下食管括約肌球囊擴(kuò)張建立咽喉反流性疾病兔模型△

孫喆喆 王剛，2# 黃鑫 趙曉波 王磊 韓浩倫 李保衛(wèi) 劉紅丹 李連勇 吳瑋，2

咽喉反流性疾病(laryngophyngeal reflux disease,LPRD)是指胃內(nèi)容物反流至食管上括約肌以上部位，引起一系列癥狀和體征的總稱[1]。LPRD發(fā)病率高，與多種耳鼻咽喉科疾病相關(guān)[2]，是近年來的研究熱點(diǎn)。國外研究顯示LPRD的發(fā)病與抗反流屏障、食管廓清能力及靶器官的敏感度等多種因素有關(guān)[3]，但目前該病的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，建立安全有效的動(dòng)物模型對(duì)該病的發(fā)病機(jī)制及治療方法的研究顯得尤為必要。目前內(nèi)源性動(dòng)物L(fēng)PRD模型的造模機(jī)制主要是通過破壞抗反流屏障，尤其是下食管括約肌(lower esophageal sphincter, LES)的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致胃內(nèi)容物反流至上氣道，從而引發(fā)LPRD[4～6]。本研究通過下食管括約肌球囊擴(kuò)張法建立新西蘭兔的LPRD模型，并通過檢測擴(kuò)張前后LES壓力、咽喉及食管pH值變化、喉鏡下反流體征及組織病理學(xué)改變對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，旨在為進(jìn)一步研究LPRD提供一種安全、有效、微創(chuàng)的動(dòng)物模型，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 選擇5月齡雌性新西蘭白兔18只(購自科宇動(dòng)物養(yǎng)殖中心，北京)，體重2.5～3.0千克，通過體重排序后，按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組10只和對(duì)照組8只，所有動(dòng)物飼養(yǎng)于自動(dòng)控制明暗環(huán)境中，恒溫恒濕，每日喂食兩次，自由飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后開始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組行下食管括約肌擴(kuò)張術(shù)，對(duì)照組進(jìn)行假擴(kuò)張，單純置入球囊，不進(jìn)行注水?dāng)U張。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理協(xié)議遵守嚴(yán)格的批準(zhǔn)程序且與國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用指南一致，本研究獲得戰(zhàn)略支援部隊(duì)特色醫(yī)學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2下食管括約肌擴(kuò)張術(shù)建立LPRD兔模型 動(dòng)物術(shù)前禁食24小時(shí)，禁水6小時(shí)，10%水合氯醛(3 mg/kg)腹腔麻醉后固定于操作臺(tái)，經(jīng)口置入Hercules擴(kuò)張球囊(美國Wilson-Cook Medical公司，最大擴(kuò)張直徑1.5 cm，有效擴(kuò)張長度5.5 cm)。通過食管測壓確定LES距門齒的距離，氣囊沿導(dǎo)絲插入食管內(nèi)，使氣囊中心位于測定位置，緩慢向球囊內(nèi)注水，注水過程不少于30秒，最終壓力維持在1 atm，維持5 min，重復(fù)擴(kuò)張2次，間隔3 min，此兩次擴(kuò)張記為一輪擴(kuò)張。擴(kuò)張過程中對(duì)動(dòng)物進(jìn)行心電、血氧飽和度監(jiān)測，若出現(xiàn)心率、血氧異常下降立即中止操作，術(shù)后禁食24小時(shí)，進(jìn)水不限。依據(jù)下文pH監(jiān)測結(jié)果判斷擴(kuò)張建模是否有效，對(duì)于第一輪擴(kuò)張無效的實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物進(jìn)行第二輪擴(kuò)張。

1.3下食管括約肌測壓及定位 擴(kuò)張前1周及擴(kuò)張后2周行下食管括約肌測壓。選用荷蘭MMS公司的定制單導(dǎo)聯(lián)固態(tài)食管測壓導(dǎo)管，動(dòng)物術(shù)前禁食24小時(shí)，禁水6小時(shí)，麻醉后固定，校正儀器。經(jīng)口置入測壓導(dǎo)管，先將電極位置向下放至胃內(nèi)，此時(shí)壓力約10 mmHg，且曲線平直，無呼吸波。緩慢上提電極，直至出現(xiàn)規(guī)律性壓力升高，在此時(shí)處于門齒處的導(dǎo)線上做標(biāo)記，記為LES下緣，繼續(xù)緩慢上提可見壓力繼續(xù)升高，每個(gè)位置保持3個(gè)收縮周期，直至壓力降低到低于胃內(nèi)壓且存在規(guī)律呼吸波，記為LES上緣。通過儀器自帶軟件可以算出LES平均靜息壓，并可根據(jù)導(dǎo)線標(biāo)記位置，準(zhǔn)確定位LES距離門齒的距離。擴(kuò)張后2周再次行LES測壓，比較擴(kuò)張前后LES壓力的變化。

1.4咽喉及食管下段pH值監(jiān)測 于球囊擴(kuò)張前1周和擴(kuò)張后2周進(jìn)行咽喉及食管下段pH值監(jiān)測，觀察咽喉反流及胃食管反流情況。動(dòng)物麻醉后固定，經(jīng)口置入2根Restech DX-pH檢測電極(美國Respiratory Technology公司)，進(jìn)行咽部及食管下段pH值同步監(jiān)測，監(jiān)測電極使用前均在pH 4.0和pH 7.0校準(zhǔn)液內(nèi)校準(zhǔn)。咽部電極放置在下咽部，食管電極放置在此前測壓定位的LES上緣上3 cm處，監(jiān)測時(shí)間為2小時(shí)，通過DX-pH檢測儀的自帶軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，記錄pH<5的酸反流事件百分比、反流事件數(shù)、反流最長時(shí)間，參考人類LPRD診斷標(biāo)準(zhǔn)[7, 8]，2小時(shí)內(nèi)觀察到咽喉pH<5的反流事件≥1次，視為造模成功，經(jīng)兩輪擴(kuò)張仍未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)視為造模失敗。

1.5喉鏡檢查和反流體征評(píng)分 擴(kuò)張前1周、擴(kuò)張后2周及擴(kuò)張后8周行喉鏡檢查并拍照，目前并無兔的反流體征評(píng)分系統(tǒng)，所以參考Belafsky等[9]提出的人類反流體征評(píng)分(reflux founding score，RFS)對(duì)其喉部圖像的各項(xiàng)體征(聲門下水腫、喉室消失、紅斑/充血、聲帶水腫、彌漫性喉水腫、后聯(lián)合增生、肉芽腫、喉內(nèi)黏稠黏液附著)進(jìn)行評(píng)分。

1.6病理檢查 擴(kuò)張后8周所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉后，行股動(dòng)脈切開放血法處死，取喉部黏膜及食管下段組織，置于10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋，常規(guī)HE染色后，光鏡觀察組織學(xué)改變。

2 結(jié)果

2.1LPRD兔模型造模結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組10只動(dòng)物中LPRD造模成功8只，失敗1只，死亡1只，經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)死因?yàn)榉尾扛腥?；造模成功?只動(dòng)物中6只為一輪擴(kuò)張后建模成功，2只為二輪擴(kuò)張后建模成功。對(duì)照組8只，存活7只，死亡1只，死因?yàn)楦篂a。

2.2下食管括約肌測壓結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組建模成功的8只動(dòng)物，LES中點(diǎn)距離門齒24.2±0.8 cm，LES長度0.8±0.3 cm，擴(kuò)張前LES壓力28.0±5.6 mmHg，擴(kuò)張后LES壓力17.2±3.3 mmHg。對(duì)照組存活的7只動(dòng)物，LES中點(diǎn)距離門齒24.1±0.7 cm，LES長度0.9±0.2 cm，擴(kuò)張前壓力27.6±4.7 mmHg，擴(kuò)張后壓力23.3±2.4 mmHg。實(shí)驗(yàn)組擴(kuò)張后LES壓力較擴(kuò)張前顯著降低(t=6.19，P=0.001)，且擴(kuò)張前LES收縮波規(guī)整，擴(kuò)張后收縮波紊亂不規(guī)整(圖1)，對(duì)照組假擴(kuò)張前后LES壓力無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=1.36，P=0.246)。

2.3喉鏡RFS評(píng)分結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組擴(kuò)張前1周RFS評(píng)分3.1±1.2分，擴(kuò)張后2周為3.6±1.4分，擴(kuò)張后8周為8.6±2.5分，對(duì)照組擴(kuò)張前1周為2.4±1.5分，擴(kuò)張后2周為2.6±1.3分，擴(kuò)張后8周為2.8±0.8分，實(shí)驗(yàn)組擴(kuò)張前與擴(kuò)張后兩周的RFS評(píng)分無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.482)，但擴(kuò)張前與擴(kuò)張后8周有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.005)。實(shí)驗(yàn)組擴(kuò)張后主要表現(xiàn)的LPRD體征為聲門下水腫、喉部黏液附著、彌漫性喉部水腫等，其中1例動(dòng)物出現(xiàn)聲突肉芽腫。對(duì)照組擴(kuò)張前后的喉鏡圖像基本正常，擴(kuò)張后2周及8周較擴(kuò)張前評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.815，P=0.717)(圖2)。

2.4咽喉pH值監(jiān)測結(jié)果 建模成功的8只實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物擴(kuò)張前后咽喉2 h pH檢測結(jié)果(圖3)示：擴(kuò)張前1周實(shí)驗(yàn)動(dòng)物pH<5的酸反流時(shí)間百分比(%)、反流事件數(shù)(次)、反流最長時(shí)間(s)分別為：0(0,0)、0(0,0)、0(0,0)，擴(kuò)張后2周分別為：17.5(8.2,29.4)、3(1,5.5)、17.2(10.2,30.8)，擴(kuò)張后較擴(kuò)張前增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.001)。對(duì)照組動(dòng)物擴(kuò)張前1周pH<5的酸反流時(shí)間百分比(%)、反流事件數(shù)(次)、反流最長時(shí)間(s)分別為：0(0,0)、0(0,0)、0(0,0)，假擴(kuò)張后2周分別為：0(0,3.1)、0(0,0.5)、0(0,3.7)，假擴(kuò)張前后各項(xiàng)監(jiān)測數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)，擴(kuò)張后2周實(shí)驗(yàn)組各項(xiàng)反流指標(biāo)較對(duì)照組均有提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)。

2.5食管下段pH值監(jiān)測結(jié)果 擴(kuò)張前后食管下段2 h pH檢測結(jié)果示：實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物擴(kuò)張前1周監(jiān)測酸反流時(shí)間百分比(%)、反流事件數(shù)(次)、反流最長時(shí)間(s)分別為: 0(0,0.7)、0(0,1)、0(0,1.2)，擴(kuò)張后2周分別為：23.1(4.8,49.5)、3(1,6)、25.9(11.5,56.8)，較擴(kuò)張前增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。對(duì)照組動(dòng)物擴(kuò)張前1周pH<5的酸反流時(shí)間百分比(%)、反流事件數(shù)(次)、反流最長時(shí)間(s)分別為：0(0,0.6)、0(0,1)、0(0,1)，假擴(kuò)張后2周分別為：0(0,2.7)、0(0,1)、0(0,2.1)，假擴(kuò)張前后各項(xiàng)監(jiān)測數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。擴(kuò)張后實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組食管各項(xiàng)反流指標(biāo)均有提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)。

2.6病理檢查結(jié)果 對(duì)照組喉部及食管黏膜無明顯炎癥表現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組喉部及食管黏膜均可觀察到不同程度的炎癥，喉部黏膜主要表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤性慢性炎癥，伴間質(zhì)水腫、腺體增生；食管黏膜表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞浸潤性慢性炎癥，局部可以觀察到鱗狀上皮角化不全(圖4)。

3 討論

LPRD是近年來研究的熱點(diǎn)，選擇和建立有效的動(dòng)物模型對(duì)該病的機(jī)制研究十分重要。LPRD的動(dòng)物研究有活體研究和離體研究，活體研究動(dòng)物模型多借鑒于胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease,GERD)的動(dòng)物模型，建立方法主要是通過內(nèi)源性和外源性兩種方法[3, 10]。外源性方法主要是通過向?qū)嶒?yàn)動(dòng)物咽喉部噴灑或者灌注胃酸、胃蛋白酶、膽鹽中的一種或多種物質(zhì)從而構(gòu)建模型，此方法簡單易行且動(dòng)物存活率較高，但并不符合反流的病理生理，且灌注液與真實(shí)反流物并不完全相同，無法完全揭示LPRD的發(fā)生發(fā)展。內(nèi)源性方法主要通過手術(shù)改變胃腸道解剖或者破壞反流屏障，造成胃腸內(nèi)容物反流，目前常用的建模方法包括LES切開或切除術(shù)[4]、LES擴(kuò)張加上食管括約肌(upper esophageal sphincter, UES)支架植入[5]、幽門或十二指腸縮窄術(shù)[6]等。內(nèi)源性方法構(gòu)建的動(dòng)物模型更加符合反流的病理生理，但是手術(shù)難度較大，對(duì)動(dòng)物創(chuàng)傷較大，動(dòng)物存活率較低。另外，國內(nèi)有學(xué)者探索通過病因?qū)W進(jìn)行建模，進(jìn)行了睡眠剝奪和高脂飲食誘發(fā)LPRD的動(dòng)物模型研究[11]，不失為一種另辟蹊徑的好方法，不過這種方法建模后必然混雜了睡眠剝奪和高脂飲食兩種因素，對(duì)結(jié)局指標(biāo)與LPRD因果關(guān)系判斷有一定影響。

LPRD內(nèi)源性動(dòng)物模型與GERD模型的互相借鑒源于兩病在病因?qū)W上有所重疊，均涉及反流屏障的完整性、反流的頻率和持續(xù)時(shí)間、反流物的酸度、食管廓清率、胃排空率、黏膜屏障的完整性、靶器官的敏感性等因素，其中LES是反流屏障的重要組成部分，既往研究顯示LES一過性松弛不但是GERD的重要病因，同樣也是LPRD的重要發(fā)病機(jī)制[3, 12]，LES松弛后，氣態(tài)或氣液態(tài)混合反流物到達(dá)食管時(shí)，可引起食管壁的迅速擴(kuò)張，繼而引起UES的松弛反射，從而利于反流物反流至咽喉，引起LPRD[13, 14]。本課題組的研究[15]也證實(shí)LPRD患者中胃食管閥瓣區(qū)的松弛程度與RFS評(píng)分存在相關(guān)性，提示LES的松弛度與LPRD病情嚴(yán)重程度相關(guān)。既往的動(dòng)物研究顯示兔模型中即使不對(duì)UES進(jìn)行處理，單純切除LES造成的慢性的胃食管反流也可以引起咽喉反流[16]。但內(nèi)源性方法構(gòu)建LPRD模型存在手術(shù)難度大，動(dòng)物創(chuàng)傷大，動(dòng)物存活率低等缺點(diǎn)，近年來有研究顯示食管括約肌球囊擴(kuò)張法可以安全有效地構(gòu)建GERD動(dòng)物模型[17]，此方法通過球囊擴(kuò)張，使部分LES括約肌纖維拉長甚至斷裂，造成LES松弛，而生理情況下胃內(nèi)壓高于食管內(nèi)壓，從而導(dǎo)致胃食管反流的發(fā)生，繼而可能引發(fā)LPRD。此方法的難點(diǎn)為LES的準(zhǔn)確定位和適度擴(kuò)張，既往研究多是通過開腹直視橡皮筋固定球囊位置避免球囊松脫移位[18]，增加了造模難度和動(dòng)物死亡率。

本研究借鑒了LES球囊擴(kuò)張法，并予以改進(jìn)完善。鑒于此法中LES定位及球囊固定的難點(diǎn)，本研究使用食管測壓準(zhǔn)確定位每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的LES位置，避免了因球囊位置不當(dāng)導(dǎo)致的食管破裂及LES擴(kuò)張不足。此外本研究選用專用的消化道擴(kuò)張球囊，其有效擴(kuò)張長度達(dá)5.5 cm，有效擴(kuò)張長度內(nèi)球囊呈柱狀，不易發(fā)生移位，預(yù)實(shí)驗(yàn)中切開食管觀察見球囊可對(duì)LES進(jìn)行全長擴(kuò)張且無明顯移位。本球囊有效擴(kuò)張直徑可選1.0 cm、1.5 cm、2.0 cm，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定1.5 cm直徑的球囊可以對(duì)5月齡實(shí)驗(yàn)用新西蘭白兔的LES進(jìn)行有效擴(kuò)張，擴(kuò)張時(shí)注意球囊加壓一定要緩慢均勻，加壓過程不小于30秒；擴(kuò)張完成后食管下段呈半透明狀，可使部分平滑肌斷裂或破壞，造成食管下段松弛或失去張力，擴(kuò)張后2周食管測壓仍可觀察到LES靜息壓較擴(kuò)張前顯著降低，且收縮波紊亂不規(guī)整，證實(shí)了經(jīng)此法LES得到了有效擴(kuò)張。另外，本研究發(fā)現(xiàn)雖然擴(kuò)張前動(dòng)物禁食水，但擴(kuò)張球囊取出時(shí)，仍會(huì)帶出少量胃內(nèi)食物殘?jiān)藭r(shí)應(yīng)注意使用負(fù)壓吸引器將咽喉部及食管上段的食物殘?jiān)蓛?，避免誤吸導(dǎo)致動(dòng)物死亡。因?yàn)橥玫难什考?xì)小，較易發(fā)生喉痙攣及誤吸，本研究中雖對(duì)食物殘?jiān)M(jìn)行了徹底吸引，仍有1只動(dòng)物因肺部感染死亡。

本研究結(jié)果顯示對(duì)實(shí)驗(yàn)用新西蘭白兔單純LES的有效擴(kuò)張即可造成LPRD，且伴有GERD；通過LES測壓可見，擴(kuò)張后LES多出現(xiàn)較嚴(yán)重的松弛改變，且收縮變得不規(guī)律；pH值監(jiān)測驗(yàn)證建模后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物咽喉及食管各項(xiàng)反流指標(biāo)均較建模前顯著提高，病理檢查顯示實(shí)驗(yàn)組喉部黏膜出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤、間質(zhì)水腫、腺體增生等慢性炎癥表現(xiàn)；說明此方法通過對(duì)LES的準(zhǔn)確定位和有效擴(kuò)張可建立兔的LPRD模型，且操作相對(duì)簡便，安全有效，對(duì)動(dòng)物造成創(chuàng)傷較小，實(shí)驗(yàn)組僅死亡1只，且無食管破裂發(fā)生，符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理及3R原則。本研究建模成功率為80%(8/10)，符合LPRD病理生理過程，適合長期觀察反流所致的氣道黏膜損傷。由于反流物質(zhì)引起的上呼吸道炎癥是一個(gè)慢性過程，本研究中觀察到造模2周后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的喉鏡評(píng)分較建模前無顯著差異，而8周后喉鏡下可見典型的LPRD的相關(guān)體征，如聲門下水腫、喉部黏液附著、喉部彌漫性水腫，甚至有1只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)聲突肉芽腫，提示LPRD動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的觀察時(shí)間不宜過短。因此，LPRD建模過程盡量選用微創(chuàng)的造模方法，這樣可以保證動(dòng)物長時(shí)間存活，便于觀察慢性反流所致的病理改變。

綜上所述，本研究通過食管測壓定位LES，使用球囊擴(kuò)張的方法建立了LPRD的動(dòng)物模型，經(jīng)LES測壓、pH監(jiān)測、喉鏡下表現(xiàn)及病理驗(yàn)證了模型的有效性，為LPRD的研究提供了一個(gè)微創(chuàng)、安全、有效的動(dòng)物模型，并為該病機(jī)制研究開拓了新的思路。本模型與目前絕大多數(shù)研究LPRD的動(dòng)物模型一樣，借鑒于GERD動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在出現(xiàn)咽喉反流的同時(shí)必然伴發(fā)較嚴(yán)重胃食管反流，而臨床中的LPRD患者往往不伴有典型的GERD[19]，如何構(gòu)建單純LPRD模型是未來的研究難點(diǎn)和方向。