甲基綠吸收光譜法同時(shí)測(cè)定飲料中的酒石黃和日落黃

江虹,龐向東

(長(zhǎng)江師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，重慶，408100)

食品是人類賴以生存的最基本的物質(zhì)基礎(chǔ)，除應(yīng)具備安全性和營(yíng)養(yǎng)性外，還應(yīng)具備色、香、味。當(dāng)食品中存在對(duì)人體有害因素時(shí)，人攝入后將導(dǎo)致某些疾病的發(fā)生，嚴(yán)重時(shí)可能喪命，因此，近年來(lái)，食品的質(zhì)量安全倍受關(guān)注。食品合成色素酒石黃和日落黃常用于各類食品中，尤其是飲料中常加入了合成色素，以提高感官、增進(jìn)食欲。但著色劑并非越多越好，著色劑添加過(guò)量時(shí)，會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生某些副作用或甚至導(dǎo)致中毒、致癌、死亡。因此，對(duì)夏日大量使用的飲料，我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》嚴(yán)格規(guī)定，飲料中酒石黃和日落黃的添加量均不得超過(guò) 0.10 g/kg。為保障人類的身體健康和生命安全，對(duì)飲料中著色劑含量進(jìn)行研究有著重要意義。近年，國(guó)內(nèi)外對(duì)酒石黃和日落黃的檢測(cè)方法主要有：高效液相色譜法[1-7]、電化學(xué)法[8-15]、熒光法[16-17]及分光光度法[18-21]等。這些方法在酒石黃和日落黃共存時(shí)，需采取某些特殊處理方式，如需吸附和分離處理后才能進(jìn)行各色素的測(cè)定。分光光度分析中，當(dāng)兩色素共存時(shí)，若吸收峰出現(xiàn)較大重疊(即存在相互干擾)時(shí)，也不能進(jìn)行單一物質(zhì)的測(cè)定，常需采用分離操作或根據(jù)吸光度的加和性，采用較繁瑣的解聯(lián)立方程組的辦法來(lái)求得混合色素的含量[20-21]。本研究中的方法既不采用操作復(fù)雜的吸附、分離處理，也不采用復(fù)雜的數(shù)學(xué)處理模式，只需通過(guò)控制溶液酸度，便可達(dá)到用吸收光譜法同時(shí)測(cè)定共存的酒石黃和日落黃含量的目的，方法簡(jiǎn)便、快速，并且迄今未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒石黃(tartrazine， TAR)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度 ≥98%，lot：A3J6L1)、日落黃(sunset yellow，SUN)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度 ≥98%，lot：JN1103RA14)，北京盛世康普化工技術(shù)研究院，北京普析科技有限公司；甲基綠(methyl green， MET)(純度 99%)，上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；氨丁三醇(Tris,純度 99%)，河南天孚化工有限公司；鹽酸(分析純)，重慶川東化工有限公司；超純水，成都優(yōu)普超純水儀制。

飲料樣品：佳得樂(lè)檸檬味(1#)、美年達(dá)香蕉味(2#)、佳得樂(lè)橙味(3#)、纖顏蘋果味(4#)、芬達(dá)橙味(5#)，均購(gòu)自當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

U-3010 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本日立公司；KQ-200VDE 型超聲波清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司；pHS-3C型酸度計(jì)，上海理達(dá)儀器廠。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液與試劑溶液的配制

酒石黃標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取酒石黃標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(±0.000 1 g)，加水溶解并定容至容量瓶中，配制成534.4 mg/L貯備液，操作液為53.44 mg/L，存于4 ℃冰箱中。日落黃標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取日落黃標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(±0.000 1 g)，加水溶解并定容至容量瓶中，配制成452.4 mg/L貯備液，操作液為45.24 mg/L，存于4 ℃冰箱中。甲基綠溶液：653.2 mg/L 水溶液。Tris-HCl 溶液：采用0.20 mol/L Tris 溶液與0.10 mol/L HCl 溶液配制,pH 3.5～9.8。

1.4 樣品處理

準(zhǔn)確移取各飲料樣品30.0 mL，分別置于小燒杯中，在天平上準(zhǔn)確稱取其質(zhì)量(±0.000 1 g)，45 ℃ 超聲處理20 min，加適量水后，再超聲10 min，用NH3·H2O 調(diào)至中性，再于45 ℃ 超聲處理10～15 min，冷至室溫后，用水定容至100 mL，即為待測(cè)液。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

準(zhǔn)確移取酒石黃和日落黃標(biāo)準(zhǔn)操作液適量，分別置于10 mL 比色管中，加入pH 9.43 Tris-HCl 溶液1.00 mL，再加653.2 mg/L 甲基綠溶液2.00 mL，用水定容，搖勻，待充分反應(yīng)15 min 后，在紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)上，以各體系的試劑空白作參比，掃描各溶液的吸收光譜，在574 nm 處測(cè)定酒石黃-甲基綠體系溶液的吸光度(A)，在488 nm 處測(cè)定日落黃-甲基綠體系溶液的吸光度(A)，最終求得各飲料樣品中共存色素——酒石黃和日落黃的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒石黃體系與日落黃體系的吸收光譜特征

從酒石黃和日落黃的結(jié)構(gòu)式可知，兩者均可與甲基綠(三苯甲烷堿性染料)以靜電作用生成離子締合物。

從圖1可知，單獨(dú)的酒石黃溶液和日落黃溶液在可見(jiàn)光區(qū)均有較大吸收，最大吸收峰分別位于426 nm(酒石黃)和480 nm(日落黃)，曲線1 和曲線4 表明，它們的吸收譜線有一定的重疊，當(dāng)兩色素共存時(shí)，因譜線的疊加，互相間有干擾，不能單獨(dú)進(jìn)行某一色素的測(cè)定。但當(dāng)加入甲基綠溶液和pH 9.43 Tris-HCl 溶液后，酒石黃與甲基綠反應(yīng)生成的締合物在可見(jiàn)光區(qū)產(chǎn)生2 個(gè)明顯的負(fù)吸收峰和1 個(gè)明顯的正吸收峰(曲線3)，日落黃與甲基綠反應(yīng)生成的締合物在可見(jiàn)光區(qū)產(chǎn)生2 個(gè)明顯的正吸收峰(曲線5)。曲線3 與曲線5 和曲線2比較，均有波移現(xiàn)象，說(shuō)明酒石黃和日落黃均可與甲基綠反應(yīng)生成新物質(zhì)。從曲線3 與曲線5 的比較可知，在Tris-HCl 溶液酸度相同(均為pH 9.43)和甲基綠濃度、用量相同的情況下，酒石黃-甲基綠體系的測(cè)定波長(zhǎng)為574 nm時(shí)，共存物質(zhì)日落黃不干擾測(cè)定，而在652和450 nm處測(cè)定，日落黃會(huì)有嚴(yán)重干擾；對(duì)于日落黃-甲基綠體系，當(dāng)測(cè)定波長(zhǎng)為488 nm 時(shí)，溶液中共存的酒石黃對(duì)其測(cè)定無(wú)干擾，當(dāng)測(cè)定波長(zhǎng)為648 nm 時(shí)，酒石黃對(duì)其測(cè)定存在嚴(yán)重干擾。酒石黃體系和日落黃體系的線性圖見(jiàn)圖2，吸收光譜特征見(jiàn)表1?？芍?當(dāng)溶液酸度為pH 9.43 時(shí)，可在574 nm 測(cè)定酒石黃(日落黃不干擾)，在488 nm 測(cè)定日落黃(酒石黃不干擾)。該方法與已報(bào)道的文獻(xiàn)[18-21]比較，不需吸附、分離操作，也不用解復(fù)雜的方程組，只需控制好溶液酸度，便可在不同波長(zhǎng)下分別測(cè)定共存色素的含量。

圖1 酒石黃和日落黃與甲基綠反應(yīng)的吸收光譜Fig.1 Absorption spectra of tartrazine and sunset yellow reacted with methyl green

表1 酒石黃-甲基綠體系與日落黃-甲基綠體系的吸收光譜特征Table 1 Characteristics of absorption spectrum of tartrazine-methyl green system and sunset yellow-methyl green system

a-酒石黃;b-日落黃圖2 酒石黃、日落黃和甲基綠體系的線性吸收光譜Fig.2 Linear absorption spectrum of tartrazine and sunset yellow reacted withd methyl green注：甲基綠131 mg/L;試劑空白參比

2.2 反應(yīng)條件

2.2.1 溶液pH 及用量的選擇

取酒石黃、日落黃標(biāo)準(zhǔn)操作液1.00 mL，甲基綠溶液2.00 mL，考察了酒石黃-甲基綠體系與日落黃-甲基綠體系pH 3.5～9.8 的Tris-HCl 溶液對(duì)吸光度的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖3-a可知，當(dāng)測(cè)定波長(zhǎng)為574 nm 時(shí)，酒石黃-甲基綠體系pH 4.42～9.43時(shí)，隨著溶液pH 的增大，體系溶液吸光度絕對(duì)值(|A|)逐漸增強(qiáng)，當(dāng)pH 9.43 時(shí)，|A| 達(dá)最大，之后逐漸減弱；而日落黃-甲基綠體系隨著pH 的增大，|A| 逐漸降低，當(dāng)pH 9.43 時(shí)，|A|= 0.001。

a-574 nm;b-488 nm圖3 溶液pH對(duì)不同測(cè)定波長(zhǎng)下|A|的影響Fig.3 Effect of solution pH on |A| under different wave length

從圖3-b可知，當(dāng)測(cè)定波長(zhǎng)為488 nm 時(shí)，日落黃-甲基綠體系pH 3.59～9.43時(shí)，對(duì)|A|的影響均較大，當(dāng)pH 9.43 時(shí)，|A| 達(dá)最大，之后有所降低；而酒石黃-甲基綠體系除pH 3.59 外，其余pH 對(duì)|A| 影響均不大，當(dāng)pH 9.43 時(shí)，|A|= 0.018?？梢?jiàn)，選用pH 9.43 的Tris-HCl 溶液，不僅靈敏度相對(duì)最大，而且在574 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定酒石黃，日落黃不干擾；在488 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定日落黃，酒石黃不干擾。故可用控制溶液酸度的辦法來(lái)消除共存色素-酒石黃和日落黃間的相互干擾，達(dá)到分別測(cè)定的目的。

同時(shí)考察了pH 9.43 Tris-HCl 用量對(duì)|A| 的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4，用量為1.00 mL 時(shí)，無(wú)論在574 nm 測(cè)定酒石黃，還是在488 nm 測(cè)定日落黃，均有較大靈敏度。實(shí)驗(yàn)選擇在最佳條件下進(jìn)行各項(xiàng)試驗(yàn)。

圖4 Tris-HCl溶液用量對(duì)|A| 的影響Fig.4 Effect of Tris-HCl buffer on|A|

2.2.2 甲基綠溶液用量的選擇

取酒石黃、日落黃標(biāo)準(zhǔn)操作液1.00 mL，pH 9.43 Tris-HCl 溶液1.00 mL，考察了甲基綠溶液(653.2 mg/L)用量對(duì)酒石黃體系和日落黃體系|A| 的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。當(dāng)測(cè)定波長(zhǎng)為574 nm 時(shí)，甲基綠用量對(duì)酒石黃-甲基綠體系的|A| 有較大影響，而對(duì)日落黃-甲基綠體系的|A| 基本無(wú)影響。當(dāng)測(cè)定波長(zhǎng)為488 nm 時(shí)，甲基綠用量對(duì)日落黃-甲基綠體系的|A| 有較大影響，而對(duì)酒石黃-甲基綠體系的|A| 基本無(wú)影響。可見(jiàn)，無(wú)論在574 nm波長(zhǎng)處測(cè)定酒石黃還是在488 nm波長(zhǎng)處測(cè)定日落黃，甲基綠用量為2.00 mL 時(shí)，它們均有相對(duì)較大的靈敏度，且互不干擾。實(shí)驗(yàn)選用甲基綠溶液2.00 mL。

圖5 甲基綠用量對(duì)|A| 的影響Fig.5 Effect of methyl green dosage on|A|

2.2.3 反應(yīng)時(shí)間的選擇

在前述選定的最佳條件下，考察了酒石黃、日落黃與甲基綠的反應(yīng)時(shí)間對(duì)|A| 的影響。結(jié)果表明，酒石黃-甲基綠體系與日落黃-甲基綠體系在15 min 內(nèi)均可反應(yīng)完全，穩(wěn)定時(shí)間約50 min。兩體系均選在15 min 后測(cè)定。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 酒石黃和日落黃的標(biāo)準(zhǔn)曲線及靈敏度

分別準(zhǔn)確移取酒石黃和日落黃標(biāo)準(zhǔn)操作液0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL，分別置于10 mL 比色管中，加入選定條件的pH 9.43 Tris-HCl 溶液1.00 mL 和甲基綠溶液2.00 mL，用水定容、搖勻，15 min 后，各體系以試劑空白作參比，測(cè)定各溶液的吸光度A，作574 nm 處酒石黃的A-ρ標(biāo)準(zhǔn)曲線和488 nm 處日落黃的A-ρ標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)參數(shù)見(jiàn)表2可知，該方法有較高靈敏度和較寬線性范圍。

表2 酒石黃和日落黃標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)參數(shù)Table 2 Related parameters of standard curves of tartrazine and sunset yellow

2.3.2 方法的選擇性

按實(shí)驗(yàn)方法，考察了酒石黃-甲基綠體系在574 nm 處測(cè)定5.34 mg/L 酒石黃，考察了日落黃-甲基綠體系在488 nm 處測(cè)定4.52 mg/L 日落黃，相對(duì)誤差≤±5%，共存物的影響見(jiàn)表3。結(jié)果表明該方法有良好的選擇性。

2.3.3 樣品測(cè)定、準(zhǔn)確度及精密度

取1.4中制備好的待測(cè)液2.00 mL，按實(shí)驗(yàn)方法分析其含量并計(jì)算原始飲料中酒石黃和日落黃的含量，同時(shí)參考文獻(xiàn)方法[21]進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，見(jiàn)表4。

按樣液的配制方法，準(zhǔn)確移取30 mL 各飲料樣品分別置于各小燒杯中，并稱其準(zhǔn)確質(zhì)量(±0.000 1 g)，再分別加入一定量的酒石黃或日落黃標(biāo)準(zhǔn)貯備液，并于45 ℃ 超聲20 min，后續(xù)操作同1.4中樣品處理，最后用水定容至100 mL。取該液2.00 mL，按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定各加標(biāo)回收量，如表4所示。

表3 共存物質(zhì)的影響Table 3 Effect of coexistent substance

表4 市售飲料樣品分析結(jié)果及回收試驗(yàn)(n=5)Table 4 Analysis results and recovery test of commercial beverage samples (n=5)

3 結(jié)論

共存色素酒石黃和日落黃含量的測(cè)定，可以用甲基綠作探針，通過(guò)控制溶液酸度，選擇不同測(cè)定波長(zhǎng)，達(dá)到分別測(cè)定共存物中兩色素的目的。該方法簡(jiǎn)便,不需吸附、分離操作，也不用復(fù)雜的數(shù)學(xué)求解,快速，樣品處理簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度和精密度滿足定量分析要求，并有較高靈敏度和較寬的線性范圍，適用于飲料中共存酒石黃和日落黃含量的測(cè)定。