發(fā)酵蔬菜菌種應(yīng)用及菌群調(diào)控研究進(jìn)展

史巧，劉畢琴，湯回花，王馨蕊，朱力舟，趙楠，李宏*

1(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，云南 昆明，650223)2(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，四川 成都，610011)

發(fā)酵蔬菜是新鮮蔬菜經(jīng)不同程度的微生物發(fā)酵，形成具有風(fēng)味獨特、保質(zhì)期長、營養(yǎng)價值高的制成品，包括四川泡菜、涪陵榨菜、東北酸菜等各地傳統(tǒng)腌制蔬菜。近年來我國發(fā)酵蔬菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，呈現(xiàn)出廣闊的市場空間，然而相比泡菜產(chǎn)業(yè)較為領(lǐng)先的韓國而言，我國的規(guī)?；?、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)水平仍存在差距，工藝大多傳統(tǒng)粗放，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，對于健康綠色產(chǎn)品開發(fā)不足。為了改進(jìn)發(fā)酵蔬菜的生產(chǎn)工藝，提高產(chǎn)品競爭力，對于發(fā)酵微生物作用機(jī)制和精準(zhǔn)調(diào)控工藝的研究及功能菌劑的挖掘利用有著重要的現(xiàn)實意義。

微生物的作用貫穿于發(fā)酵蔬菜生產(chǎn)的全過程。在自然發(fā)酵過程中，蔬菜表面附著的乳酸菌通過生成代謝產(chǎn)物和低氧環(huán)境成為優(yōu)勢菌，而蔬菜發(fā)酵成功的關(guān)鍵是控制環(huán)境條件達(dá)到抑制有害微生物的活動，促進(jìn)乳酸菌以及產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)的酵母菌等微生物以適宜的菌落結(jié)構(gòu)生長和演替，發(fā)揮其代謝功能以形成發(fā)酵蔬菜的特征風(fēng)味及感官品質(zhì)。一方面，微生物對于改善發(fā)酵蔬菜風(fēng)味、保留營養(yǎng)成分不可缺少；同時，發(fā)酵蔬菜中豐富的活性乳酸菌可以促進(jìn)腸道健康，其多種保健功能已被廣泛接受。另一方面，微生物引起的蔬菜制品過度發(fā)酵，嚴(yán)重影響了產(chǎn)品的儲存性和感官營養(yǎng)品質(zhì)，是工業(yè)生產(chǎn)面臨的一大難題。因此，了解發(fā)酵蔬菜中微生物群落組成及特性，針對性地調(diào)控菌群，從而控制發(fā)酵蔬菜品質(zhì)具有十分重要的意義。本文從發(fā)酵蔬菜微生物群落結(jié)構(gòu)、功能菌種的應(yīng)用和影響菌群的因素幾方面進(jìn)行了綜述，期望為工業(yè)化生產(chǎn)高品質(zhì)發(fā)酵蔬菜提供理論依據(jù)。

1 發(fā)酵蔬菜菌群研究進(jìn)展

微生物對蔬菜發(fā)酵過程影響重大，將蔬菜基質(zhì)中的碳水化合物、蛋白質(zhì)分解成乳酸、乙醇、醋酸、氨基酸等物質(zhì)，并進(jìn)一步生成酮類、醛類、醇類、酯類等多種風(fēng)味物質(zhì)。其中以乳酸菌為主導(dǎo)的乳酸發(fā)酵是最核心的反應(yīng)，分為同型和異型發(fā)酵[1]。同型發(fā)酵的代謝產(chǎn)物為乳酸，而異型發(fā)酵除生成乳酸外，還生成乙醇、乙酸和CO2等物質(zhì)，對發(fā)酵蔬菜獨特風(fēng)味的形成起著關(guān)鍵作用。乳酸菌代謝產(chǎn)生的2,3-丁二醇、乙偶姻及雙乙酰等也是重要的生香物質(zhì)。

蔬菜發(fā)酵過程除乳酸發(fā)酵外，還伴有乙醇發(fā)酵及輕微的醋酸發(fā)酵。發(fā)酵初期，由于酵母菌的無氧呼吸及異型乳酸發(fā)酵作用會有少量乙醇生成。蔬菜發(fā)酵中常見的有益酵母菌有圓酵母、魯氏酵母、隱球酵母等，而產(chǎn)醭酵母為有害酵母。在后熟階段，乙醇與有機(jī)酸生成的酯類是發(fā)酵蔬菜香氣的來源之一，乙醇還能增強(qiáng)發(fā)酵蔬菜的貯藏性。乙醇可以作為醋酸發(fā)酵的底物，在有氧條件下醋酸菌利用乙醇作為基質(zhì)生成醋酸。蔬菜發(fā)酵中常見的醋酸菌有黑醋菌、膜醋菌和紅醋菌等。在發(fā)酵過程中存有少量的醋酸有益于產(chǎn)品的風(fēng)味形成，除了醋酸特有的風(fēng)味外，醋酸可以與乙醇形成醋酸乙酯，增加產(chǎn)品香氣。

傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜生產(chǎn)中涉及種類眾多的微生物，這些微生物形成復(fù)雜的菌群結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生復(fù)雜多樣的風(fēng)味成分，同時可以改良蔬菜的保藏性質(zhì)和營養(yǎng)功能。傳統(tǒng)的可培養(yǎng)方法和分子微生物生態(tài)學(xué)方法難以對如此復(fù)雜的微生物菌群結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行系統(tǒng)的分析。近年來，蓬勃發(fā)展起來的高通量測序以及多組學(xué)技術(shù)已應(yīng)用于發(fā)酵蔬菜發(fā)酵過程中微生物群落及代謝產(chǎn)物的研究，可從本質(zhì)上揭示自然發(fā)酵中微生物菌群如何影響蔬菜發(fā)酵過程，并最終決定產(chǎn)品的安全性、風(fēng)味口感和營養(yǎng)功能。

1.1 發(fā)酵蔬菜中微生物變化規(guī)律

由于受原料、環(huán)境氣候、加工工藝等因素影響，不同蔬菜發(fā)酵過程中微生物群落變化各具特點，但一般呈現(xiàn)異型乳酸發(fā)酵和同型乳酸發(fā)酵2個主要階段。異型發(fā)酵乳酸菌包括明串珠球菌、乳球菌和部分乳桿菌(如短乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌和羅伊氏乳桿菌)。同型乳酸發(fā)酵階段，發(fā)酵液酸度增大，優(yōu)勢菌明串珠菌死亡，乳桿菌屬成為優(yōu)勢菌群，最后由于乳酸的大量積累而抑制乳酸菌自身的生長，發(fā)酵便趨于終止。同型發(fā)酵的乳酸菌有德氏乳桿菌、植物乳桿菌、戊糖片球菌、乳酸鏈球菌等[2]。發(fā)酵后期，耐酸性強(qiáng)的酵母菌可利用體系中的小分子成分合成香味物質(zhì)。隨著發(fā)酵后儲藏時間的延長，蔬菜品質(zhì)達(dá)到最佳后開始逐漸下降，原因有同型發(fā)酵過甚引起產(chǎn)品過酸，腐敗菌引起的脹袋變質(zhì)等。

對自然發(fā)酵酸菜的微生物多樣性進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，細(xì)菌群落多樣性大于真菌，包括明串珠球菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬和乳桿菌屬等14個物種，優(yōu)勢的真菌包括漢遜德巴利酵母，熱帶假絲酵母和青霉。JUNG等[3]運用宏基因組學(xué)對泡菜29 d發(fā)酵過程進(jìn)行研究，發(fā)酵起始階段，明串株菌占優(yōu)勢，隨后乳桿菌和魏斯氏菌豐度增加，3種菌成為主要菌群。而23天后，明串珠菌的豐度再次升高，乳桿菌和魏斯氏菌的豐度逐漸降低。比對發(fā)現(xiàn)，大部分源自泡菜的宏基因組序列與腸膜明串珠菌和清酒乳桿菌基因序列具有高度相似性，這2種菌在泡菜發(fā)酵過程中可能發(fā)揮重要作用。在宏基因組數(shù)據(jù)庫中也發(fā)現(xiàn)了大量的噬菌體DNA序列，表明泡菜在發(fā)酵過程中感染了噬菌體。JEONG等[2]使用焦磷酸測序?qū)n國泡菜中微生物群落分析顯示，在發(fā)酵100 d的蘿卜和發(fā)酵120 d的辣白菜中，明串珠球菌為主要發(fā)酵菌，明串珠球菌、乳球菌、乳桿菌和魏斯氏菌等多種乳酸菌有助于發(fā)酵初期pH降低，隨著游離糖消耗以及甘油和乙醇的產(chǎn)生，細(xì)菌豐度下降、酵母菌數(shù)量增加。劉長蕾等[4]對東北酸菜和韓國辣白菜發(fā)酵過程中微生物變化規(guī)律進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)明串珠菌是發(fā)酵初期的優(yōu)勢菌，在發(fā)酵8 d時數(shù)量達(dá)到最高，隨后逐漸降低。LIANG等[5]對工業(yè)發(fā)酵泡菜中的微生物群落進(jìn)行研究，指出在發(fā)酵過程中，厚壁菌門和變形菌門是優(yōu)勢菌群,在青菜和榨菜泡菜中觀察到相同優(yōu)勢種屬的細(xì)菌，消化乳桿菌、Lactobacillusparalimentarius，乳桿菌在發(fā)酵的初期豐度較高，后期大致保持不變。

1.2 發(fā)酵蔬菜微生物代謝作用

有學(xué)者對泡菜發(fā)酵或長期儲藏過程中，微生物演替與代謝物變化的相關(guān)性進(jìn)行研究[2,6-7]。JUNG等[8]利用基于16S rRNA的焦磷酸測序分析了泡菜中微生物群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，泡菜中的微生物主要由6種乳酸菌組成，分別為腸膜明串珠球菌、清酒乳桿菌、Weissellakoreensis、Leuconostocgelidum,Leuconostoccarnosum，Leuconostocgasicomitatum。腸膜明串珠球菌在發(fā)酵初期基因表達(dá)量最高，耐酸性較強(qiáng)的清酒乳桿菌和W.koreensis在發(fā)酵中后期含量較高，Leu.gelidum在發(fā)酵中期呈上升趨勢，并一直持續(xù)到發(fā)酵結(jié)束,L.carnosum和L.gasicomitatum在發(fā)酵初期相對較高，隨著發(fā)酵的進(jìn)行逐漸減少。在29 d的發(fā)酵過程中，通過mRNA比較分析發(fā)現(xiàn)，腸膜明串珠球菌在發(fā)酵前期最為活躍，后期清酒乳桿菌和W.koreensis的基因表達(dá)量較高。而清酒乳桿菌的基因表達(dá)在發(fā)酵25 d后迅速下降，這可能是噬菌體感染乳酸桿菌所致。許多與碳水化合物運輸、水解和乳酸發(fā)酵相關(guān)的基因表達(dá)量較高，屬于典型的異型乳酸菌發(fā)酵。甘露醇脫氫酶編碼基因(mdh)在所有明串珠菌屬中均有發(fā)現(xiàn)，尤其是在腸膜明串珠球菌中。JUNG等[3]采用宏基因組注釋技術(shù)，揭示了一系列碳水化合物異型乳酸發(fā)酵的相關(guān)基因，這與檢測到的發(fā)酵產(chǎn)物甘露醇、乳酸、乙酸乙酯和乙醇等相一致。自然發(fā)酵酸菜的大部分揮發(fā)性風(fēng)味化合物形成于發(fā)酵的中間階段，其中種類最多的是形成酸菜香味的酯類和醛類。ZHAO等[9]從傳統(tǒng)四川泡菜鹵水中分離乳酸菌并考察其對特征味覺的貢獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)隨著植物乳桿菌、布氏乳桿菌、耐乙醇片球菌的生長，泡菜特征代謝產(chǎn)物谷氨酸、蔗糖、甘氨酸、乳酸及γ-氨基丁酸的含量顯著提高。1HNMR分析表明，韓國泡蘿卜發(fā)酵過程中游離糖(果糖和葡萄糖)的濃度首先迅速增加，發(fā)酵30 d后，隨著游離糖的消耗，酵母菌快速生產(chǎn)并產(chǎn)生甘油和乙醇。此外，還產(chǎn)生了有機(jī)酸、甘露醇和γ-氨基丁酸，并鑒定了明串珠菌和清酒乳桿菌分別產(chǎn)甘露醇和γ-氨基丁酸[2]。

泡菜中微生物代謝網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，這些轉(zhuǎn)錄組、代謝組數(shù)據(jù)分析結(jié)果有助于我們挖掘出新的功能基因，更清晰地了解發(fā)酵蔬菜中各菌株對風(fēng)味的貢獻(xiàn)，有助于篩選發(fā)酵劑和優(yōu)化發(fā)酵條件。

2 發(fā)酵蔬菜功能菌種的選育及應(yīng)用

傳統(tǒng)自然發(fā)酵主要依賴蔬菜表面的乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸，以提高蔬菜的保藏性和風(fēng)味，但因受到霉菌、酵母菌和大腸桿菌等雜菌的影響，導(dǎo)致其發(fā)酵周期偏長，容易腐敗和亞硝酸鹽超標(biāo)，并且產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，難以實現(xiàn)工業(yè)化、規(guī)?；a(chǎn)。選育和應(yīng)用性能優(yōu)良的關(guān)鍵發(fā)酵菌種是現(xiàn)代蔬菜發(fā)酵工藝的必由選擇。在發(fā)酵蔬菜中接種特定乳酸菌，其自身的相對豐度提高，同時其他種屬的微生物也會受到抑制或促進(jìn)的作用，從而影響群落動態(tài)變化。接種乳酸菌可加快發(fā)酵進(jìn)程，降低失敗風(fēng)險，并提高產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性和安全性[10]。目前，乳酸菌發(fā)酵劑已大量用于各國發(fā)酵蔬菜的生產(chǎn)，隨著研究的深入，對于優(yōu)良菌種的功能特性也提出了更高要求。用于蔬菜發(fā)酵的菌種一般需要耐高鹽低溫脅迫且產(chǎn)酸速率高，能夠快速適應(yīng)環(huán)境，形成生長優(yōu)勢，從而提高發(fā)酵速率。在此基礎(chǔ)上，目前蔬菜發(fā)酵菌種的篩選主要集中在對產(chǎn)品風(fēng)味、質(zhì)量安全和益生功能的提升及對產(chǎn)品保質(zhì)期的延長等方面[11]。

2.1 維持風(fēng)味

產(chǎn)品的風(fēng)味品質(zhì)是篩選發(fā)酵菌種的重要依據(jù)。PARK等[6]純種接種植物乳桿菌發(fā)酵泡菜，發(fā)現(xiàn)接種不同菌株的泡菜之間代謝產(chǎn)物存在明顯差異，表明可通過篩選菌種來控制特征代謝產(chǎn)物。為了得到低鹽日式酸菜，SAKAI等[12]選用了2株在芥菜汁培養(yǎng)基中產(chǎn)酸速率高的植物乳桿菌和小片球菌分別發(fā)酵芥菜，在2%的低鹽含量下，2株菌在接種12 d后pH降至4.3以下，而在6%鹽含量的自然發(fā)酵對照中，40 d后pH才降至4.2。純種接種還可在低鹽環(huán)境中防止雜菌污染長達(dá)181 d，有效降低了鹽的使用量。徐丹萍等[13]比較了自然發(fā)酵、老泡菜水發(fā)酵、腸膜明串珠菌發(fā)酵、植物乳桿菌發(fā)酵和短乳桿菌發(fā)酵得到的5種不同泡菜的揮發(fā)性成分，并利用相對氣味活度值確定了各種泡菜的主體風(fēng)味成分。結(jié)果顯示不同泡菜的主體風(fēng)味成分種類差異較大，腸膜明串珠菌、植物乳桿菌發(fā)酵泡菜與自然發(fā)酵泡菜在總體風(fēng)味成分上較為接近，而老泡菜水發(fā)酵和短乳桿菌發(fā)酵泡菜風(fēng)味明顯不同。JUNG等[14]用腸膜明串珠菌接種2種韓國泡菜大白菜和蘿卜，通過代謝產(chǎn)物分析發(fā)現(xiàn)純種發(fā)酵與自然發(fā)酵相比，發(fā)酵完成更快且有機(jī)酸和甘露醇產(chǎn)量更高。

2.2 降低有害代謝產(chǎn)物

接種乳酸菌可以控制發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽、生物胺等有害物質(zhì)的產(chǎn)生和積累，從而得到健康、安全產(chǎn)品。YAN等[15]考察了6株不同種的乳酸菌降解亞硝酸鹽的效果，選取了效果較好的戊糖乳桿菌、腸膜明串珠菌分別用作中式泡菜的發(fā)酵菌種。不同于自然發(fā)酵中亞硝酸鹽含量上升到峰值，然后下降的過程，人工接種的泡菜中亞硝酸鹽僅有很小的波動。同時，腸桿菌等產(chǎn)生亞硝酸鹽的細(xì)菌數(shù)量明顯少于自然發(fā)酵，解釋了乳酸菌通過消耗亞硝酸鹽和抑制其產(chǎn)生菌起到減少泡菜中亞硝酸鹽的作用。XIA等[16]對43株乳酸菌分離株進(jìn)行了亞硝酸鹽降解性能的篩選，其中來源于四川泡菜的短乳桿菌AR123降解率最高，達(dá)到了99.85%。在6%的鹽含量下，該菌和市售發(fā)酵劑均可以迅速降低醬菜的pH值，同時在72 h的醬菜中亞硝酸鹽含量分別為0.83和3.05 mg/kg，而自然發(fā)酵中亞硝酸鹽的含量高達(dá)17.92 mg/kg。

利用乳酸菌控制發(fā)酵蔬菜中生物胺的研究集中在乳桿菌和明串珠菌。RABIE等[17]選用3株植物乳桿菌、干酪乳桿菌和彎曲乳桿菌接種德國泡菜，考察其對生物胺含量的影響。結(jié)果表明接種任一菌株后，生物胺總量明顯低于對照。對照中的生物胺以腐胺、酪胺和較少的組胺為主，接種乳酸菌后使得腐胺含量降低10倍，儲藏45 d的樣品中組胺和酪胺則檢測不到。PENAS等[18]比較了植物乳桿菌和腸膜明串珠菌接種在0.5%和1.5% NaCl含量的德國泡菜時的生物胺產(chǎn)生情況，發(fā)現(xiàn)2種菌在0.5% NaCl含量下的生物胺總量均低于1.5%NaCl濃度，腸膜明串珠菌相對于植物乳桿菌產(chǎn)生生物胺較少。

2.3 產(chǎn)細(xì)菌素抑制有害菌

一些乳酸菌可以產(chǎn)生細(xì)菌素抑制腐敗菌和病原菌的生長，通過篩選產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌提高發(fā)酵蔬菜的安全性和保藏性也是當(dāng)前研究的熱點。乳酸菌細(xì)菌素是乳酸菌通過核糖體合成的一類具有抑菌活性的多肽或前體多肽，已經(jīng)鑒定出發(fā)酵蔬菜中的腸膜明串珠菌、檸檬明串珠球菌、植物乳桿菌、清酒乳桿菌、乳酸乳球菌和乳酸片球菌等乳酸菌可產(chǎn)細(xì)菌素[19]。CHANG等[11]將誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)菌素的檸檬明串珠菌用于發(fā)酵韓國泡菜，以期提高泡菜的感官品質(zhì)和保藏性。在125 d保藏期內(nèi)，該株菌占接種發(fā)酵泡菜總菌群的70%～90%，并在整個期間未檢測到酵母。然而自然發(fā)酵的泡菜中沒有占主導(dǎo)的乳酸菌種類，并且在儲存50 d后檢測到酵母。在存放95～125 d時，接種發(fā)酵泡菜的質(zhì)地(硬實度)相當(dāng)于存放20 d的自然發(fā)酵。此外，感官評價指標(biāo)(質(zhì)地、異味和碳酸口感)明顯優(yōu)于對照組，顯示接種產(chǎn)細(xì)菌素的檸檬明串珠菌可以控制菌群，防止泡菜過度成熟，并延長保質(zhì)期。CHANG等[20]接下來用同一株產(chǎn)細(xì)菌素的檸檬明串珠菌發(fā)酵韓國泡菜，并在發(fā)酵泡菜汁中接種大腸桿菌O157∶H7、鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌等病原菌。相對自然發(fā)酵泡菜汁，接種發(fā)酵的泡菜汁能顯著減少病原菌的數(shù)量，證明產(chǎn)細(xì)菌素的發(fā)酵菌種能保護(hù)食品免于病原菌的污染。TOLONEN等[21]檢測到發(fā)酵甘藍(lán)泡菜水中乳酸乳球菌產(chǎn)生的乳酸鏈球菌肽(nisin)在24 h內(nèi)高達(dá)1 400 IU/mL，且在發(fā)酵13 d后仍可檢測到250 IU/mL 的nisin。同時證明泡菜水中的nisin能有效抑制單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。此外，植物乳桿菌E11在芥菜汁培養(yǎng)基中生長良好，并能產(chǎn)生抑制大腸桿菌、無毒李斯特菌和金黃色葡萄球菌，因而被用作四川泡菜的發(fā)酵劑，其在發(fā)酵早期就可以起到抑制病原菌的作用[22]。

2.4 延長保質(zhì)期

為了延長產(chǎn)品保質(zhì)期，避免過酸和產(chǎn)氣脹袋，各國研究人員開展了相應(yīng)的菌種選育工作。一些研究集中在耐酸的腸膜明串珠菌的選育上，隨著發(fā)酵后期酸度升高，明串珠菌被抑制，而通過亞硝基胍處理后獲得的耐酸突變菌株可以在pH 4.0下生長，從而抑制引起過度成熟的其他乳酸菌，使泡菜最佳的感官品質(zhì)得以延長。該耐酸突變株與1株產(chǎn)香并消耗乳酸的酵母菌Saccharomycesfermentati聯(lián)合用作韓國泡菜發(fā)酵劑，其產(chǎn)品的最佳成熟期為自然發(fā)酵的1.5倍，發(fā)酵第28 天仍可食用[23]。H+-ATPase是乳酸菌耐酸調(diào)控的關(guān)鍵酶，通過使該酶的亞基發(fā)生突變，篩選對酸敏感的植物乳桿菌突變菌，以期降低四川泡菜的后酸化，延長保質(zhì)期[24]。在黃瓜的發(fā)酵中，植物乳桿菌將蘋果酸脫羧形成乳酸和CO2，而CO2積累會導(dǎo)致產(chǎn)品膨脹損壞，因此有學(xué)者通過誘變獲得不使蘋果酸脫羧的植物乳桿菌，并從中篩選出生長和耐鹽性高的突變株作為發(fā)酵菌種[25]。

2.5 具有益生功能或活性產(chǎn)物

篩選具有益生功能的微生物也是當(dāng)前蔬菜發(fā)酵劑研究的熱點。甘藍(lán)等蔬菜基質(zhì)被認(rèn)為是益生菌合適的載體，可在胃腸道的惡劣條件下起到保護(hù)益生菌的作用。植物乳桿菌L4的體內(nèi)益生特性，比如在小鼠胃腸道中的存活、競爭、黏附和定植，以及免疫調(diào)節(jié)能力得到了證實，并被用作德國泡菜的發(fā)酵菌種[26]。對韓國泡菜的功效研究顯示其具有抗腫瘤、抗肥胖、降低膽固醇、抗氧化、抗衰老、增強(qiáng)免疫力和促進(jìn)腦健康等健康功效。XIONG等[27]依據(jù)對高濃度膽鹽和酸的耐受性，篩選可在模擬胃液環(huán)境中幸存下來，并可能到達(dá)腸道的乳酸菌，篩選出1株發(fā)酵中式泡菜的功能植物乳桿菌亞種。

此外，一些乳酸菌具有抗氧化、降解膽固醇和產(chǎn)γ-氨基丁酸及異麥芽低聚糖等功能特性。接種了1株布氏乳桿菌的韓國泡菜中的γ-氨基丁酸含量為61.65 mg/100 g，比未接種的對照泡菜高出約8倍，并且接種布氏乳桿菌的泡菜和對照泡菜的感官接受度沒有顯著差異[28]。1株高產(chǎn)葡聚蔗糖酶的檸檬明串珠菌和底物蔗糖、麥芽糖一起用于韓國泡菜的發(fā)酵，提高了益生異麥芽低聚糖的產(chǎn)量，并通過酶促反應(yīng)釋放果糖，達(dá)到了適宜的甜度[29]。

2.6 菌種協(xié)同作用

相對于純種發(fā)酵，復(fù)合菌種發(fā)酵具有感官品質(zhì)優(yōu)、穩(wěn)定性高、產(chǎn)品低鹽低害等優(yōu)點。HAN等[30]從自然發(fā)酵大白菜中篩選了3株生長速率和降解亞硝酸鹽效率高的分離株，并考察了其純種發(fā)酵和兩兩組合發(fā)酵的效果。結(jié)果顯示，德氏乳桿菌IWQ和副干酪乳桿菌J21具有協(xié)同效應(yīng)，兩者復(fù)合發(fā)酵大白菜得到了比對照發(fā)酵劑更優(yōu)的產(chǎn)品酸度和感官品質(zhì)，同時亞硝酸鹽含量明顯降低。ZHAO等[9]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌、布氏乳桿菌和耐乙醇片球菌為四川泡菜鹵水中的優(yōu)勢乳酸菌種群，用這3個種的分離株混合接種發(fā)酵蘿卜能夠顯著提高泡菜特征滋味物質(zhì)的含量。XIANG等[31]評估了食竇魏斯氏菌共接種對植物乳桿菌發(fā)酵四川泡豇豆品質(zhì)的影響，與單純接種植物乳桿菌相比，混合接種可加快產(chǎn)酸速率和發(fā)酵初期非揮發(fā)性有機(jī)酸的產(chǎn)生，并且顯著提高了揮發(fā)性風(fēng)味化合物，特別是關(guān)鍵香氣活性化合物的種類和含量，從而改善了泡豇豆整體感官品質(zhì)。此外，混合接種分別將亞硝酸鹽和生物胺的濃度降低了5%～12%和6%～12%。

3 發(fā)酵蔬菜菌群調(diào)控措施

蔬菜發(fā)酵過程中，原料的選擇和處理、鹽、發(fā)酵溫度、抑菌劑、物理殺菌等因素都會影響微生物群落，導(dǎo)致產(chǎn)品的感官和保藏特性發(fā)生變化。對于發(fā)酵蔬菜的工業(yè)化生產(chǎn)來說，控制、優(yōu)化這些影響因素是保證產(chǎn)品品質(zhì)的重要途徑。

3.1 原料選擇和處理

原料是發(fā)酵蔬菜乳酸菌的重要來源，且原料成分含有特定的營養(yǎng)或抗菌物質(zhì)，對微生物群落及其代謝產(chǎn)物有重要影響。孫小靜等[32]通過分析不同辣椒品種對辣椒醬發(fā)酵品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)不同品種辣椒因其成分的差異，對發(fā)酵過程中的pH值、酸度、亞硝酸鹽、可溶性糖含量的變化等均呈現(xiàn)一定的影響，而這些差異綜合導(dǎo)致了成品辣椒醬的品質(zhì)不一。發(fā)酵蔬菜的配料對微生物群落也有一定影響。有研究表明，添加辣椒粉會導(dǎo)致韓國泡菜發(fā)酵過程減慢，尤其是在發(fā)酵初期，并且維持較高的魏斯氏菌豐度以及較低的明串珠菌和乳桿菌的豐度[7]。

除了選擇適宜的原料之外，還可對原料進(jìn)行減菌處理，通過減少有害菌群的數(shù)量，促進(jìn)乳酸菌的生長。時永杰[33]考察了食鹽、乙酸、臭氧等對辣椒原料減菌的影響，最終選用15%的食鹽溶液浸泡10 min作為減菌工藝。用此工藝對樣品進(jìn)行減菌后，12 h后的減菌率在80%以上，可降低辣椒發(fā)酵過程中雜菌污染的概率。

3.2 發(fā)酵溫度

由于不同乳酸菌生長特性因溫度而異，溫度對發(fā)酵蔬菜中乳酸菌群落的動態(tài)發(fā)展有重要影響。腸膜明串珠菌在發(fā)酵的前期是優(yōu)勢乳酸菌，其最適生長溫度25 ℃，當(dāng)環(huán)境溫度升高時，其生長優(yōu)勢減弱，異型乳酸發(fā)酵時間縮短，不利于泡菜風(fēng)味的形成[34]。盧沿鋼[35]以植物乳桿菌、短乳桿菌、腸膜明串珠菌這3株菌復(fù)配進(jìn)行蘿卜泡菜發(fā)酵，研究發(fā)現(xiàn)隨發(fā)酵溫度的升高，泡菜發(fā)酵越快，產(chǎn)酸量越大，在36與40 ℃下發(fā)酵，泡菜酸度在第2天就接近0.4%，達(dá)到成熟。泡菜在低于25 ℃下發(fā)酵時菌株生長和產(chǎn)酸較慢，而在35 ℃以上進(jìn)行發(fā)酵時，泡菜在前期的產(chǎn)酸量突出，但是高溫及較高的酸性環(huán)境不利于腸膜明串珠菌的生長，后期泡菜酸度變化不明顯，感官評定時發(fā)現(xiàn)由于產(chǎn)酸過快，此類泡菜產(chǎn)品滋味較差，酸味太濃，香氣不正，甚至有如臭雞蛋的氣味等。因此，選擇32 ℃發(fā)酵，既能縮短發(fā)酵周期也最符合感官品質(zhì)的要求。MHEEN等[36]研究了不同鹽含量下泡菜的pH和酸度隨溫度的變化，發(fā)現(xiàn)在20 ℃時，pH隨酸度的增加而急劇下降，但在10 ℃時，pH和酸度的變化較慢。泡菜在20和15 ℃時產(chǎn)生的最大酸度為1.6%，但在10 ℃時不會超過1.2%。通過感官評估確定了泡菜最佳成熟期的pH值和酸度分別為4.2～4.5和0.6%～0.8%(以乳酸計)。并發(fā)現(xiàn)鹽含量和發(fā)酵溫度共同決定發(fā)酵周期，在20 ℃、鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.25%，最佳成熟期2 d，最佳食用期為1～3 d；鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)7%，最佳成熟期為10 d，最佳食用期為1～16 d。在較低的溫度下，最佳的成熟期和最佳食用期要長于在更高的溫度時。在5 ℃和5.0%以上的鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，泡菜的成熟非常緩慢，鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.0%時，即使發(fā)酵180 d也未成熟。張會生[1]采用直投式乳酸菌發(fā)酵西蘭花泡菜發(fā)現(xiàn)溫度過低會抑制乳酸菌的生長繁殖，不利于泡菜中酸的積累。溫度過高會影響乳酸菌的酶系統(tǒng)，不利于代謝產(chǎn)物的積累，最佳發(fā)酵溫度為30 ℃。柳建華[37]在優(yōu)化涼薯泡菜工藝中發(fā)現(xiàn)，在25和30 ℃下發(fā)酵，涼薯泡菜的Vc含量要高于15和20 ℃時，可能是在這2個溫度條件下，泡菜中的乳酸菌繁殖得更好，而乳酸菌的繁殖有利于泡菜中Vc的保護(hù)，從而導(dǎo)致泡菜發(fā)酵終點時Vc含量稍高。

3.3 食鹽含量

食鹽含量對泡菜微生物菌群影響甚大。MHEEN等[36]指出，泡菜的最佳鹽含量約為2.0%～3.0%，如果低于最佳鹽含量，發(fā)酵會進(jìn)行得過快，從而導(dǎo)致酸化和軟化；而隨食鹽鹽含量的增大，乳酸菌的活性受到抑制，泡菜發(fā)酵速度變慢，發(fā)酵周期越延長。XIONG等[38]開展了不同鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)(2%、5%、8%)對中國傳統(tǒng)酸菜發(fā)酵特性的影響，研究表明合適的鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)(5%)可以有效地抑制真菌和大腸桿菌的繁殖，而高鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)(8%)會延遲酸菜的成熟并抑制乳酸菌的代謝。ZHANG等[39]采用低鹽(1%～3%)，中鹽(4%～5%)和高鹽(10%)發(fā)酵泡菜，在泡菜發(fā)酵的初始階段分別接種了4種食源性病原體，通過測定pH和酸度發(fā)現(xiàn)在25 ℃時，天然乳酸菌在低鹽泡菜中表現(xiàn)出較高的生長速率，其代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸和細(xì)菌素導(dǎo)致病原菌在發(fā)酵后4 d內(nèi)減少了5個數(shù)量級。除了脆度以外，低鹽泡菜具有良好的感官品質(zhì)。AHMADSAH等[40]采用PCR-DGGE監(jiān)測低鹽(1.0%～2.1%)對泡菜發(fā)酵過程中微生物的影響及樣品的感官接受度，發(fā)現(xiàn)泡菜在各種鹽含量中pH值、酸度、活細(xì)胞計數(shù)、大腸桿菌計數(shù)和乳酸菌分布相似，但經(jīng)過感官評定鹽含量為1.3%時感官接受度最好。

3.4 其他抑菌劑

隨著人們健康意識的提高，運用天然抑菌劑改進(jìn)發(fā)酵蔬菜制作工藝或減緩過度發(fā)酵而延長保質(zhì)期是目前重要的研究方向。發(fā)酵蔬菜菌群對酸度的敏感度存在差異，可通過酸度調(diào)節(jié)菌群的生長。有研究證明了四川泡菜10年以上老鹵水酸度與其菌群的對應(yīng)關(guān)系，隨著酸度增加，細(xì)菌多樣性降低。與鹵水酸度呈正相關(guān)的耐酸乳桿菌是主要優(yōu)勢物種，其次是短乳桿菌，其與乙酸呈正相關(guān)。酸度較低的樣品具有更高的細(xì)菌多樣性和更多種相對豐度>1%的乳桿菌以及更多條件致病菌[41]。在蔬菜自然發(fā)酵過程中，適量添加有機(jī)酸可抑制部分腐敗菌的生長，促進(jìn)乳酸菌形成優(yōu)勢，有利于發(fā)酵蔬菜的質(zhì)量控制，縮短發(fā)酵時間。

多種植物來源的抑菌成分被成功應(yīng)用于發(fā)酵蔬菜的制作中。KIM等[42]在泡菜發(fā)酵過程中添加白葡萄酒，可降低食鹽的添加量，提高泡菜的硬度，且白葡萄酒被認(rèn)為可以去除泡蘿卜中含硫化合物引起的氣味。葡萄柚籽提取物(grapefrurt seed extract,GFSE)是一種天然抗菌劑，可有效抑制多種微生物的生長，且毒性低(LD50=2 900 mg/kg)，已被用作各種食品的防腐劑。PARK等[43]向泡菜中添加了0(對照)、0.1%、0.3%和0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的GFSE，并測量了30 d發(fā)酵過程中pH值、酸度、還原糖含量和微生物種群的變化。結(jié)果顯示隨著發(fā)酵的進(jìn)行，含有較高含量GFSE的泡菜的酸度較低，還原糖消耗較低；發(fā)酵30 d后，對照泡菜和含0.5%GFSE的泡菜的還原糖含量分別為0.2%和1.7%。當(dāng)添加量為0.3%時，泡菜的貨架期在10 ℃時至少可以從5 d延長到20 d。綠茶葉中的主要成分是兒茶素，其對食源性細(xì)菌具有抗菌活性。WEE等[44]研究了從綠茶葉中制備的兒茶素粉對韓國泡菜發(fā)酵中微生物的拮抗活性，結(jié)果表明，當(dāng)綠茶兒茶素粉添加量為2 mg/g時，可抑制植物乳桿菌的生長，泡菜pH值和酸度變化受到明顯抑制，可以延長泡菜的保質(zhì)期。

KIM等[45]研究了殼聚糖對泡菜發(fā)酵的影響，制備包含0(對照)或0.5%殼聚糖(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的泡菜，并在10 ℃發(fā)酵10 d的過程中測定pH和酸度。泡菜的初始pH值、酸度分別為6.0、0.2%。發(fā)酵4 d后，對照泡菜的pH值約為4.0，而含殼聚糖的泡菜pH約為5.0；在發(fā)酵的第10天，對照泡菜的酸度為1%，而含殼聚糖的泡菜為0.7%。結(jié)果表明，殼聚糖可以用作防腐劑，以延長泡菜的保質(zhì)期。

nisin能有效抑制多種病原微生物和食物腐敗菌，具有熱穩(wěn)定性好、對蛋白酶敏感、能被人體蛋白酶降解、對人體無毒副作用、與抗生素?zé)o交叉拮抗作用等優(yōu)點[46]。CHOI[47]向乳酸菌培養(yǎng)物添加不同濃度的nisin，在20 ℃下多數(shù)植物乳桿菌株的生長被延遲了2～3 d。當(dāng)向泡菜發(fā)酵過程中添加100 IU/mL的nisin時，實驗組比對照組延遲2 d達(dá)到最佳食用pH(4～5),并通過掃描電鏡觀察到nisin在細(xì)胞表面形成孔而迅速破壞乳酸菌細(xì)胞壁。CHOI[48]通過研究nisin對泡菜發(fā)酵中天然菌群的影響，發(fā)現(xiàn)與未經(jīng)處理的泡菜相比，添加nisin時乳酸菌數(shù)量從未超過5×107CFU/mL，泡菜發(fā)酵液的pH保持在4.8以上。

3.5 物理保藏技術(shù)

蔬菜發(fā)酵完成后，選用適當(dāng)?shù)谋２丶夹g(shù)控制儲存過程中微生物引起的不良感官變化，也是發(fā)酵蔬菜調(diào)控工藝的一個重要環(huán)節(jié)。蔣和體等[49]對四川泡菜進(jìn)行了微生態(tài)保藏技術(shù)研究，發(fā)現(xiàn)以低還原糖的蔬菜為原料,發(fā)酵成熟后調(diào)味并真空包裝(0.095 MPa)，0～10 ℃冷藏，3個月后仍能保持泡菜固有的優(yōu)良品質(zhì)，并維持乳酸菌數(shù)在104CFU/g。吳錦鑄等[50]研究表明加熱殺菌不適宜泡菜、酸菜的貯藏，酸菜在殺菌后(即使70～80 ℃處理10 min的較低強(qiáng)度)，其色澤、香味、質(zhì)地等均受到不同程度的影響，如加速褐變，脆度降低，香氣損失，風(fēng)味變劣等。近年來，非熱殺菌技術(shù)逐漸受到關(guān)注，該技術(shù)處理溫度低，對食品的風(fēng)味、色澤和營養(yǎng)成分影響較小，避免了傳統(tǒng)熱殺菌技術(shù)造成的食品品質(zhì)劣變問題。現(xiàn)在常用非熱物理處理技術(shù)主要包括使用超高壓、脈沖電場、紫外線、低溫等離子體和伽馬射線。PARK等[51]研究發(fā)現(xiàn)在冷凍溫度下，特別是在干冰下用伽馬射線照射泡菜時，泡菜的質(zhì)地軟化和感官品質(zhì)的下降得以減少。BAO等[52]研究發(fā)現(xiàn)500 MPa超高壓持續(xù)5 min處理泡蘿卜后，菌落總數(shù)降低了5.57個數(shù)量級，霉菌和酵母則完全失活。ZHAO等[53]使用低溫等離子體殺菌可以選擇性地將產(chǎn)氣酵母降低4個數(shù)量級而乳酸菌不受影響，與巴氏殺菌相比可以減輕泡菜的褐變與軟化，并減少儲藏期間亞硝酸鹽含量的增加。雖然非熱殺菌技術(shù)對產(chǎn)品品質(zhì)的影響較小,但是由于投入成本高、生產(chǎn)效率低等問題,該類技術(shù)在工業(yè)化生產(chǎn)中普及度不高。

4 結(jié)語

蔬菜發(fā)酵過程的菌群調(diào)控是控制發(fā)酵蔬菜品質(zhì)的關(guān)鍵技術(shù)，通過應(yīng)用功能菌種和控制關(guān)鍵環(huán)境影響因素，發(fā)酵蔬菜的工業(yè)生產(chǎn)可實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，產(chǎn)品附加值可以得到提升。然而盡管科技人員對此開展了大量的研究工作，目前生產(chǎn)中仍然存在由于微生物調(diào)控不精準(zhǔn)所引起的問題，突出表現(xiàn)在工業(yè)生產(chǎn)的發(fā)酵蔬菜多數(shù)不及天然手工發(fā)酵蔬菜風(fēng)味完整濃郁。傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜生產(chǎn)涉及到復(fù)雜的菌群結(jié)構(gòu)及其動態(tài)變化，所產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)豐富多樣，而接種限定組成的菌種較難達(dá)到原有的風(fēng)味特征。面對這樣的挑戰(zhàn)，近年來蓬勃發(fā)展起來的多組學(xué)技術(shù)可以揭示自然狀態(tài)下微生物菌群影響蔬菜發(fā)酵的分子機(jī)制，有助于解析傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜核心菌群的相互作用關(guān)系和特征風(fēng)味活性物質(zhì)的代謝形成機(jī)制，為實現(xiàn)菌群的精準(zhǔn)調(diào)控提供理論依據(jù)。本文綜述了國內(nèi)外發(fā)酵蔬菜在菌種選育應(yīng)用和菌群調(diào)控方面的研究進(jìn)展，以期為我國發(fā)酵蔬菜產(chǎn)品的品質(zhì)提升和工藝改進(jìn)提供一定的借鑒，推動傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜產(chǎn)業(yè)的升級改造。