王明,王逍,陳嘉杰,吳奕萱,柯潤輝
(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司,國家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心,北京,100015)
含有不對稱碳原子的分子被認為是手性分子,其手性中心能以2種旋光異構(gòu)體形式(D-型、L-型或S-型、R-型)存在,稱之為對映體。手性是自然界的重要屬性之一,在生物體中手性分子的2個對映體是以不同的量存在的[1]。近年來,食品領(lǐng)域?qū)ψR別手性對映體的需求不斷增加,特別是香精香料[2]和葡萄酒[3]。手性對映體的研究可以用于質(zhì)量控制,檢測“天然”樣品的摻假,確定產(chǎn)品基質(zhì)的地理來源[4]。純糧白酒的釀造屬于自然發(fā)酵,也有手性分子的存在[5-6],但國內(nèi)外關(guān)于白酒中手性物質(zhì)的研究較少。乳酸乙酯是白酒的四大酯類之一,因其分子中含有不對稱碳原子,存在2種對映體(D-型和L-型),對其進行研究具有重要意義[5]。2,3-丁二醇屬于天然發(fā)酵產(chǎn)物,是白酒中呈甜味物質(zhì)[7],同時起著緩沖平衡的作用,可改善白酒的口感風味[8]。2,3-丁二醇有3種旋光異構(gòu)體,即S-(+)-2,3-丁二醇、R-(-)-2,3-丁二醇、meso-(R,S)-丁二醇(內(nèi)消旋體),其在葡萄酒中主要以R-型和內(nèi)消旋存在[9-10],尚未見有關(guān)白酒中2,3-丁二醇對映體的研究報道。
要研究白酒中的手性物質(zhì),首先要對手性對映體進行拆分,因此選擇合適的手性分離方法至關(guān)重要。手性環(huán)糊精色譜柱的出現(xiàn)對氣相色譜分析對映體具有重要作用[11],因其具備廣泛的對映選擇性和分離不同揮發(fā)物對映體的能力,適用于手性對映體的分離。本文采用一款新型環(huán)糊精手性色譜柱,可分離多種手性對映體且穩(wěn)定性好,但考慮到白酒中過多的水會降低該手性柱的柱效,因此不可對白酒直接進樣分析。在白酒風味分析中常用的前處理方法主要有液液萃取(liquid-liquid extraction,LLE)、固相微萃取(solid phase microextraction,SPME)等[12-13]。LLE操作雖簡單,但其萃取溶劑易與水相發(fā)生乳化現(xiàn)象,導致分析結(jié)果的精密度較低[14]。SPME方法簡便、快速且不需萃取溶劑,但精密度和準確度較低[15]。固相支撐-液液萃取(solid supported-liquid-liquid extraction,SLE)是臨床生物分析實驗室中經(jīng)常使用的一種高效樣品前處理工具[16],既可以排除樣品中水的干擾,又能保證方法的精密度和結(jié)果的準確性,可用于葡萄酒[14]、醬油[17]等液體樣品的前處理。
本文采用SLE前處理技術(shù)對白酒樣品進行萃取,結(jié)合手性環(huán)糊精色譜柱以實現(xiàn)GC-MS分離和定量白酒中乳酸乙酯和2,3-丁二醇的對映體的目的,為研究手性對映體的含量及比例與白酒風味品質(zhì)、來源的關(guān)系建立快速分析方法。
白酒樣品:茅臺王子酒(53%vol,375 mL)、飛天茅臺(53%vol,500 mL)、水晶劍南春(52%vol,500 mL)、瀘州老窖特曲(52%vol,500 mL)、山西杏花村汾酒(42%vol,475 mL)、紅星二鍋頭8年陳釀(43%vol,500 mL),市售。
試劑:D-乳酸乙酯(純度>95%)、L-乳酸乙酯(色譜純,純度≥98%)、S-2,3-丁二醇(色譜純,純度≥97%)、R-2,3-丁二醇(純度>97%)、meso-2,3-丁二醇(色譜純,純度≥99%)、乙酸丁酯(色譜純,純度≥99.8%)、仲辛醇(色譜純,純度≥99.5%)、Celite 545 coarse硅藻土,上海安譜實驗科技股份有限公司;二氯甲烷(分析純)、無水乙醇(分析純)、無水硫酸鈉(分析純)、NaCl(分析純),北京化工試劑廠。
GC-MS-QP2010 Plus氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(AOC5000 自動進樣器),日本島津公司;Milli-QReference 超純水系統(tǒng),美國Millipore公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,上海亞榮生化儀器廠;SE812氮吹儀,北京帥恩科技。
1.3.1 液液萃取(LLE)
量取10.0 mL酒樣并將酒精度稀釋至10%,加NaCl至飽和,用重蒸二氯甲烷萃取3次,每次10.0 mL,合并萃取相。30 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)并氮吹濃縮,無水硫酸鈉除去洗脫液中的水分,取1.0 μL進GC-MS分析[18]。
1.3.2 固相支撐-液液萃取(SLE)
在20.0 mL的萃取柱中填入9.0 g硅藻土,量取10.0 mL酒樣于柱中,靜置10 min,待樣品和硅藻土全部混合,用30.0 mL二氯甲烷進行洗脫,洗脫液用蒸餾燒瓶進行收集。洗脫液收集完畢,30 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)并氮吹濃縮,無水硫酸鈉除去洗脫液中的水分,取1.0 μL進GC-MS分析[19]。
1.4.1 GC條件
所用色譜柱為手性柱Rt-bDEXse(30 m×0.25 mm,0.25 μm),柱溫采用程序升溫:初溫60 ℃,保持10 min 后,以4 ℃/min升至100 ℃,再以10 ℃/min升至200 ℃,保持10 min。進樣口溫度220 ℃,分流比50∶1。
1.4.2 MS條件
MS電離方式為EI,電子能量70 eV,離子源溫度220 ℃,質(zhì)譜掃描范圍m/z35~350。溶劑延遲5 min,檢測方式:選擇離子檢測SIM。各物質(zhì)分別設(shè)定3個特征離子,乳酸乙酯(m/z45定量,m/z43、75定性)、2,3-丁二醇(m/z45定量,m/z75、90定性)、乙酸丁酯(m/z56定量,m/z61、73定性)、仲辛醇(m/z45定量,m/z55、97定性)。
標準加入法和質(zhì)譜法:在白酒中分別加入乳酸乙酯、2,3-丁二醇的旋光異構(gòu)體的標準品,比較標準品加入前后色譜圖上各峰的保留時間以確定目標物的質(zhì)譜峰,然后篩選出特征離子進行質(zhì)譜定性。
取一定量的待測物的標準品,用無水乙醇配制成高質(zhì)量濃度單標后,制成混標,再用無水乙醇將混合后的標準溶液稀釋成多個梯度備用。內(nèi)標法需要選擇合適的物質(zhì)作為內(nèi)標物,將其定量地加入到樣品中作為待測組分的參比物,以目標標準物質(zhì)的質(zhì)量濃度與對應(yīng)內(nèi)標物質(zhì)質(zhì)量濃度之比為橫坐標,以目標標準物質(zhì)的峰面積與內(nèi)標物質(zhì)峰面積之比為縱坐標建立標準曲線,以回歸方程計算樣品中各味物質(zhì)的含量。
采用 SIM 模式定量。分別以5種旋光異構(gòu)體的標準品與內(nèi)標物的質(zhì)量濃度比和峰面積比建立標準曲線。仲辛醇、乳酸丁酯為內(nèi)標物,其在酒樣、系列標準溶液中含量均恒定。定量化合物通過標準曲線進行計算。上述均進行3次平行實驗。
方法檢驗參數(shù)為:線性、檢出限(LOD)、精密度。標準曲線線性以線性相關(guān)系數(shù)(R2)進行評估;檢出限為定量化合物色譜峰信噪比(S/N)大于3對應(yīng)的質(zhì)量濃度。每個樣品連續(xù)進樣3次,以相對標準偏差(RSD)評估精密度。
2.1.1 柱溫的選擇
根據(jù)萃取溶劑和目標物質(zhì)的沸點,考察升溫速率為2 ℃/min、3 ℃/min、4 ℃/min、5 ℃/min,初溫為40、50、60和70 ℃和初溫保留時間5、8、10和15 min等條件的分離效果。確定最佳升溫程序為初始溫度60 ℃,保持10 min,以4 ℃/min的速率升至100 ℃,保持5 min,而后以20 ℃/min升至200 ℃,保持5 min。
2.1.2 流速的選擇
比較了0.7、0.9、1.0、1.2 mL/min的分離效果,發(fā)現(xiàn)流速大于1.0 mL/min時的分離效果略差,因此選擇1.0 mL/min的流速。在上述優(yōu)化條件下,各物質(zhì)標準品的總離子流色譜圖如圖1所示。
1-乙酸丁酯(內(nèi)標);2-D-乳酸乙酯;3-L-乳酸乙酯;4-S-2-3-丁二醇;5-R-2-3-丁二醇;7-meso-2,3-丁二醇;9-仲辛醇(內(nèi)標)圖1 混合標準品的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion flow chromatogram of mixed standard
2.1.3 分流比的選擇
考慮到白酒中乳酸乙酯的含量較高,在樣品分析中選擇分流比50∶1。如圖2所示,在SIM模式下各物質(zhì)在白酒中的提取離子流圖。
SLE是將具有高效、高選擇性和吸附性的硅藻土和待測樣品混合均勻,置入萃取小柱中,然后用萃取溶劑以一定的速率進行洗脫目標檢測物的方法[14]。該技術(shù)充分發(fā)揮硅藻土多孔性、大比表面、低表面活性等特點,實現(xiàn)微觀液液萃取,與傳統(tǒng)LLE應(yīng)用領(lǐng)域相似,適合由生物體液內(nèi)萃取非極性和中等極性目標物,可極大地去除內(nèi)源性干擾物質(zhì),并可實現(xiàn)高通量樣品操作[16]。LLE、SLE同時萃取等量的同種酒樣,進行GC分析,結(jié)果如表1所示。
圖2 白酒中手性目標的提取離子流色譜圖Fig.2 Ion flow chromatogram of chiral targets in Chinese Baijiu
表1 LLE、SLE萃取效果比較Table 1 Comparison of extraction effects between LLE and SLE
用目標物質(zhì)出峰面積對比2種方法的萃取效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)SLE比LLE萃出的峰面積更大,可以萃取出S-2,3-丁二醇,而且操作更方便簡單。
選擇二氯甲烷為萃取溶劑,對等量目標物質(zhì)萃取后進行GC-MS分析,考察二氯甲烷用量為15~50 mL時對目標物質(zhì)萃取效果的影響,結(jié)果如圖3所示。隨著二氯甲烷用量增加,各目標物質(zhì)的峰面積逐漸上升,這是因為隨著二氯甲烷用量的增加,硅藻土混合物中更多的目標物質(zhì)被二氯甲烷萃取出來。但當溶劑用量達30 mL以后,各目標物質(zhì)的峰面積基本穩(wěn)定,說明達到飽和狀態(tài)。因此,為滿足最大的萃取效果以及最大程度地節(jié)省試劑,理應(yīng)選擇30 mL作為萃取用量。
圖3 二氯甲烷用量對目標物質(zhì)的萃取效果的影響Fig.3 Effect of dichloromethane dosage on the extraction effect of target substances
依據(jù)1.6小節(jié)操作法對系列標準溶液中目標物質(zhì)進行萃取,并進行GC-MS分析, 以目標標準物質(zhì)的質(zhì)量濃度與對應(yīng)內(nèi)標物質(zhì)質(zhì)量濃度之比為橫坐標,以目標標準物質(zhì)的峰面積與內(nèi)標物質(zhì)峰面積之比為縱坐標建立標準曲線繪制各目標物質(zhì)的標準曲線,結(jié)果如圖4所示。
圖4 乳酸乙酯、2,3-丁二醇對映體的標準曲線Fig.4 Standard curve of enantiomers of ethyl lactate and 2,3-butanediol
由表2和圖4可知,SLE法定量白酒中D/L-乳酸乙酯得線性范圍100~1 500 mg/L、S-2,3-丁二醇的線性范圍1~10 mg/L、R-2,3-丁二醇的線性范圍10~100 mg/L、meso-2,3-丁二醇的線性范圍0.5~60 mg/L,5種旋光異構(gòu)體標準曲線在各自線性范圍內(nèi)的線性相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99,表明線性關(guān)系良好。按大于3倍信噪比計算方法的檢出限,D-、L-乳酸乙酯和S-、R-、meso-2,3-丁二醇的檢出限分別是64.32、47.74、62.70、59.08和26.58 μg/L。
表2 方法檢驗的參數(shù)Table 2 Parameters of method validation
在白酒樣品中進行加標回收實驗,在優(yōu)化條件下每個濃度重復測定3次,根據(jù)標準曲線計算濃度,取平均值,獲得5 種光學異構(gòu)體的平均回收率及相對標準偏差(見表3)。結(jié)果表明該方法靈敏度較高,樣品加標回收率均80%以上;方法重現(xiàn)性較好,相對標準偏差1.34%~8.50%。
應(yīng)用所建立的SLE-GC-MS方法檢測白酒樣品中手性對映體的含量,所選酒樣包括醬香型(茅臺王子酒和飛天茅臺)、濃香型(水晶劍南春和瀘州老窖特曲)、清香型(紅星八年陳釀和山西杏花村汾酒)等6種市售白酒,結(jié)果見表4和表5所示。6種白酒中均能檢測出乳酸乙酯(D-型、L-型)和2,3-丁二醇(S-型、R-型、meso-型),其中S-2,3-丁二醇(右旋體)在白酒中首次被發(fā)現(xiàn),說明該方法能夠用于不同類型白酒中對映體含量的檢測。
表3 五種對映體的加標回收率及精密度Table 3 Recovery and relative standard deviation of five optically active isomers
RSD表示標準偏差
趙國宏等[20]建立了自動旋光儀鑒別乳酸乙酯旋光構(gòu)型的方法,并對白酒中乳酸乙酯對映體及含量進行了研究,認為醬、濃、清三大香型白酒中左旋L大于右旋。但旋光的測定可能受到許多因素如文獻值、溫度、樣品濃度、溶劑及樣品純度的影響,而本實驗利用D-乳酸乙酯和L-乳酸乙酯的標準品,通過GC-MS對酒樣中目標物質(zhì)進行準確定性。從表4可以看出,實際樣品中D-乳酸乙酯占乳酸乙酯總含量的54.1%~82.5%,高于L-型的含量,表明這3種香型白酒中乳酸乙酯主要以D-型存在。而且6種酒的乳酸乙酯對映體的比例均不同,飛天茅臺的D-乳酸乙酯占比最高,是L-型的4.7倍,杏花村汾酒的D-乳酸乙酯占比最低,是L-型的1.2倍。此外,這3種香型的乳酸乙酯的D/L比例范圍也不一樣,醬香型的2種酒D/L范圍在2.4~4.7,濃香型的2種酒D/L比例范圍在2.2~2.7,清香型的2種酒D/L比例范圍在1.2~2。
表4 三大香型中乳酸乙酯的對映體含量及比例Table 4 The enantiomeric content and proportion of ethyl lactate in the three flavor types
從表5可以看出,6種白酒中2,3-丁二醇主要以R-型和meso-型存在,濃香型的瀘州老窖特曲和水晶劍南春R/meso比例最高(2.5~3),清香型的杏花村汾酒和紅星八年陳釀中R/meso比例最小(0.91~0.98),通過方差分析表明3種香型之間的R/meso比例存在差異(P<0.05)。比較6種酒的R/S比例,濃香型的2種酒R/S比例最大(63.1~75.8),醬香型的2種白酒R/S比例最小(3.6~5.3),通過方差分析顯示3種香型之間的R/S比例也存在差異(P<0.05)。
表5 三大香型中2,3-丁二醇的對映體含量及比例Table 5 The enantiomeric content and proportion of 2,3-butanediol among the three flavor types
本研究建立了SLE提取凈化、手性色譜柱分離,結(jié)合GC-MS檢測白酒中乳酸乙酯2種對映體、2,3-丁二醇3種對映體含量的新方法,該方法測得的各物質(zhì)的標準曲線在所選質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99,且平均回收率在80%以上、RSD在1.34%~8.50%,均能滿足檢測要求。利用該方法對三大香型6款市售白酒中乳酸乙酯、2,3-丁二醇的手性對映體進行了檢測,發(fā)現(xiàn)在所檢測的不同白酒中其含量及對映體分布具有差異,并首次在白酒中發(fā)現(xiàn)到S-2,3-丁二醇。國外已有成功利用葡萄酒中單萜烯類對映體比例區(qū)分不同品種的風格的報道[21],同理乳酸乙酯、2,3-丁二醇作為白酒中重要的風味物質(zhì),也可利用其對映體比例的不同作為區(qū)分白酒風格的依據(jù),當然,這需要建立在大量、系統(tǒng)的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)之上。此外,由于外源性香料的添加會改變天然發(fā)酵酒體原有的對映體比例,有研究人員通過檢測葡萄酒中1,2-丙二醇的對映體比例就可以鑒別天然葡萄酒出現(xiàn)香氣摻假的現(xiàn)象[22],考慮到乳酸乙酯和2,3-丁二醇是常用的白酒風味物質(zhì)添加劑[5,23],可改善白酒的風味口感,因此,研究不同來源白酒中乳酸乙酯、2,3-丁二醇含量及對映體分布可作為白酒品質(zhì)鑒別及產(chǎn)地溯源的一個具有較高應(yīng)用價值的評判依據(jù)。