瘢痕形成的機(jī)制，為治療尋找新干預(yù)靶點(diǎn)，是該領(lǐng)域需要解決的關(guān)鍵問題。在20世紀(jì)七八十年代，Ouyang等[3]、Madu等[4]就注意到有色人種在垂體功能亢進(jìn)、青春期及妊娠期等皮膚色素易沉著時(shí)期較易形成病理性瘢痕，而白化病患者則完全不形成病理性瘢痕。因此，多年來人們推測病理性瘢痕的形成與皮膚色素沉著有著某種內(nèi)在聯(lián)系，但對此并未進(jìn)行深入的研究。皮膚顏色的差異是由優(yōu)黑素和褐黑素的比例所決定，而優(yōu)黑素與褐黑素的比例是由黑色素皮質(zhì)素受體1（melanocortin receptor l，MC1-R）所調(diào)控[5]。因此，MC1-R表達(dá)是此類研究的一個(gè)重要方向。本研究以病理性瘢痕患者為研究對象，通過免疫組化檢測病理性瘢痕和正常皮膚內(nèi)MC1-R表達(dá)水平和定位情況，以期明確MC1-R與病理性瘢痕形成之間的關(guān)系，具體如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018年9月-2019年10月于湛江中心人民醫(yī)院整形外科手術(shù)標(biāo)本，包括增生性瘢痕15例，瘢痕疙瘩10例，以及另取來自術(shù)中棄用的正常皮膚樣本20例。正常皮膚樣本取自體表多個(gè)部位的術(shù)中棄用皮膚組織，取材部位包括顏面部、腰腹部；增生性瘢痕樣本所取瘢痕形狀呈不規(guī)則，高于正常皮膚且色紅質(zhì)硬，局部伴瘙癢或痛覺過敏，取材部位包括四肢、面部、胸腹部。瘢痕疙瘩樣本所取瘢痕疙瘩呈蟹足狀、質(zhì)堅(jiān)硬，取材部位包括面部、腹部。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在慢性皮膚病史、周圍神經(jīng)病變，術(shù)前接受其他治療。三組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性，見表1。所有樣本均來自醫(yī)院整形外科手術(shù)患者，組織樣本采集前均告知患者及其家屬試驗(yàn)計(jì)劃和樣本去向，并簽署知情同意書。該研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意。

表1 樣本來源信息

1.2 方法

1.2.1 材料處理 樣本于術(shù)中取下后，立即置入4% 多聚甲醛固定液中過夜，第2天進(jìn)行常規(guī)梯度脫水、浸蠟和石蠟包埋。組織石蠟塊進(jìn)行切片，以備免疫組化染色用途。

1.2.2 免疫組化染色與結(jié)果判定 將石蠟切片進(jìn)行脫蠟和水化處理，進(jìn)行酸性抗原修復(fù)10 min后，再次將切片于PBS中浸泡3次5 min/次；隨后，經(jīng)阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性10 min，將切片于PBS中浸泡3次，5 min/次。室溫下，采用10% BSA封閉液進(jìn)行封閉非特異性抗原2 h，加抗MC1-R抗體（1∶100稀釋）于4 ℃濕盒過夜；次日滴加1∶200稀釋生物素化二抗，37 ℃恒溫孵育20 min。滴加1∶200稀釋鏈霉菌素抗生物素過氧化物酶復(fù)合物即三抗，37 ℃恒溫孵育20 min，各步驟之間均用緩沖液洗3次。采用AEC顯色后蘇木精復(fù)染。最后進(jìn)行中性樹脂封片、鏡下觀察和拍照，每個(gè)組織切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野的MC1-R陽性細(xì)胞百分比。MC1-R陽性信號呈黃色或棕黃色顆粒，MC1-R陽性細(xì)胞百分比=（MC1-R陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100% 。所有切片均在同一臺顯微鏡下由同一研究人員拍攝。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料以率（% ）表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果MC1-R定位情況

三組樣本中進(jìn)行MC1-R免疫組化檢測，評估MC1-R蛋白在正常皮膚組織、增生性瘢痕組織和瘢痕疙瘩組織中的表達(dá)水平和定位。MC1-R陽性信號呈黃色或棕黃色顆粒，其表達(dá)于表皮及真皮層。在正常皮膚中，MC1-R陽性表達(dá)多位于表皮基底層和皮膚附屬器周圍；在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中，MC1-R陽性表達(dá)見于表皮的基底層和真皮層中成纖維細(xì)胞聚集處。

2.2 三組免疫組化結(jié)果MC1-R定量比較

正常皮膚組MC1-R陽性表達(dá)百分比為（53±10）% ，高于增生性瘢痕組的（45±7）% 和瘢痕疙瘩組的（32±9）% ，且增生性瘢痕組MC1-R陽性表達(dá)百分比高于瘢痕疙瘩組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.007，P＜0.001）。

3 討論

病理性瘢痕較易發(fā)生于有色人種和皮膚色澤較深的人群，發(fā)生率與正常人之比為2∶1～19∶1[6]。當(dāng)垂體功能亢進(jìn)，青春期、妊娠期等皮膚色素沉著明顯時(shí)也較易發(fā)生。因此，多年來人們推測病理性瘢痕的形成與皮膚色素沉著有著某種內(nèi)在聯(lián)系，但對此并未進(jìn)行深入的研究。皮膚顏色的差異是由優(yōu)黑素和褐黑素的比例所決定，而優(yōu)黑素與褐黑素的比例是由MC1-R所調(diào)控。因此MC1-R表達(dá)數(shù)量的不同，導(dǎo)致了皮膚色澤的不同。MC1-R廣泛分布于皮膚細(xì)胞上[7]，在真皮成纖維細(xì)胞、微血管內(nèi)皮細(xì)胞亦表現(xiàn)出較高的MC1-R抗原性[8-9]。它能介導(dǎo)所有由褪黑素（α、β、γ-MSH和腎上腺皮質(zhì)激素）誘導(dǎo)皮膚細(xì)胞所產(chǎn)生的免疫、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)沉積等多種效應(yīng)[10]。而病理性瘢痕的形成與免疫反應(yīng)，細(xì)胞外基質(zhì)及真皮內(nèi)微血管關(guān)系密切[11-12]，因此，采用免疫組織化學(xué)方法檢測病理性瘢痕組織，普通瘢痕組織及正常皮膚組織中MC1-R含量，并比較其差異，探討病理性瘢痕形成與皮膚顏色變化之間的關(guān)系，從而從另一角度推測出病理性瘢痕形成的機(jī)制，目前國內(nèi)外學(xué)者的研究主要集中在膠原代謝，細(xì)胞因子等領(lǐng)域[13-14]，對MC1-R在病理性瘢痕組織中的表達(dá)等研究報(bào)道尚少。

因此，本研究設(shè)計(jì)之初推測病理性瘢痕的形成與黑色素細(xì)胞的活動，尤其是調(diào)節(jié)色素沉著的MC1-R，存在著某種內(nèi)在的聯(lián)系。然而，采用免疫組化法檢測病理性瘢痕（包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩）和正常皮膚組織內(nèi)MC1-R含量的變化，對其進(jìn)行比較和分析，發(fā)現(xiàn)皮膚組織內(nèi)表皮和真皮層成纖維細(xì)胞內(nèi)MC1-R表達(dá)水平在瘢痕組表達(dá)明顯下降，MC1-R不足的成纖維細(xì)胞可能更有助于病理性瘢痕的形成。此結(jié)果趨勢與膚色色素沉著的推測不相符，而與Luo等[15]研究結(jié)果一致。Luo等對成纖維細(xì)胞和人瘢痕疙瘩組織內(nèi)的MC1-R表達(dá)進(jìn)行評估，并驗(yàn)證了激活的a-黑素細(xì)胞刺激激素的（aMSH）/MC1R信號通路對皮膚炎癥、纖維化反應(yīng)和色素沉著存在拮抗作用。

本研究基于免疫組化技術(shù)，通過檢測人病理性瘢痕、正常皮膚組織中MC1-R含量的變化，對其進(jìn)行比較和分析，從而揭示病理性瘢痕形成和MC1-R表達(dá)變化之間的內(nèi)在關(guān)系，為病理性瘢痕的診治提供新靶標(biāo)。然而，關(guān)于不同人種膚色之間病理性瘢痕形成與MC1-R表達(dá)的聯(lián)系尚未研究，仍需在未來的研究中進(jìn)一步探明。