微生物富集有機(jī)硒研究進(jìn)展

殷嫻，邵蕾娜，廖永紅，王鳳寰

(北京工商大學(xué) 輕工科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京，100048)

硒(Se)是生物體不可或缺的微量元素，缺乏和過量均引發(fā)人體多種疾病。適量的硒攝入具有抗氧化和抗癌作用，可提高人體免疫力，對(duì)預(yù)防心血管疾病具有積極作用。硒的生物利用率隨硒形態(tài)種類差別而變化。硒有多種形態(tài)，無機(jī)態(tài)有3種價(jià)態(tài)，分別為Se(-Ⅱ)、Se(+Ⅳ)和Se(+Ⅵ)，硒酸鹽和亞硒酸鹽可以作為硒源類營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，但吸收率較低，毒性較大；單質(zhì)硒包括若干個(gè)同素異形體，分別為黑色、紅色、灰色和無定形單質(zhì)硒，當(dāng)氧化態(tài)硒被還原成單質(zhì)硒，溶液中會(huì)出現(xiàn)紅色渾濁，紅色單質(zhì)硒具備生物學(xué)活性，可以形成納米硒，用于醫(yī)療和營(yíng)養(yǎng)；有機(jī)硒則具有更多形式，包括硒代氨基酸、含硒蛋白、硒多糖、硒核酸和各種甲基化硒，由生物體經(jīng)各種代謝產(chǎn)生，通常有機(jī)硒更易被吸收。本文對(duì)各類有機(jī)硒的合成途徑及不同類別微生物富硒方式進(jìn)行綜述。

1 有機(jī)硒的主要形式

1.1 硒代氨基酸、硒蛋白及含硒蛋白

鑒于硒元素與硫元素(S)的化學(xué)性質(zhì)相似，無機(jī)硒經(jīng)生物體的硫代謝途徑轉(zhuǎn)變?yōu)橛袡C(jī)硒，并行使生物學(xué)功能。富硒產(chǎn)物中占比較大的是硒代氨基酸，主要為硒代甲硫氨酸(SeMet)和硒代半胱氨酸(SeCys)(圖1)。它們分別是甲硫氨酸(Met)和半胱氨酸(Cys)中的硫原子被替換為硒原子，替換前后氨基酸化學(xué)性質(zhì)相近，因此可取代Met和Cys摻入蛋白，形成含硒蛋白。此外，硒蛋白的合成需要特殊的蛋白翻譯機(jī)制，目前發(fā)現(xiàn)人體中共有25種硒蛋白，均利用SeCys為活性中心氨基酸。在某些植物和微生物中還會(huì)積累甲基硒代半胱氨酸(SeMeCys)[1]。

圖1 硒代氨基酸的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of seleno-amino acids

微生物胞內(nèi)積累硒始于轉(zhuǎn)運(yùn)。微生物吸收硒主要依賴于硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，例如釀酒酵母的Sul1p和Sul2p轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。此外，ABC泵、磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)也可以轉(zhuǎn)運(yùn)硒。ABC泵利用水解ATP提供能量來轉(zhuǎn)運(yùn)含硒離子，大腸桿菌(Escherichiacoli)中相關(guān)的編碼基因?yàn)閏ysAWTP操縱子，轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體包括2個(gè)CysA結(jié)合于ATP，2個(gè)膜內(nèi)蛋白(CysT和CysW)以及在周質(zhì)空間的硫酸結(jié)合蛋白CysP；釀酒酵母的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Pho84p和Pho89p在低磷酸鹽環(huán)境中主導(dǎo)亞硒酸鹽的結(jié)合。在高磷酸鹽環(huán)境中，硒轉(zhuǎn)運(yùn)逐漸依賴于Pho87p、Pho90p和Pho91p；同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Jen1p可轉(zhuǎn)運(yùn)單羧酸，也能夠介導(dǎo)亞硒酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)，轉(zhuǎn)運(yùn)原理基于硒酸鹽負(fù)離子與羧酸負(fù)離子在結(jié)構(gòu)上的相似性，并具有相似的解離常數(shù)，在生理pH下，它們都是帶一個(gè)單位負(fù)電荷的離子[2]。

硒進(jìn)入細(xì)胞后，硒酸鹽由ATP 硫酸化酶催化轉(zhuǎn)變?yōu)橄佘挣Ｎ?APSe)，隨后在激酶的作用下形成磷酸腺苷酰硒酸(PAPSe)，由PAPSe還原酶催化形成亞硒酸鹽，再由亞硫酸還原酶催化亞硒酸鹽，形成硒化氫(H2Se)。H2Se是微生物細(xì)胞中各種形態(tài)硒代謝合成的主要中間代謝物，最終形成各種包括硒代氨基酸在內(nèi)的有機(jī)硒[3]。

H2Se與高半胱氨酸合成酶結(jié)合，并與O-琥珀酰高絲氨酸(O-Sul-HSer)反應(yīng)，生成硒代高半胱氨酸(SeHCys)和琥珀酸。隨后SeHCys由高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶催化產(chǎn)生SeMet。在有氧條件下，SeMet可以轉(zhuǎn)變成硒代腺苷甲硫氨酸(SeAM)，該步驟由S-腺苷甲硫氨酸合成酶催化。隨后SeAM經(jīng)過酶催化的甲基轉(zhuǎn)移，形成硒代腺苷高半胱氨酸(SeAHCys)，再經(jīng)過水解重新形成硒代高半胱氨酸(SeHCys)，最后在胱硫醚-β-裂解酶和胱硫醚-γ-合酶的相繼作用下先轉(zhuǎn)化為硒代胱硫醚(SeCysT)，隨后轉(zhuǎn)化為SeCys[4]。SeCys也可以由半胱氨酸合酶催化，以絲氨酸(Ser)為前體進(jìn)行合成。

在某些蕈菌中，還能檢測(cè)到SeMeCys。其合成途徑并不明確，但SeMeCys在植物中的合成在于SeCys與S-腺苷甲硫氨酸(SAM)反應(yīng)，由甲基轉(zhuǎn)移酶催化，轉(zhuǎn)化為SeMeCys和S-腺苷高硒代半胱氨酸。

當(dāng)微生物從培養(yǎng)基中攝取無機(jī)硒，通過上述代謝過程在胞內(nèi)積累SeMet和SeCys(圖2)，它們可以在蛋白質(zhì)合成過程中，隨機(jī)替代Met和Cys參與翻譯過程，形成含硒蛋白。因此相對(duì)于其他只存在游離形式的硒代氨基酸，SeMet和SeCys的胞內(nèi)含量更高。

①高半胱氨酸合酶途徑；②半胱氨酸合酶途徑；DiP，二磷酸鹽；APSe，腺苷酰硒酸；PAPSe，磷酸腺苷酰硒酸；O-Sul-HSer，O-琥珀酰高絲氨酸；Sul，琥珀酸；SeHCys，硒代高半胱氨酸；SeMet，硒代甲硫氨酸；S-MMet，S-甲基甲硫氨酸；SeAM；Pi，磷酸；硒代腺苷甲硫氨酸；SeAHCys，硒代腺苷高半胱氨酸；Ade，腺嘌呤；SeCysT，硒代胱硫醚；2-OB，2-氧代丁酸鈉；SeCys，硒代半胱氨酸；SeMeCys，甲基硒代半胱氨酸圖2 微生物硒代氨基酸的合成路徑Fig.2 Synthetic pathway for seleno-amino acids by microrganisms

不同生物的硒代氨基酸代謝途徑存在差異，酵母的半胱氨酸合酶途徑較弱，主要通過高半胱氨酸合酶途徑，實(shí)現(xiàn)SeCys的合成和SeMet的大量積累[5]。而大腸桿菌主要通過半胱氨酸合酶途徑生成SeCys，突變半胱氨酸合酶基因后，游離態(tài)Cys和SeCys的合成受阻[6]。

硒蛋白的合成則需要特殊的細(xì)胞機(jī)制，SeCys特異地?fù)饺氲鞍踪|(zhì)，形成在所有生命體中均具有重要作用的硒蛋白。攜帶SeCys的tRNA為硒代半胱氨酰-tRNA(selenocysteyl-tRNASec)，是由絲氨酰-tRNA(seryl-tRNASec)與硒磷酸相連接而形成。SeCys利用了終止密碼子UGA作為三聯(lián)體密碼，當(dāng)UGA下游存在SECIS元件(硒代半胱氨酸插入序列)時(shí)，該終止密碼子可以被特殊的轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別，從而轉(zhuǎn)變?yōu)槲腚装彼崦艽a子[7]。硒蛋白都具有很重要的生理功能，所以硒是生命的必需微量元素。

1.2 納米單質(zhì)硒和硒多糖

微生物在代謝過程中產(chǎn)生的納米硒可以作為高生物活性和低毒性的硒產(chǎn)品，具有潛在的生物醫(yī)藥功能，同時(shí)可以作為抗菌素，有望成為抗生素的替代產(chǎn)品。化學(xué)合成的紅色納米硒并不穩(wěn)定，在水溶液中易于聚集并轉(zhuǎn)化為其他不活潑的形式，為加強(qiáng)納米硒的穩(wěn)定性，多種多糖被用于修飾納米單質(zhì)硒。而微生物產(chǎn)生的納米單質(zhì)硒由于天然包裹了生物大分子在納米顆粒外圍，因此不易聚集、穩(wěn)定性好，為此將納米單質(zhì)硒也歸于有機(jī)硒進(jìn)行介紹。

單質(zhì)硒在細(xì)胞內(nèi)的合成，主要依賴谷胱甘肽氧化還原系統(tǒng)。四價(jià)硒自發(fā)與還原態(tài)的谷胱甘肽(glutathione，GSH)反應(yīng)，形成了GS-Se-SG和氧化形式的谷胱甘肽(GSSG)。GSSG是有害的，會(huì)氧化含巰基蛋白形成二硫化合物，因此需要迅速被谷胱甘肽還原酶還原成GSH。GS-Se-SG則被轉(zhuǎn)化為GS-Se-H。GS-Se-H的去路有2條，一是轉(zhuǎn)變?yōu)镠2Se，同時(shí)形成GSSG；另一條去路是GS-Se-H由超氧化物歧化酶催化轉(zhuǎn)變?yōu)閱钨|(zhì)硒，該通路被廣泛認(rèn)為是生物還原亞硒酸鹽形成單質(zhì)硒的主要模式[8](圖3)。

GSH-還原型谷胱甘肽；GSSG-氧化型谷胱甘肽；GSSeSG-硒化谷胱甘肽圖3 谷胱甘肽介導(dǎo)的單質(zhì)硒合成途徑Fig.3 Glutathione mediated pathway for elemental Se synthesis

另一種單質(zhì)硒合成系統(tǒng)包括SeCys和來自于棕色固氮菌(Azotobactervinelandii)的NifS蛋白，該蛋白可以將H2Se轉(zhuǎn)化為硒磷酸。大腸桿菌中也發(fā)現(xiàn)了3個(gè)NifS類蛋白(CsdB、CSD和lscS)，其具有硒代半胱氨酸裂解酶的作用，促進(jìn)還原SeCys合成單質(zhì)硒[9]。

在革蘭氏陰性菌Thaueraselenatis中，無氧呼吸和亞硒酸鹽的還原同時(shí)進(jìn)行。由醌池提供電子，經(jīng)細(xì)胞色素C傳遞給周質(zhì)延胡索酸還原酶，最終實(shí)現(xiàn)亞硒酸鹽被還原為單質(zhì)硒[10]。

在微生物所能適應(yīng)的較高硒濃度下，大部分微生物均可合成納米單質(zhì)硒，合成的納米硒外圍包裹的生物大分子，包括蛋白、多糖、核酸、脂質(zhì)等。已經(jīng)鑒定到的納米硒結(jié)合蛋白包括半金屬還原酶[11]、硒因子A[8,12]和硒結(jié)合蛋白等。多糖-蛋白復(fù)合物也可以包裹納米硒顆粒，這種包裹作用是由納米顆粒上的多糖羥基和蛋白質(zhì)氨基之間的物理吸附形成的，幫助納米顆粒通過細(xì)胞的胞吞作用增強(qiáng)吸收。

微生物合成的多糖結(jié)合或包裹單質(zhì)硒，則形成單質(zhì)硒多糖復(fù)合物(圖4-a)，成為硒多糖。外圍結(jié)合具有生物活性的多糖形成的納米單質(zhì)硒，具備生物兼容性和生物可降解性，而多糖的種類、顆粒直徑、硒含量和聚糖的生物活性都對(duì)穩(wěn)定納米硒有影響。硒多糖的另一種形式是無機(jī)硒與多糖共價(jià)結(jié)合，形成硒化多糖，如硒化卡拉膠(圖4-b)。硒多糖作為新的功能性多糖，主要具有抗腫瘤、抗病毒和增強(qiáng)免疫力等作用。

a-單質(zhì)硒多糖復(fù)合物；b-硒化多糖(以硒化卡拉膠為例)圖4 硒多糖的類型Fig.4 Types of selenium polysaccharides

2 微生物對(duì)硒的富集作用

2.1 細(xì)菌對(duì)硒的富集作用

微生物是人類食物鏈的重要成員，一方面，微生物在食品發(fā)酵和生物合成中作為細(xì)胞工廠；另一方面腸道微生物在消化道內(nèi)定居共生從而對(duì)人體健康起重要作用。微生物富硒一直是硒生物轉(zhuǎn)化關(guān)注的熱點(diǎn)，細(xì)菌、酵母、霉菌和蕈菌都可以在無機(jī)硒的環(huán)境中生長(zhǎng)并對(duì)其進(jìn)行同化，而不同的微生物中主要的有機(jī)硒形式存在差別。細(xì)菌結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，具有很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力，各種極端環(huán)境都可尋覓到其蹤影，在人體和環(huán)境的硒循環(huán)中具有非常重要的作用，可以通過代謝合成各種形態(tài)硒(表1)，而其中的富硒益生菌無疑是理想的硒源補(bǔ)充劑。

表1 細(xì)菌富硒情況Table 1 Selenium enrichment of bacteria

2.1.1 益生菌

益生菌在發(fā)酵食品領(lǐng)域占據(jù)統(tǒng)治地位，乳酸菌和雙歧桿菌是受關(guān)注最多的益生菌。此外其他革蘭氏陽性菌，如糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)等也在食品工業(yè)中有重要應(yīng)用。已經(jīng)報(bào)道的可以富硒的益生菌包括乳桿菌屬、乳球菌屬、雙歧桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、腸球菌屬和芽孢桿菌屬等菌株。

亞硒酸鹽是益生菌富硒最常用的硒源，益生菌對(duì)亞硒酸鹽的耐受性在1.4～120 mmol/L之間，糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenesfaecalis)對(duì)硒的耐受力最高[15]，此外芽孢桿菌屬菌株也有較高的亞硒酸鹽耐受性[23]。

富硒量受培養(yǎng)基初始pH、硒添加量、硒添加時(shí)間和培養(yǎng)溫度的影響。保加利亞乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckiissp.bulgaricus)和嗜熱鏈球菌的培養(yǎng)溫度分別為33和40 ℃，培養(yǎng)基初始pH接近6，硒添加量約6%時(shí)，硒轉(zhuǎn)化率可達(dá)94%以上[17]。枯草芽孢桿菌最佳富硒條件則為培養(yǎng)溫度37 ℃，培養(yǎng)基pH 7.0，硒添加量為6 mg/L，硒添加時(shí)間為接種后3 h[21]。其中，硒的最適添加量差異較大，在1～500 mg/L之間,硒的添加時(shí)間會(huì)影響總硒的生成，在菌體剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期添加硒可以獲得最大富硒量。較高的溶氧也利于提高谷胱甘肽還原酶活性，胞內(nèi)還原能力的增加利于單質(zhì)硒的形成，從而增加富硒量。

副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)ML13和CH135的富硒能力最高，分別達(dá)到38.1和40.7 mg/g[16]。而乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)的富硒能力較低，當(dāng)硒添加量為4 mg/L時(shí)，富硒量?jī)H為1.45 mg/g[18]。

乳酸鏈球菌(Lactococcus)、魏斯氏菌(Weissella)、明串珠菌(Leuconostoc)、乳桿菌(Lactobacillus)、腸球菌(Enterococcus)和果聚糖桿菌(Fructobacillus)等菌株富硒時(shí)，胞內(nèi)SeCys含量在0.015～0.88 mg/L之間[13]。雙歧桿菌從環(huán)境中吸收無機(jī)硒，胞內(nèi)SeMet是最主要的硒化物形式，含量占總硒的87%[14]，大部分有機(jī)硒(50.7%～63.0%)存在于蛋白中，9.62%～18.7%有機(jī)硒與多糖結(jié)合，0.273%～0.754%有機(jī)硒與核酸結(jié)合，還有20.8%～30.9%的有機(jī)硒以其他形式存在[20]。不同的硒源對(duì)代謝產(chǎn)物有重要的影響，唾液鏈球菌(Streptococcussalivarius)K12、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)67B、嗜酸乳桿菌(Lacobacillusacidophilus)L10和乳雙歧桿菌(Bifidobateriumlactis)LAFTI B94在SeMet充沛的環(huán)境中可以形成二甲基二硒和二甲基硒，而在亞硒酸鹽環(huán)境中主要形成二甲基硒、二甲基二硒和單質(zhì)硒[25]。

富硒菌株在透射電鏡下多能觀察到單質(zhì)納米硒。干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)ATCC 393胞內(nèi)的納米硒直徑在50～80 nm之間，結(jié)合在蛋白和多糖上。糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenesfaecalis)菌株Se03形成的納米單質(zhì)硒結(jié)合在胞外，直徑為(273.8±16.9) nm，胞內(nèi)亞硫酸還原酶和硫氧還蛋白可能與亞硒酸鹽的還原及硒單質(zhì)的形成有關(guān)[15]。在含硒的條件下，谷胱甘肽還原酶活性普遍升高。富硒后，菌株對(duì)膽酸鹽的抵抗能力和耐酸能力下降[26]。

2.1.2 其他細(xì)菌

大腸桿菌ATCC 35218的納米硒直徑約100～183 nm，顆粒上結(jié)合蛋白質(zhì)[27]。在大腸桿菌中表達(dá)亞硒酸還原酶CsrF有助于納米單質(zhì)硒的形成，其直徑介于60～105 nm，成分包括硒、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)。陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)可以還原結(jié)合在細(xì)胞壁上的硒酸鹽，形成單質(zhì)硒。硒酸鹽還原酶結(jié)合在細(xì)胞膜上，可以對(duì)硒進(jìn)行還原。沼澤紅假單孢菌(Rhodopseudomonaspalustris)對(duì)亞硒酸鈉的耐受力為8 mmol/L，無機(jī)硒濃度在1～8 mmol/L呈梯度增加時(shí)，硒轉(zhuǎn)化率由99.9%下降為2.4%，主要產(chǎn)物為單質(zhì)硒，顆粒直徑約80～200 nm[22]。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)可以合成直徑90～150 nm的納米單質(zhì)硒[28]。

2.2 酵母對(duì)硒的富集作用

酵母具有很強(qiáng)的富硒能力，是目前硒源補(bǔ)充劑的主力，其富硒機(jī)制和富硒方式均有較多研究。培養(yǎng)條件對(duì)釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)富硒有較大影響，pH和溶氧水平是最重要的影響因素。當(dāng)培養(yǎng)基pH降至3.5，產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)CCTCC M 209298胞內(nèi)NADH/NAD+和ATP/ADP的比例提高，并且GSH含量提升，促進(jìn)胞內(nèi)有機(jī)硒含量的增加[4]。此外硒的吸收率和無機(jī)硒的種類與濃度有關(guān)，有機(jī)硒比無機(jī)硒更易于吸收，且毒性更低。高濃度硫酸鹽、磷酸鹽和重金屬會(huì)使酵母對(duì)硒的親和力降低，從而減弱硒的吸收，硒和硫的攝入比例對(duì)胞內(nèi)硒代謝譜產(chǎn)生較大影響。釀酒酵母富集SeMet的最佳培養(yǎng)條件為27.4 ℃，pH 5.8，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期前期硒添加量為50 mg/L時(shí)，酵母富硒量可達(dá)2 354 μg/g[29]。葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)在添加30～180 mg/L亞硒酸鈉的廢糖蜜培養(yǎng)基中，可達(dá)到與釀酒酵母相當(dāng)?shù)母晃縖30]。產(chǎn)朊假絲酵母富硒量為4 019 μg/g，水溶性硒為3 306 μg/g，代謝產(chǎn)生的主要的硒化合物為硒代高羊毛氨酸，占總硒的82.3%，而SeMet僅占總硒的11.6%[31]。在釀酒酵母BY106中，檢測(cè)到的有機(jī)硒主要是SeMet，此外還能檢測(cè)到SeMeCys和2種含硒半乳糖衍生物[32]。膠紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)13B可以在菌體內(nèi)還原硒，細(xì)胞內(nèi)可見單質(zhì)硒沉淀，該過程可用于治理硒污染的水源，對(duì)硒酸鹽進(jìn)行生物修復(fù)[33]。

2.3 霉菌對(duì)硒的富集作用

霉菌在食品、醫(yī)藥和化工領(lǐng)域是非常重要的工業(yè)微生物，其酶系發(fā)達(dá)且分泌能力強(qiáng)，是多種工業(yè)酶制劑的來源，且部分食品安全級(jí)菌株可用于食品發(fā)酵；霉菌易于在貧瘠的環(huán)境中生長(zhǎng)，具有底物廣譜性，可以有效代謝環(huán)境中各種營(yíng)養(yǎng)成分，減少培養(yǎng)成本，是理想的工業(yè)微生物，作為好氧微生物，其代謝過程對(duì)硒污染的環(huán)境修復(fù)也非常重要。霉菌富硒產(chǎn)物主要為納米單質(zhì)硒。

黃曲霉(Aspergillusterreus)對(duì)硒的吸收率為87%[34]。棘殼孢菌(Pyrenochaetasp.)、枝頂孢霉(Acremoniumstrictum)、黃瓜織球殼菌(Plectosphaerellacucumerina)、Stagonosporasp.、鏈格孢(Alternariaalternate)和Paraconiothyriumsporulosum對(duì)0.01 mmol/L 四價(jià)硒的吸收率為85%～93%，但對(duì)0.01 mmol/L六價(jià)硒的吸收率僅為20%～30%，產(chǎn)生的納米單質(zhì)硒的直徑約50～300 nm[35]。黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)則可以同時(shí)吸收碲和硒這2種元素，當(dāng)2種元素的濃度均為10 mg/L，可形成50～600 nm的硒碲顆粒[36]。

不同的霉菌對(duì)富硒培養(yǎng)基種類有不同的要求。鐮刀霉(Fusarium)和里斯木霉(Trichodermareesi)在查氏培養(yǎng)基中可以將亞硒酸鹽還原成單質(zhì)硒。黑曲霉(Aspergillusniger)、毛霉(Mucor)SK和少根根霉(Rhizopusarrhizus)只在麥芽提取物培養(yǎng)基中還原亞硒酸鹽形成單質(zhì)硒[37]。米曲霉(Aspergillusorayzae)可以在廉價(jià)的羽扇豆提取物培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并對(duì)硒進(jìn)行轉(zhuǎn)化，合成納米單質(zhì)硒，直徑約55 nm[38]。

2.4 蕈菌對(duì)硒的富集作用

傘菌綱(Agaricomycetes)生物是研究最多的高等絲狀真菌，對(duì)其富硒方式也進(jìn)行了大量的研究。因?yàn)楹芏噢嗵墙Y(jié)構(gòu)復(fù)雜且具有藥用價(jià)值，故硒多糖的研究較多。

對(duì)市售或野生蕈菌樣本的富硒情況進(jìn)行檢測(cè)，含硒量最低的是花蓋紅菇(Russulacyanoxantha)、硬柄小皮傘(Marasmiusoreades)和雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)，僅約1 μg/g；含硒量最高的夏牛肝菌(Boletusaestivalis)含硒量48.5 μg/g；而褐紅牛肝菌(Boletuspinophilus)、美味牛肝菌(Boletusedulis)和黑牛肝菌(Boletusaereus)含硒量在10～20 μg/g之間[39]。

平菇(Pleurotusostreatus)、香菇(Lentinusedodes)、灰樹花(Grifolafrondosa)、靈芝(Ganodermalucidum)、雙孢蘑菇和草原黑蘑(Agaricusarvensis)可以合成納米單質(zhì)硒，物種和年齡、培養(yǎng)基種類和成分、培養(yǎng)時(shí)間等條件影響納米單質(zhì)硒的形成，直徑在20～550 nm，在培養(yǎng)基和菌絲體中均存在[40]。在另一項(xiàng)研究中，亞硒酸鈉濃度高于0.96 mmol/L可抑制香菇的生長(zhǎng)，在含0.64 mmol/L亞硒酸鈉和桉樹鋸末的培養(yǎng)基中，香菇富硒量為0.17 mg/g[41]。平菇在0.5 mmol/L亞硒酸鹽的培養(yǎng)基中，子實(shí)體可富硒62 μg/g[42]。杏鮑菇(Pleurotuseryngii)的富硒能力稍弱為1.4 μg/g，在體內(nèi)的硒吸收率為15.8%；平菇的富硒量為20.3 μg/g，硒轉(zhuǎn)化率62.5%，在體內(nèi)的硒吸收率為36.0%；用作祛風(fēng)散寒中藥成分的樺革裥菌(Lenzitesbetulina)的硒轉(zhuǎn)化率最低，為8.1%[43]。

香菇的68%富硒產(chǎn)物為水溶性硒，其中，49.8%的水溶性硒結(jié)合于高分子上(>40 000 kDa)，最主要的含硒代氨基酸是SeMet[44]。雙孢蘑菇富硒率可達(dá)51.8 μg/g，86%為有機(jī)硒[45]。對(duì)雙孢蘑菇和香菇蛋白中的硒形態(tài)進(jìn)行了檢測(cè)，水解后的水溶性含硒蛋白利用ICP-MS檢測(cè)到SeCys、SeMet、SeMeCys和無機(jī)硒[46]，SeCys和MeSeCys比SeMet更易被消化，消化釋放率分別為90%、76%和51%[47]。猴頭菇(Hericiumerinaceus)中最主要的硒代謝物也是SeMet，占總硒含量63.9%，除了常見的硒代氨基酸，還檢測(cè)到若干硒代腺苷酸衍生物，其中包括甲基-5硒代腺苷、甲基-5硒代腺苷硒氧化物和二甲基-5-硒代腺苷[48]。對(duì)靈芝的富硒產(chǎn)物進(jìn)行分析，含硒蛋白中的硒約占總硒的56%～61%，硒多糖占11%～18%。此外，水溶和堿溶蛋白是儲(chǔ)存有機(jī)硒的主要形式，游離的SeMet僅占蛋白硒的8.2%～18.3%。硒含量不超過100 μg/g時(shí)，有利于菌體合成蛋白和氨基酸。

利用農(nóng)業(yè)加工副產(chǎn)物或廢棄物進(jìn)行微生物富硒可以降低成本，緩解環(huán)境污染。印度麗蘑(Calocybeindica)在富硒的麥秸上培養(yǎng)可以積累硒，隨著麥秸上亞硒酸鈉含量從2.5 mg/L提高到40 mg/L，子實(shí)體的富硒量也直線提升；在亞硒酸鹽質(zhì)量濃度超過5 mg/L時(shí)，生物量受到抑制。蛋白中的有機(jī)硒占總硒的56%～68%，多糖結(jié)合硒占22%～29%，核酸結(jié)合硒占1.4%～2.7%[49]。佛州側(cè)耳(Pleurotusflorida)在采自富硒地區(qū)的麥秸上生長(zhǎng)，富硒量為141 μg/g，模擬腸道消化實(shí)驗(yàn)顯示，其中的75%可被人體吸收，含硒生物大分子會(huì)被分解為小分子量的硒化合物?？Х葰ひ脖挥脕砼囵B(yǎng)蕈菌，平菇在添加了51 μg/g亞硒酸鈉的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，硒吸收率最高[50]。

3 總結(jié)與展望

本文綜述了微生物中主要積累的有機(jī)硒的種類和合成機(jī)制，以及各類微生物對(duì)硒的富集能力及其控制條件。微生物均主要通過高半胱氨酸合酶途徑和半胱氨酸合酶途徑實(shí)現(xiàn)無機(jī)硒到有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化，富硒產(chǎn)物中，游離的硒代氨基酸含量較低，更多以SeCys和SeMet的形式摻入蛋白。硒蛋白為微生物實(shí)現(xiàn)生理功能所必需，含硒蛋白則富集了更多的硒代氨基酸，然而基于硒代氨基酸摻入正常蛋白可能造成蛋白結(jié)構(gòu)改變，從而引起蛋白失活，因此表現(xiàn)出硒攝入過量對(duì)微生物生長(zhǎng)的抑制作用。納米硒是目前研究的熱點(diǎn)，納米硒是易于吸收且低毒性的硒產(chǎn)品，利用微生物合成的納米硒，由于通常與生物大分子結(jié)合，故不易聚集，穩(wěn)定性更好。

不同微生物由于代謝途徑的差別，富硒能力和有機(jī)硒類別存在差異，且由于自身活性物質(zhì)的差別，具有不同的功效，可以應(yīng)用于不同領(lǐng)域。酵母普遍具有強(qiáng)大的富硒能力，最高富硒量可達(dá)4 mg/g。益生菌的富硒能力參差不齊，副干酪乳桿菌的富硒能力最高可達(dá)40 mg/g，是微生物中目前報(bào)道的最高富硒量。酵母和益生菌中含量最高的有機(jī)硒形式是SeMet，易于消化吸收，通?？捎米魑搭悹I(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑。霉菌和蕈菌的富硒研究則更多在納米硒層面，霉菌的環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，易于在各種貧瘠和毒性環(huán)境中生長(zhǎng)，可用于環(huán)境修復(fù)。蕈菌是可食用的大型絲狀真菌，其富硒能力最高僅約100 μg/g，但其多糖通常具有藥用價(jià)值，故納米硒多糖的合成和應(yīng)用有較廣泛前景，其結(jié)構(gòu)解析、合成機(jī)制和生理功能均需要更明確的闡述。生物體富硒機(jī)制的解析及其控制和應(yīng)用還有很多問題需要解析，比如半胱氨酸合酶受負(fù)反饋調(diào)控，亟需解析代謝通量對(duì)富硒產(chǎn)物的影響。富硒益生菌調(diào)節(jié)宿主腸道微生物的規(guī)律和硒對(duì)共生菌群的維持促進(jìn)作用也值得進(jìn)一步研究。此外，蕈菌富硒形成的硒單質(zhì)在菌絲體內(nèi)部和培養(yǎng)基中均存在，是否存在胞內(nèi)外轉(zhuǎn)運(yùn)及相關(guān)機(jī)制也需要進(jìn)一步明確。微生物種類繁多，在充分了解菌體生長(zhǎng)和富硒方式的情況下，綜合利用群落結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)硒及重金屬污染土壤的修復(fù)將具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。