適應(yīng)性進(jìn)化和改造質(zhì)粒穩(wěn)定性促進(jìn)枯草芽孢桿菌合成N-乙酰神經(jīng)氨酸

錢(qián)蕾,劉延峰,李江華,劉龍,堵國(guó)成

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無(wú)錫，214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

唾液酸(sialic acids，SA)是9碳氨基糖家族，目前發(fā)現(xiàn)大于40種形式源自神經(jīng)氨酸[1]。在結(jié)構(gòu)上，其2、4、5、7、8和9位上的各種類(lèi)型的組合有助于SA的多樣性[2]。最常見(jiàn)的SA分子是N-乙酰神經(jīng)氨酸(N-acetylneuraminic acid，NeuAc)，一種羧化的9碳單糖，5位上帶有N-乙?；鵞3]。NeuAc在細(xì)菌和動(dòng)物中無(wú)處不在，是人類(lèi)SA的主要形式。此外，NeuAc在調(diào)節(jié)生物識(shí)別、細(xì)菌免疫和疾病方面具有重要作用[4]，并且是唾液酸化人乳寡糖重要單體之一，對(duì)改善嬰兒發(fā)育至關(guān)重要[5]。因此，NeuAc是一種具有較大市場(chǎng)需求的新型生物發(fā)酵產(chǎn)品。

提高NeuAc的發(fā)酵產(chǎn)量以及降低其生產(chǎn)成本一直是推動(dòng)NeuAc在生物發(fā)酵領(lǐng)域被應(yīng)用的重要前提。在過(guò)去的研究中，對(duì)NeuAc代謝途徑中的關(guān)鍵酶做理性改造以提高轉(zhuǎn)化效率[6]，但全細(xì)胞催化所需的底物昂貴增加了生產(chǎn)成本[7]。而且在微生物代謝改造中，通常利用較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄翻譯元件以加強(qiáng)產(chǎn)物途徑[8]，弱化[9]甚至敲除競(jìng)爭(zhēng)途徑[10]，代謝流量大量用于產(chǎn)物合成從而導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)受損[11]。生物傳感器與適應(yīng)性進(jìn)化的組合策略能夠緩解這種平衡失調(diào)[12]，在應(yīng)用選擇壓力時(shí)富集高產(chǎn)菌株[13]。進(jìn)一步地，適應(yīng)性進(jìn)化對(duì)于穩(wěn)定微生物表型以及分析進(jìn)化過(guò)程中特定基因的變化情況是一種有效的辦法[14]。同時(shí)，基于質(zhì)粒的基因表達(dá)系統(tǒng)是微生物代謝途徑改造的常用工具，然而質(zhì)粒的不穩(wěn)定往往降低了菌株產(chǎn)物合成效率[15]。

為了提升重組枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)合成NeuAc的產(chǎn)量以及解決發(fā)酵過(guò)程中重組枯草芽孢桿菌質(zhì)粒丟失的問(wèn)題，本文在前期研究的基礎(chǔ)上，利用已成功構(gòu)建的NeuAc-Biosensor調(diào)控spc和erm抗性基因表達(dá)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)物產(chǎn)量偶聯(lián)，進(jìn)而通過(guò)適應(yīng)性進(jìn)化提升NeuAc合成效率。同時(shí)通過(guò)將必需基因folB插入攜帶NeuAc合成途徑關(guān)鍵酶編碼基因重組質(zhì)粒并且敲除基因組中的folB基因，有效降低了發(fā)酵過(guò)程中的質(zhì)粒丟失率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本實(shí)驗(yàn)所使用的菌株及質(zhì)粒如表1所示。目的基因擴(kuò)增引物及敲除引物如表2所示。

表1 本研究中使用的質(zhì)粒和菌株Table 1 Plasmids and strains used in this study

表2 本研究中使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.1.2 酶與試劑

質(zhì)粒提取試劑盒、DNA片段純化試劑盒、感受態(tài)制備試劑盒，生工生物工程(上海)有限股份公司；PrimeStar max聚合酶、限制性?xún)?nèi)切酶，TaKaRa。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 5，pH 7.0;發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉 12，胰蛋白胨 6，(NH4)2SO46，K2HPO4·3H2O 12，KH2PO42.5，MgSO4·7H2O 3，葡萄糖 60，尿素 6；枯草芽孢桿菌感受態(tài)培養(yǎng)基(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))：SPI-A:0.4% (NH4)2SO4，2.8% K2HPO4·3H2O，1.2% KH2PO4，0.2% C6H5Na3O7·2H2O，SPI-B：0.04% MgSO4·7H2O。100×CAYE：2% 酪蛋白水解物，10% 酵母粉，100×EGTA∶10 mmol/L EGTA；SPI:980 μL SPI-A,980 μL SPI-B,20 μL 100×CAYE,20 μL 50%的葡萄糖溶液；SPII:2 mL SPI，20 μL 50 mmol/L CaCl2，20 μL 250 mmol/L MgCl2。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組抗性質(zhì)粒構(gòu)建方法

以質(zhì)粒p136為模板，分別以引物136-spc-F/R和136-erm-F/R進(jìn)行擴(kuò)增得到大小為8 744 bp的線(xiàn)性化質(zhì)粒載體；以質(zhì)粒p7s6為模板，引物spc-F1/R1和spc-F2/R2進(jìn)行擴(kuò)增得到大小為783 bp的spc基因；以質(zhì)粒p7e6為模板，引物erm-F1/R1和erm-F2/R2進(jìn)行擴(kuò)增得到大小為738 bp的erm基因。將擴(kuò)增得到的線(xiàn)性DNA片段回收純化后進(jìn)行Gibson組裝[17]，并轉(zhuǎn)化至E.coliJM109進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增,得到正確重組質(zhì)粒p136-spc、p136-erm和p136-spc-erm。

1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建與基因敲除方法

以p43 NMK-AN為模板，引物p43-F/R進(jìn)行擴(kuò)增得到大小為9 094 bp的線(xiàn)性化質(zhì)粒載體，以B.subtilis168基因組為模板，引物folB-F/R進(jìn)行擴(kuò)增得到大小為363 bp的folB基因。將擴(kuò)增得到的線(xiàn)性DNA片段回收純化后進(jìn)行Gibson組裝，并轉(zhuǎn)化至E.coliJM109進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增。菌落PCR和測(cè)序驗(yàn)證后，得到正確重組質(zhì)粒p43-folB，進(jìn)一步將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌株BS3C。然后對(duì)基因組上folB進(jìn)行敲除[18]，以p7Z6質(zhì)粒為模板，引物zeo-F/R為引物擴(kuò)增得到大小為656 bp的zeo基因，以B.subtilis168基因組為模板，分別使用引物folB-L-F/R和folB-R-F/R擴(kuò)增得到大小為944和1 022 bp左右同源臂，將擴(kuò)增得到的線(xiàn)性DNA片段回收純化后以引物RH-folB-F/R進(jìn)行PCR融合，將得到融合產(chǎn)物轉(zhuǎn)化上述菌株BS3C，選擇zeo轉(zhuǎn)化子后將pTSC引入，組成型表達(dá)的Cre重組酶介導(dǎo)lox71和lox66之間的重組，涂布于無(wú)抗性平板并在51 ℃下培養(yǎng)，消除了pTSC，從而獲得了目標(biāo)菌株BS3B。

1.2.3 培養(yǎng)方法

24孔深孔板發(fā)酵：挑取單菌落接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，每孔培養(yǎng)基為1.5 mL，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)50 h左右。上述培養(yǎng)基中加入相應(yīng)篩選濃度的壯觀霉素和紅霉素。

1.2.4 感受態(tài)細(xì)胞制備

大腸桿菌感受態(tài)制備和轉(zhuǎn)化：參照上海生工大腸桿菌超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒說(shuō)明書(shū)。

枯草感受態(tài)制備和轉(zhuǎn)化：挑取宿主菌接種于1支2 mL SPI 培養(yǎng)基中,于14 mL搖菌管中，37 ℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜；取40 μL過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，接種至用2 mL SPI 培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)5～6 h后，取200 μL接種到2 mL SPII 培養(yǎng)基中，37 ℃ 220 r/min培養(yǎng)1.5～2 h；加入20 μL 100×EGTA溶液，37 ℃ 220 r/min 搖床培養(yǎng)10 min，用1.5 mL離心管分裝成500 μL每管；加入適量的質(zhì)粒0.5～1 μg，輕輕混勻，37 ℃ 220 r/min 培養(yǎng)1.5～2 h；以4 000 r/min 離心2 min收集菌體，棄部分上清液，留100 μL重懸菌體，涂布于相應(yīng)的抗性平板，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。

1.2.5 分析方法

假陽(yáng)性率測(cè)定：將傳代結(jié)束之后的發(fā)酵液系列稀釋后涂布于抗性平板上，挑取平板上全部單菌落進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證NeuAc產(chǎn)量，產(chǎn)量較出發(fā)菌株并未提高的計(jì)為假陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)算得到假陽(yáng)性率。

NeuAc濃度測(cè)定：通過(guò)HPLC測(cè)定分析產(chǎn)物濃度，色譜柱為Aminex HPX-87H柱(300 nm×7.8 nm)；流動(dòng)相為10 mmol/L H2SO4溶液，流速為0.5 mL/min，NeuAc的保留時(shí)間為9.5 min。將發(fā)酵液8 000×g離心10 min后取上清液，用30 mmol/L H2SO4溶液處理混勻后過(guò)濾以測(cè)定濃度[19]。

質(zhì)粒丟失率測(cè)定：將單菌落接種至100 mL液體LB培養(yǎng)基中，12 h后以10% 接種量接種至LB培養(yǎng)基中，連續(xù)培養(yǎng)3代，每12 h轉(zhuǎn)接1次。選擇3個(gè)培養(yǎng)時(shí)間，隨機(jī)挑取100個(gè)單菌落點(diǎn)板轉(zhuǎn)接至LB和卡納抗性平板，比較2種平板上菌落數(shù)，計(jì)算質(zhì)粒丟失率。

上述實(shí)驗(yàn)均設(shè)置了3組平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 NeuAc-Biosensor調(diào)控spc和erm基因表達(dá)效果驗(yàn)證

利用前期成功構(gòu)建的NeuAc-Biosensor質(zhì)粒p136來(lái)構(gòu)建的重組質(zhì)粒，調(diào)控抗性基因spc和erm表達(dá)。這里使用的NeuAc-Biosensor是基于自FadR/GntR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子NanR所構(gòu)建[8]。NeuAc-Biosensor由2個(gè)反向連接的啟動(dòng)子組成，分別調(diào)控NanR基因和GFP基因，為了將熒光蛋白的表達(dá)與細(xì)胞內(nèi)NeuAc聯(lián)系起來(lái)，在調(diào)控表達(dá)GFP基因的不同啟動(dòng)子中插入NanR結(jié)合位點(diǎn)，從而形成動(dòng)態(tài)開(kāi)關(guān)，即當(dāng)細(xì)胞內(nèi)NeuAc濃度低時(shí)，NanR與啟動(dòng)子中的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，阻止RNA聚合酶與啟動(dòng)子結(jié)合并抑制下游GFP基因轉(zhuǎn)錄；當(dāng)細(xì)胞內(nèi)NeuAc濃度高時(shí)，NanR的活性被NeuAc的變構(gòu)調(diào)節(jié)所消除，使得啟動(dòng)子與NanR結(jié)合得到釋放，啟動(dòng)子與RNA聚合酶結(jié)合并正常開(kāi)啟下游基因的轉(zhuǎn)錄[16]?？紤]到產(chǎn)NeuAc宿主菌株中質(zhì)粒帶有卡納霉素抗性基因，因此選取枯草芽孢桿菌中另外2種常用抗性基因作為調(diào)控靶基因，即壯觀霉素抗性基因spc和紅霉素抗性基因erm，利用NeuAc-Biosensor調(diào)控spc和erm表達(dá)，將胞內(nèi)NeuAc濃度與壯觀霉素或紅霉素抗性相關(guān)聯(lián)。將PCR擴(kuò)增后的spc基因和erm以及載體質(zhì)粒通過(guò)Gibson組裝構(gòu)建重組質(zhì)粒，如圖2所示。然后將質(zhì)粒p136-spc，p136-erm轉(zhuǎn)化入NeuAc產(chǎn)量不同的枯草芽孢桿菌中，分別為BS1(0.8 g/L)、BS2(1.5 g/L)、BS3(2.4 g/L)，將成功轉(zhuǎn)化的上述菌株挑取單菌落后進(jìn)行24孔深孔板發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基內(nèi)添加相應(yīng)抗生素，以半抑制濃度來(lái)表征調(diào)控效果，結(jié)果如表3所示。

a-p136-spc重組質(zhì)粒；b-p136-erm重組質(zhì)粒；c-p136-spc-erm重組質(zhì)粒圖1 重組抗性質(zhì)粒圖Fig.1 Map of recombinant resistance plasmid

表3 不同NeuAc產(chǎn)量重組枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的抗生素半抑制濃度 單位：mg/L

從表3可知，高產(chǎn)菌株能夠在較高抗生素濃度條件下生長(zhǎng)，說(shuō)明biosensor對(duì)于抗性基因有較好的調(diào)控效果。

2.2 基于適應(yīng)性化的BS3菌株發(fā)酵產(chǎn)NeuAc

適應(yīng)性進(jìn)化對(duì)于提高微生物在相關(guān)培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)和抗應(yīng)變能力很重要。通常，實(shí)驗(yàn)室中常用的定向進(jìn)化方法為分批培養(yǎng)-連續(xù)傳代，這種方法成本比較低并且可以通過(guò)深孔板等更小培養(yǎng)體積的設(shè)備進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，物理化學(xué)因素也比較可控。因此在這里我們選擇分批培養(yǎng)-連續(xù)傳代培養(yǎng)方法。在之前的研究中，通過(guò)對(duì)2個(gè)關(guān)鍵前體N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和磷酸烯醇式丙酮酸的供應(yīng)途徑進(jìn)行模塊途徑工程以及平衡NeuAc的生物合成和細(xì)胞生長(zhǎng)，NeuAc產(chǎn)量達(dá)到2.18 g/L[10]。為了進(jìn)一步提高NeuAc產(chǎn)量且平衡細(xì)胞生長(zhǎng)，我們將生物傳感器與適應(yīng)性進(jìn)化結(jié)合，在進(jìn)化過(guò)程中不斷提高抗生素濃度，使得高產(chǎn)細(xì)胞形成生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，從而富集得到高產(chǎn)菌株。由2.1小節(jié)可知，NeuAc-biosensor對(duì)抗性基因的調(diào)控效果在菌株BS3中效果較顯著，因此以帶有單抗性和雙抗性的BS3菌株為出發(fā)菌株，抗生素的篩選濃度梯度如表4所示，對(duì)其進(jìn)行適應(yīng)性進(jìn)化，孔板發(fā)酵每隔24 h以10%的接種量進(jìn)行取樣及傳代，5次傳代之后結(jié)束發(fā)酵。前期研究發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)化過(guò)程中，小部分細(xì)胞在沒(méi)有指定代謝物產(chǎn)生的情況下也能存活[19]，這種“逃逸”是由于永久選擇敏感性的突變引起的[20-21]，因此我們使用了雙抗性標(biāo)記篩選來(lái)減少這種假陽(yáng)性者的存活。經(jīng)過(guò)5輪進(jìn)化篩選之后，我們對(duì)3種抗性篩選平板均選取了15個(gè)單菌落進(jìn)行了發(fā)酵驗(yàn)證，通過(guò)HPLC方法測(cè)定NeuAc濃度后發(fā)現(xiàn)壯觀霉素和紅霉素篩選分別有4個(gè)和5個(gè)菌落較出發(fā)菌株產(chǎn)量有提高，而雙抗性篩選則有8個(gè)菌落較出發(fā)菌株產(chǎn)量有所提高，不同菌株的產(chǎn)量如圖2所示。按照上述假陽(yáng)性率測(cè)定方法得到單抗性篩選的假陽(yáng)性率為73.3%(壯觀霉素)、66.7%(紅霉素)，而雙抗性篩選的假陽(yáng)性率則為46.7%。通過(guò)單抗性標(biāo)記與雙抗性標(biāo)記篩選的對(duì)比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雙重選擇能夠有效減少假陽(yáng)性菌株，再次體現(xiàn)了雙抗性篩選策略的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)得到1株產(chǎn)量為(3.16±0.19)g/L的菌株BS3C，較出發(fā)菌株產(chǎn)量提高了31.7%。

表4 適應(yīng)性進(jìn)化抗生素篩選濃度表Table 4 Concentration of antibiotic for adaptive evolution screening

a-壯觀霉素篩選產(chǎn)量驗(yàn)證；b-紅霉素篩選產(chǎn)量驗(yàn)證；c-壯觀霉素和紅霉素篩選產(chǎn)量驗(yàn)證圖2 適應(yīng)性進(jìn)化后NeuAc產(chǎn)量驗(yàn)證Fig.2 NeuAc production verification after adaptive evolution

2.3 基于對(duì)必需基因folB的改造提高質(zhì)粒穩(wěn)定性

抗生素抗性是重組質(zhì)粒常用的篩選標(biāo)記，添加抗生素可以提供選擇壓力，抑制質(zhì)粒丟失的細(xì)胞生長(zhǎng)。然而，抗生素在培養(yǎng)過(guò)程的降解會(huì)造成選擇壓力失效。另外，抗生素的添加還增加了成本，可能在工業(yè)環(huán)境中污染最終產(chǎn)品。雖然染色體整合表達(dá)具有更高的穩(wěn)定性，但在許多情況下，基因整合效率低和表達(dá)強(qiáng)度不足阻礙了染色體整合表達(dá)的應(yīng)用[22]。為了在不使用抗生素的情況下實(shí)現(xiàn)對(duì)質(zhì)粒的選擇和維持，我們敲除了枯草芽孢桿菌基因組中的必需基因folB(編碼二氫喋呤醛縮酶),同時(shí)在表達(dá)NeuAc合成途徑關(guān)鍵基因的質(zhì)粒中插入必需基因folB，獲得BS3C菌株，使細(xì)胞中必需基因folB的表達(dá)依賴(lài)于質(zhì)粒的存在和質(zhì)粒中folB表達(dá)(圖3)。通過(guò)上述改造，質(zhì)粒的丟失率由34.1%下降至11.8%，BS3C菌株NeuAc產(chǎn)量為(3.34±0.22)g/L，維持在穩(wěn)定水平。上述結(jié)果說(shuō)明，利用必需基因改造的方法可以有效的保證產(chǎn)NeuAc枯草芽孢桿菌中質(zhì)粒的穩(wěn)定性。

a-質(zhì)粒穩(wěn)定性改造策略；b-質(zhì)粒穩(wěn)定性改造后產(chǎn)量與質(zhì)粒丟失率圖3 質(zhì)粒穩(wěn)定性改造Fig.3 Modification of plasmid stability

3 結(jié)論

NeuAc在食品和生物醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用，代謝改造是提高重組枯草芽孢桿菌中NeuAc產(chǎn)量和降低生產(chǎn)成本的重要手段。本研究利用NeuAc-Biosensor調(diào)控抗生素抗性基因表達(dá)，進(jìn)而通過(guò)增加抗生素濃度進(jìn)行適應(yīng)性進(jìn)化，NeuAc合成效率提升了33.8%。進(jìn)一步通過(guò)將必需基因folB插入攜帶NeuAc合成途徑關(guān)鍵基因重組質(zhì)粒，并且敲除基因組中的folB基因，有效降低了發(fā)酵過(guò)程中的質(zhì)粒丟失率。本研究提升了重組枯草芽孢桿菌合成NeuAc的產(chǎn)量和穩(wěn)定性，為重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵法生產(chǎn)NeuAc奠定了基礎(chǔ)。