氮響應轉錄因子ZmNLP5影響玉米根系生長的功能研究

葛 敏 王元琮 寧麗華 胡夢梅 石 習 趙 涵

江蘇省農(nóng)業(yè)科學院種質(zhì)資源與生物技術研究所 / 江蘇省農(nóng)業(yè)生物學重點實驗室, 江蘇南京 210014

氮素(nitrogen, N)是植物生長發(fā)育需求量最大的礦質(zhì)營養(yǎng)元素, 也是促進作物增產(chǎn)的最關鍵因素之一[1-2]。玉米是我國重要的糧食、飼料和生物能源作物, 對我國的糧食安全具有舉足輕重的戰(zhàn)略作用。玉米的產(chǎn)量對氮肥施用量依賴度極高, 農(nóng)戶往往通過大量施加氮肥以保障玉米產(chǎn)量[3]。然而, 氮肥過度施加, 不僅增加生產(chǎn)成本, 造成資源浪費, 還引發(fā)水體富營養(yǎng)化和土壤酸化等環(huán)境問題[4]。因此,為了農(nóng)業(yè)的綠色發(fā)展, 研究玉米氮素高效利用機制并挖掘其中重要的調(diào)控基因, 具有重要的經(jīng)濟和社會現(xiàn)實意義, 有助于在保障作物高產(chǎn)的同時降低肥料的施用[5]。

玉米主要通過根部吸取土壤中以硝態(tài)氮(NO3-)為主的氮素, NO3-也可作為信號分子協(xié)同調(diào)控植物氮代謝途徑中關鍵基因的表達, 影響植株氮響應和生長發(fā)育過程[6-7]。NO3-進入根部細胞后由硝酸還原酶(nitrate reductase, NR)轉化為亞硝酸鹽(NO2-), 再由亞硝酸還原酶(nitrite reductase, NIR)將NO2-快速轉化成銨態(tài)氮(NH4+)。NH4+結合谷氨酸通過GS/GOGAT循環(huán)同化形成谷氨酰胺, 谷氨酰胺作為活躍的氨基供體參與到氮素的多種代謝過程[8]。

應對不同氮素環(huán)境, 植物擁有多層感應和適應機制以響應氮營養(yǎng)元素的利用, 上述適應性的反應即為 “氮響應”, 其包括植物形態(tài)和生理上的反應。例如: 低氮環(huán)境下, 植株主根伸長生長, 以促進植株尋找更多氮源; 高氮環(huán)境下, 植株激發(fā)側根組織的萌發(fā)[9-10]。玉米根尖過渡區(qū)(root apex transition zone)的轉錄組和蛋白組學分析數(shù)據(jù)顯示, 氮響應與植物激素的生物合成和信號傳導有關, 并表明玉米氮響應的過程中伴隨著細胞骨架活化和細胞壁修飾[11]。

調(diào)控氮響應的轉錄因子在擬南芥中已有報道,例如 CCA1、LBD37/38/39、NLP7等[12-14], 上述轉錄因子通過調(diào)控氮吸收和同化過程中的關鍵基因的表達來調(diào)控氮代謝過程。近期, Ge等[15]發(fā)現(xiàn)編碼玉米氮響應轉錄因子 ZmNLP5基因, 該基因Mu插入突變體(zmnlp5)相對野生型植株(WT)氮響應程度顯著下降, 同化產(chǎn)物的積累也顯著降低。并且ZmNLP5轉錄因子直接與亞硝酸還原酶基因(ZmNIR1.1)的啟動子區(qū)域氮響應元件(NRE)[16]結合并激活ZmNIR1.1的表達[17]。據(jù)研究報道, 亞硝酸鹽(NO2-)對根尖快速生長的細胞具有細胞毒性[18], ZmNIR1.1是將 NO2-轉化為NH4+的關鍵酶。ZmNLP5轉錄因子是否參與調(diào)控玉米根部響應不同氮素環(huán)境下的形態(tài)反應, 進而影響地上部分氮素同化積累尚未明確, 鑒于此,本研究選取ZmNLP5基因的突變體和野生型為研究材料, 探究氮響應轉錄因子 ZmNLP5對玉米根系生長的影響及其生理機制, 為玉米氮高效育種有效利用ZmNLP5基因奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料與處理方法

ZmNLP5基因突變體材料zmnlp5(編號為UFMu-01175, http://www.maizegdb.org/uniformmu)和野生型材料玉米自交系W22由美國玉米遺傳資源聯(lián)合存儲中心-UniformMu轉座子資源庫(Maize Genetics Cooperation Stock Center UniformMu Transposon Resource)提供。

足氮(sufficient N, SN)和低氮(deficient N, DN)營養(yǎng)液處理: 將zmnlp5突變體和野生型材料水培培養(yǎng)于江蘇省農(nóng)業(yè)科學院設施大棚(江蘇南京)。根據(jù)Schlüter等[19]研究結果設置SN和DN兩種氮素濃度處理, 其中基礎營養(yǎng)液為改良Hoagland營養(yǎng)液(5 mmol L-1CaCl2, 2 mmol L-1MgSO4, 0.05 mmol L-1EDTA-Fe-Na Salt, 0.5 mmol L-1KH2PO4, 50 μmol L-1H3BO4, 10 μmol L-1MnCl2, 1 μmol L-1ZnSO4,0.3 μmol L-1CuSO4, 0.5 μmol L-1Na2MoO4), SN和DN營養(yǎng)液是分別在基礎營養(yǎng)液中分別添加15 mmol L-1和0.15 mmol L-1KNO3(KCl補齊鉀離子濃度), 營養(yǎng)液2 d更換1次, 常規(guī)管理。

不同濃度亞硝酸鹽處理: 利用低氮營養(yǎng)液對zmnlp5突變體和野生型材料水培培養(yǎng)7 d, 然后分別用含有0、0.5、1、2和5 mmol L-1KNO2的低氮營養(yǎng)液對上述材料處理7 d, 培養(yǎng)條件與足氮和低氮營養(yǎng)液處理相同。

1.2 基因mRNA表達量分析

將野生型材料于足氮營養(yǎng)液水培培養(yǎng)21 d后,對其根部組織進行分段取樣: 根尖區(qū)域(根尖0～4 cm)、中部區(qū)域(4～10 cm)和上部區(qū)域(余下部分)。樣品液氮研碎后利用RNA Isolation System (Promega)試劑盒提取總RNA, 利用反轉錄試劑盒Prime Script RT Reagent Kit (TaKaRa)進行反轉錄。以得到的cDNA為模板, 利用實時熒光定量PCR技術(qPCR)對ZmNLP5基因在玉米根部不同部位中的mRNA表達量進行分析。玉米持家基因ZmUPF1(GRMZM2G 163444)為內(nèi)參基因[20], 每個樣品3個生物學重復。

1.3 蛋白含量檢測

利用蛋白質(zhì)免疫印記技術(Western blot, WB),對野生型材料根部根尖區(qū)域、中部區(qū)域和上部區(qū)域組織中ZmNLP5蛋白含量進行檢測。樣品液氮研碎后利用Plant Nuclei Isolation/Extraction Kit (Sigma)試劑盒提取總蛋白, 蛋白濃度利用BCA Protein Assay Kit (Beyotime)試劑盒進行定量分析。以野生型根部不同區(qū)域總蛋白為樣品, 利用SDS-PAGE對總蛋白進行分離, 分離后的蛋白轉移至PVDF膜上(0.2 μm,Millipore, USA)。然后對附著分離蛋白的PVDF膜進行封閉, 及初級抗體和次級抗體的孵育。最后利用BeyoECL Plus (Beyotime)對化學發(fā)光進行檢測。ZmNLP5特異性的抗體(上海英基生物科技有限公司ABclonal technology制備, 兔源為實驗級日本大耳白兔)的稀釋比例為1∶1000, 標簽抗體UDPGP(Agrisera)的稀釋比例為1∶2000, 次級抗體(羊抗兔)的稀釋比例為1∶3000。

1.4 亞硝酸鹽含量測定

將研究材料不同組織部位的樣品進行取樣后,利用亞硝酸鹽測定試劑盒(蘇州科銘生物技術有限公司)對樣品中的亞硝酸含量進行檢測, 每個樣品 3個生物學重復。

2 結果與分析

2.1 足氮和低氮環(huán)境下zmnlp5突變體根長分析

為了探究氮響應轉錄因子ZmNLP5在不同氮素環(huán)境下對玉米根長的影響, 我們對足氮(SN)和低氮(DN)水培營養(yǎng)液中生長21 d的野生型(WT)和ZmNLP5基因突變體(zmnlp5)幼苗的根長進行測定。結果顯示, SN條件下, WT和zmnlp5突變體材料的根長分別為(142.333±2.517) mm和(145.000±3.606) mm(圖1-A, B), 經(jīng)單因素方差分析SN條件下WT和zmnlp5材料根長沒有顯著差異。然而, 低氮條件下zmnlp5植株根長顯著短于野生型材料[zmnlp5為(166.667±8.622) mm, WT為(218.333±7.095) mm,P≤0.01, 圖1-A, B], 降低了23.66%。以上結果表明,低氮環(huán)境下,zmnlp5突變體植株響應低氮環(huán)境根部伸長生長受到抑制。氮響應轉錄因子ZmNLP5對玉米根部的伸長生長有影響。

2.2 ZmNLP5在玉米根部不同區(qū)域的表達量分析

為了探究ZmNLP5在根部作用部位, 我們對野生型根部組織進行分段取樣, 分為上部區(qū)域(Upper)、中部區(qū)域(Middle)和根尖區(qū)域(Tip)。利用實時熒光定量PCR技術(qPCR)和蛋白質(zhì)免疫印記技術(Western blot, WB)對ZmNLP5基因的mRNA表達量和蛋白含量進行分析。結果表明:ZmNLP5基因mRNA在根尖區(qū)域積累量最高, 顯著高于根的中部和上部區(qū)域(P≤0.05, 圖2-A), ZmNLP5蛋白也主要在根尖區(qū)域檢測到, 根中部和上部區(qū)域未檢測到可見的ZmNLP5蛋白信號(圖2-B)。上述結果表明,ZmNLP5主要在根部組織的根尖區(qū)域表達, 表達部位可能與該基因的功能相關。

2.3 不同濃度的亞硝酸鹽處理下zmnlp5突變體根長變化分析

上述結果表明: ZmNLP5主要在根尖區(qū)域表達,前期研究證明ZmNLP5能激活亞硝酸還原酶ZmNIR1.1基因的表達[17]。由于氮素同化過程中ZmNIR1.1是將亞硝酸鹽(NO2-)還原為銨鹽(NH4+)的關鍵酶, 并且亞硝酸鹽對根尖區(qū)域快速生長的細胞具有一定的細胞毒性[18]。因此, 推測低氮環(huán)境下zmnlp5突變體根部伸長生長受到抑制可能是由于,zmnlp5突變體中ZmNLP5功能喪失導致ZmNIR1.1表達量降低, 根尖NO2-未能快速還原為銨鹽NH4+, 而積累在根尖區(qū)域。

為了驗證這一假設, 我們首先對不同亞硝酸鹽濃度(0、0.5、1、2和5 mmol L-1KNO2)處理下, 突變體和野生型植株根長進行分析。結果表明: 在亞硝酸鹽濃度達到2 mmol L-1之前, WT和zmnlp5之間的根長沒有顯著差異; 但當亞硝酸鹽的濃度高于2 mmol L-1時,zmnlp5突變體植株根長相對野生型材料顯著降低(P≤0.05, 圖3-A, B), 亞硝酸鹽的濃度為2 mmol L-1和5 mmol L-1時, 根長分別降低18.46%和18.48% (圖3-B)。上述結果說明當亞硝酸鹽濃度達到一定程度時, 對zmnlp5突變體的根部的伸長生長將產(chǎn)生抑制作用。

2.4 不同濃度的亞硝酸鹽處理下zmnlp5突變體根尖區(qū)域亞硝酸鹽含量分析

為了研究zmnlp5突變體根部伸長生長受到抑制是否與根尖區(qū)域亞硝酸鹽積累相關, 我們對不同亞硝酸鹽濃度(0、0.5、1、2和5 mmol L-1KNO2)處理下, 突變體和野生型植株根尖區(qū)域的亞硝酸鹽含量進行了分析。結果表明, 當亞硝酸鹽的濃度高于2 mmol L-1時,zmnlp5突變體植株根尖比WT中積累更多的亞硝酸鹽(P≤0.01)。當亞硝酸鹽的濃度為2 mmol L-1和5 mmol L-1時, 相對野生型材料,zmnlp5突變體植株根尖亞硝酸鹽積累量分別增加52.30%和79.03% (圖4)。上述結果一定程度驗證了我們的假設, 亞硝酸鹽在zmnlp5突變體根尖區(qū)域積累,當積累到達一定濃度對根尖細胞產(chǎn)生毒性, 根部的伸長生長受到抑制。

2.5 2種氮環(huán)境下玉米根部不同區(qū)域亞硝酸鹽含量分析

為了進一步研究不同的氮素環(huán)境下, 植株根長和根尖亞硝酸鹽含量之間的關系, 我們對足氮(SN)和低氮(DN)條件下, 野生型(WT)和zmnlp5突變體材料根部不同區(qū)域的亞硝酸鹽含量進行了檢測。結果表明: SN條件下, 野生型和zmnlp5突變體材料根上部(Upper)和中部(Middle)區(qū)域亞硝酸鹽含量無顯著差異,zmnlp5突變體根尖區(qū)域(Tip)亞硝酸鹽含量顯著高于WT, 增加了9.24% (P≤0.05)。DN條件下,zmnlp5突變體材料根中部區(qū)域亞硝酸鹽含量顯著低于野生型材料(P≤0.05), 降低了 73.08%; 根尖區(qū)域亞硝酸鹽含量顯著高于野生型材料(P≤0.05), 增加了28.50%。上述結果說明, 2種氮環(huán)境下,zmnlp5突變體較野生型材料在植株根尖區(qū)域均積累了更多的亞硝酸鹽。

3 討論

氮素是作物生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)元素, 研究作物氮素高效利用機制并挖掘利用其中重要的調(diào)控基因, 對我國農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展具有重要意義。玉米作為三大糧食作物之一, 其產(chǎn)量的高低對氮肥的依賴性極高, 但氮肥過度施加, 又會引發(fā)資源浪費和環(huán)境污染等一系列問題。因此, 如何提高玉米氮素利用效率已成為亟待解決的重要科學問題[21]。前期通過遺傳和生理生化分析發(fā)現(xiàn), 低氮環(huán)境下, 玉米氮響應轉錄因子ZmNLP5對氮素的吸收利用具有促進作用[17], 但調(diào)控機制仍未解明。根系是作物吸收營養(yǎng)元素的主要器官, 也是最先感知外界氮素濃度變化的重要器官。不同氮素環(huán)境下, 為響應氮營養(yǎng)元素的利用, 植株根系形態(tài)也會發(fā)生適應性的改變。例如, 根部伸長生長已被定義為植物適應低氮環(huán)境的典型形態(tài)反應[9]。

玉米根系吸收以硝態(tài)氮(NO3-)為主的氮素, 亞硝酸鹽是硝酸鹽還原成銨的中間產(chǎn)物。高濃度的亞硝酸鹽對植物細胞的生長有不利影響, 尤其在快速生長的細胞中, 例如細胞分裂和伸長生長活躍的根尖細胞中[18]。亞硝酸鹽還原為銨是由亞硝酸還原酶(NIR)催化的, 模式植物煙草中發(fā)現(xiàn)NIR活性降低導致高濃度的亞硝酸鹽積累并抑制植物生長[22]。模式植物擬南芥中, 已證明根尖中亞硝酸鹽的過度積累會導致根部生長發(fā)育受阻, 根長變短[18]。本研究中,ZmNLP5優(yōu)先在根尖區(qū)域表達(圖2),zmnlp5突變體中由于ZmNLP5功能喪失導致其根部ZmNIR1.1表達量顯著降低[17]。根尖NO2-未能快速還原為NH4+,使得zmnlp5突變植物根尖處亞硝酸鹽積累量上調(diào)(圖5)。低氮條件下, 在zmnlp5突變體植株根尖處亞硝酸鹽過度積累與發(fā)育遲緩的根部生長響應同時出現(xiàn)。由于亞硝酸鹽對根尖快速生長的細胞具有細胞毒性, 因此我們推測低氮條件下zmnlp5突變體的根部發(fā)育遲緩部分原因是由zmnlp5突變體根尖中亞硝酸鹽過量積累引起的。此外, 即使zmnlp5突變體植物在根尖累積了更多的亞硝酸鹽, 但在低氮條件下,它們在根部中部的累積量卻比WT少。這可能是由于zmnlp5突變植株根部伸長生長受到抑制, 因此從縮短的根部中部區(qū)域獲取氮素的效率降低, 因為根部吸收和同化營養(yǎng)物質(zhì)的關鍵區(qū)域為成熟區(qū)[23]。由于根的中間區(qū)域主要由成熟細胞組成, 因此它們對亞硝酸鹽的細胞毒性較不敏感。因此, 即使根的中間區(qū)域在 WT中積累更多的亞硝酸鹽, 它對根生長的抑制作用也比對根的快速分裂和伸長的尖端區(qū)域要小得多。

綜上所述, 我們提出不同氮素環(huán)境下 ZmNLP5參與調(diào)控玉米根部生長的工作模型。充足氮(SN)條件下, 由于環(huán)境中有充足的氮素可以利用, 植株不必啟動根部的進一步伸長生長, 此外, 足氮環(huán)境下根尖高濃度的亞硝酸鹽積累對抑制根部的進一步伸長生長也有貢獻。因此, SN條件下, WT和zmnlp5突變體之間根長無顯著差異。低氮(DN)條件下, 根系伸長生長是植物響應低氮環(huán)境的典型形態(tài)反應[9],WT植物的根系伸長生長得到增強, 部分原因可能是: 由于氮饑餓時植株同化產(chǎn)生的亞硝酸鹽較少,并且有限的亞硝酸鹽通過 ZmNIR1.1進一步轉化為銨鹽, 使得根尖亞硝酸鹽積累量降低、根系生長抑制得到緩解。但是, 在zmnlp5突變植物中, ZmNLP5功能的喪失導致其根部ZmNIR1.1表達量顯著降低[17],使得根尖區(qū)域亞硝酸鹽積累上調(diào), 根尖區(qū)域相對較高的亞硝酸鹽含量對其根部伸長生長具有一定的抑制作用。所以zmnlp5突變體植株中, 根部響應低氮環(huán)境伸長生長這一形態(tài)學反應受到阻礙。

本研究發(fā)現(xiàn), 玉米氮響應轉錄因子 ZmNLP5的功能缺失, 將導致低氮環(huán)境下玉米根部生長受阻,亞硝酸鹽在根尖區(qū)域過量積累可以部分解釋這一表型現(xiàn)象, 同時, ZmNLP5也可能通過調(diào)控植物激素生物合成途徑相關基因影響植株根部發(fā)育, 這還需要后期相關實驗來證明。前期研究發(fā)現(xiàn)低氮環(huán)境zmnlp5突變體氮素同化產(chǎn)物積累量較 WT顯著降低[17], 可能是由于突變體根系生長受阻導致氮素吸收減少并最終影響氮同化產(chǎn)物積累降低。然而, 過量表達ZmNLP5是否能提高植株對氮素的吸收和利用仍未知, 后期還需利用轉基因技術手段對基因的功能進行更為深入的解析, 以期獲得提高玉米氮素利用率的候選基因。

4 結論

本研究發(fā)現(xiàn)玉米氮響應轉錄因子ZmNLP5主要在細胞分裂和生長活躍的根尖區(qū)域表達。亞硝酸鹽在根尖過量積累, 對玉米根部生長具有不利影響。低氮條件下ZmNLP5功能缺失對植株響應低氮環(huán)境根部伸長生長有影響, 這也最終會影響植株對氮素的吸收和同化利用能力。