新型抗廣譜性除草劑草甘膦轉(zhuǎn)基因油菜的創(chuàng)制及其鑒定

李杰華 端 群 史明濤 吳潞梅 柳 寒 林擁軍吳高兵 范楚川,* 周永明,*

1 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖北武漢 430070; 2 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 浙江杭州 310021; 3 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 湖北武漢 430070

油菜是我國重要的油料作物, 常年種植面積約700多萬公頃, 菜籽油占國產(chǎn)油料作物產(chǎn)油量的55%以上, 是國產(chǎn)食用植物油的第一大來源, 在維護(hù)國家食用油供給安全戰(zhàn)略中居于核心地位[1]。雜草危害是造成油菜減產(chǎn)的主要因素。雜草與油菜競爭水、肥等生存資源, 影響油菜正常生長發(fā)育, 可導(dǎo)致產(chǎn)量平均下降15.8%, 嚴(yán)重時(shí)可達(dá)50%以上[2]。油菜田間雜草可通過人工除草和施用化學(xué)除草劑防治。人工除草耗工耗力, 大幅增加了田間用工成本、制約了油菜的機(jī)械化規(guī)?；N植, 導(dǎo)致生產(chǎn)效率和農(nóng)民收益降低; 培育抗除草劑油菜新品種是油菜機(jī)械化、規(guī)模化種植的必要配套措施, 可解決大田除草的問題, 有效降低生產(chǎn)成本。

草甘膦是一種非選擇性除草劑, 其作用靶標(biāo)為莽草酸路徑中的關(guān)鍵酶5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase, EPSPS); 通過抑制 EPSPS的活性, 阻斷莽草酸途徑, 導(dǎo)致植物芳香族氨基酸(色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)的生物合成受到抑制和莽草酸在植物體內(nèi)過量積累, 最終引起植物體內(nèi)代謝混亂和植物死亡[3]。作為應(yīng)用最為廣泛的廣譜性除草劑之一, 草甘膦具有除草效率高、成本低、生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)小等優(yōu)勢。在2015年全球農(nóng)藥市場調(diào)查中, 草甘膦以49.65億美元的銷售額位居除草劑銷售額榜首[4]。

目前抗草甘膦作物的培育主要通過常規(guī)的誘變育種和轉(zhuǎn)基因育種來實(shí)現(xiàn)。誘變育種是在細(xì)胞或組織培養(yǎng)基中添加除草劑進(jìn)行篩選, 以及通過對花粉、小孢子、種子等誘變處理后進(jìn)行篩選, 獲得抗性材料; 利用該方法已在油菜、水稻和大豆等多種作物中獲得了具有草甘膦抗性的突變體[5-7]。而轉(zhuǎn)基因育種是利用從從微生物或植物體中分離出抗性基因, 通過遺傳轉(zhuǎn)化載體導(dǎo)入作物基因組中來實(shí)現(xiàn);利用該方法已成功培育了大豆、油菜、棉花、玉米等多種抗草甘膦作物[8-11], 是目前發(fā)展迅速、應(yīng)用最為廣泛和有效的抗草甘膦育種方法。在轉(zhuǎn)基因育種中, 利用的抗草甘膦基因主要有3種: (1)突變后的I型EPSPS基因。例如, Comai等[12]從鼠傷寒沙門氏菌中分離得到具有草甘膦抗性的aroA基因, 并將其轉(zhuǎn)入煙草獲得了抗草甘膦轉(zhuǎn)基因煙草; (2)天然的抗草甘膦II型EPSPS基因。例如, 孟山都公司從根癌農(nóng)桿菌 CP4菌株中獲得的抗草甘膦cp4-epsps基因[13]; (3)草甘膦降解基因。例如, 來源于蒼白桿菌的gox基因[14]。目前商業(yè)化應(yīng)用的草甘膦抗性基因主要包含CP4-epsps、mepsps、2mepsps、epsps(Ag)、grg、gat4601、gat4621等, 其中應(yīng)用最為廣泛的是CP4-epsps基因[8,15]。利用這些基因培育的抗草甘膦油菜已在美國、加拿大、澳大利亞等國家實(shí)現(xiàn)了廣泛的商業(yè)化應(yīng)用。但是這些基因資源的知識產(chǎn)權(quán)絕大部分被國外生物技術(shù)公司所壟斷, 極大限制了我國油菜抗除草劑品種的培育及其產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展。近年來, 隨著基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展, 對植物體內(nèi)EPSPS基因的保守氨基酸進(jìn)行精準(zhǔn)的堿基替換, 也成功獲得了抗草甘膦的水稻和木薯[16-17], 為除草劑作物的培育提供了新方法。但是, 該方法在不同作物中的應(yīng)用還有賴于單堿基編輯技術(shù)的建立。

非敏感EPSPS合酶基因I.variabilis EPSPS是華中農(nóng)業(yè)大學(xué)從放線菌屬變異白蟻菌(Isoptericola variabilis)中克隆到的草甘膦抗性基因[18]。該基因編碼的蛋白不具有CP4-EPSPS專利保護(hù)的4條保守序列, 但保留了對草甘膦較高的耐受性, 是具有完全自主知識產(chǎn)權(quán)的抗除草劑基因資源[19]。利用該基因創(chuàng)制的水稻轉(zhuǎn)化體可以耐受8400 g hm-2高劑量的草甘膦, 顯示出良好的應(yīng)用前景[18]。本研究旨在利用該基因創(chuàng)制新型的抗草甘膦油菜種質(zhì)資源, 為培育抗除草劑轉(zhuǎn)基因新品種奠定基礎(chǔ), 從而為我國油菜大田生產(chǎn)的雜草治理提供新的解決方案。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及其種植

用于遺傳轉(zhuǎn)化的甘藍(lán)型油菜受體品系為 J9707,是本實(shí)驗(yàn)室篩選獲得的具有高遺傳轉(zhuǎn)化效率的半冬性低芥酸品系。常規(guī)品種中雙11號由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)國家油菜工程技術(shù)中心提供。轉(zhuǎn)基因T0代材料在晝/夜 16 h /8 h、22℃/18℃、光照強(qiáng)度 115～144 μmol m-2s-1的培養(yǎng)室內(nèi)種植。其后代材料種植于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)油菜轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)基地。

1.2 植物載體及其遺傳轉(zhuǎn)化

本研究所用的草甘膦抗性基因EPSPS是從放線菌屬變異白蟻菌中克隆得到, 命名為I.variabilis EPSPS[20]。在該基因的5′端連入來源于擬南芥EPSPS蛋白的葉綠體信號肽序列(chloroplast transit peptide,CTP; GenBank: CAA29828.1), 具有將表達(dá)出的EPSPS蛋白運(yùn)送到芳香族氨基酸的合成場所葉綠體中的功能。然后, 將其替換 pCAMBIA1300質(zhì)粒中的潮霉素基因,獲得具有CaMV 35S啟動(dòng)子和CaMV poly(A)終止子的I.variabilis EPSPS超量表達(dá)載體pTGH-1 (圖1)。

遺傳轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的油菜下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化法[21]。

1.3 轉(zhuǎn)基因植株的陽性和轉(zhuǎn)化體特異性的 PCR檢測

設(shè)計(jì) 3對特異性引物 EPSPS-F/EPSPS-R、35SP-1/35SP-2和 35ST-1/35ST-2分別用于檢測pTGH-1載體 T-DNA區(qū)的目的基因I.variabilis EPSPS、CaMV 35S啟動(dòng)子元件和CaMV 35S終止子元件(圖1)。

利用分離的T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列信息, 設(shè)計(jì)油菜轉(zhuǎn)化體的特異性上游引物, 分別與位于T-DNA的LB端的共同下游引物(P5)進(jìn)行組合, 用于轉(zhuǎn)化體特異性PCR檢測。PCR擴(kuò)增體系含50 ng μL-1的模板 DNA 2.0 μL、10×PCR buffer 1.0 μL、2 mmol L-1dNTPs 0.8 μL、10 μmol L-1引物各 0.4 μL、2 U μL-1TaqDNA聚合酶 0.15 μL, 添加 ddH2O至10 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性4 min; 94℃變性30 s, 56℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 擴(kuò)增32個(gè)循環(huán); 最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳和照相觀察。所有引物序列見表1。

1.4 Southern blot檢測轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)

在目的基因I.variabilis EPSPS和CaMV 35S啟動(dòng)子上分別設(shè)計(jì)特異性引物對 Iva-EPSPS-F/Iva-EPSPS-R 和 p130-35sF/p130-35sR, 并對pTGH-1質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增, 用于制備 EPSPS探針和CaMV 35S promoter探針(圖1)。油菜基因組DNA的提取、酶切、電泳和轉(zhuǎn)膜、DNA探針的制備、雜交和檢測等具體程序見李杰華[22]的方法。引物序列見表1。

1.5 轉(zhuǎn)化單株中的T-DNA插入位點(diǎn)鑒定

利用反向PCR的方法分離轉(zhuǎn)基因的T-DNA插入位點(diǎn)。具體程序見李杰華[22]的方法。第1輪PCR引物為P1/SP2, 第2輪PCR引物為P3/SP3, 引物序列見表1所示。以SP3引物進(jìn)行PCR產(chǎn)物測序。將克隆得到的序列與甘藍(lán)型油菜參考基因組序列(http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/)進(jìn)行比對和分析, 確定T-DNA插入在油菜基因組中的具體位點(diǎn)。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.6 基因表達(dá)量檢測

抽提油菜不同組織的 RNA進(jìn)行 RT-PCR (reversed transcript polymerase chain reaction)和qRTPCR (quantitative real-time PCR)的基因表達(dá)量檢測。RNA抽提、反轉(zhuǎn)錄和RT-PCR等程序詳見Fan等[23]的方法。I.variabilis EPSPS和內(nèi)參基因ACTIN2的表達(dá)檢測引物對分別為 EPs-qRTF/EPs-qRTR和BnACT-qRTF/ BnACT-qRTR, 序列詳見表1。qRT-PCR反應(yīng)體系包含cDNA模板4 μL、2 × SYBR Green Mix 10 μL、2.5 μmol L-1的引物各 2 μL, 加 ddH2O 至總體積20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃變性3 min; 95℃變性12 s, 60℃退火 30 s, 72℃延伸 30 s, 45個(gè)循環(huán)。以ACTIN2作為對照, 目的基因的Ct值減去ACTIN的Ct值得到ΔCt, 計(jì)算2(ΔCt)即為相對表達(dá)量的值。

用Western blot方法對轉(zhuǎn)化體葉片中的I.variabilisEPSPS蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測, 以油菜ACTIN2為內(nèi)參基因, 以轉(zhuǎn)化受體J9707為陰性對照。油菜葉片的蛋白提取、蛋白濃度測定和Western blot檢測等具體程序見李杰華[22]的方法。

1.7 除草劑抗性檢測

待油菜長出 5～6片真葉時(shí), 對各材料進(jìn)行除草劑草甘膦的噴施處理, 以J9707為陰性對照。除草劑施用劑量設(shè)置0倍(噴施等量清水)、生產(chǎn)上推薦劑量的1倍(450 g hm-2農(nóng)達(dá)異丙胺鹽制劑)、2倍(900 g hm-241%農(nóng)達(dá)異丙胺鹽制劑)和 4倍(1800 g hm-2農(nóng)達(dá)異丙胺鹽制劑)。在噴施處理前、噴施處理后1～4周內(nèi)觀察和調(diào)查抗性表現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘藍(lán)型油菜I.variabilis EPSPS轉(zhuǎn)基因材料創(chuàng)建及其陽性鑒定

將轉(zhuǎn)化載體 pTGH-1通過電擊法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中, 然后通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的油菜下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入到 J9707中。由于 pTGH-1中不含篩選標(biāo)記基因, 因此在油菜轉(zhuǎn)化過程中利用目的基因I.variabilis EPSPS進(jìn)行篩選, 分別在愈傷誘導(dǎo)和分化階段添加30 mg L-1的草甘膦, 而在其他階段中沒有施加選擇壓。最終, 經(jīng)過侵染、共培養(yǎng)、愈傷誘導(dǎo)、分化、生根和移苗等轉(zhuǎn)化過程, 共獲得130個(gè)抗性植株。

為了確定這些抗性植株的基因組中轉(zhuǎn)化載體的功能元件整合情況, 利用3對特異性引物EPSPS-F/EPSPS-R、35SP-1/35SP-2和 35ST-1/35ST-2分別檢測 pTGH-1載體 T-DNA區(qū)的目的基因I.variabilisEPSPS、CaMV 35S啟動(dòng)子元件和CaMV 35S終止子元件(圖1)發(fā)現(xiàn), 126株含有完整外源插入序列的目的功能片段, 轉(zhuǎn)基因陽性率為97% (圖2)。

2.2 陽性轉(zhuǎn)化單株的拷貝數(shù)檢測

針對I.variabilis EPSPS基因設(shè)計(jì)探針(圖1), 采用Southern blot技術(shù)對96份T0代陽性轉(zhuǎn)化單株進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)檢測。如圖3所示, 轉(zhuǎn)基因單株中的 T-DNA插入存在 1～12個(gè)拷貝的變異, 其中單拷貝個(gè)體占 44.8%, 兩拷貝和三拷貝個(gè)體分別占15.6%和11.5%。表明本研究所采用的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的油菜下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化法以及采用的草甘膦選擇壓有利于單拷貝和低拷貝轉(zhuǎn)基因株系的產(chǎn)生。

根據(jù) T0代拷貝數(shù)檢測結(jié)果, 同時(shí)結(jié)合它們后代株系的田間表現(xiàn), 選擇具有 1～2個(gè)拷貝的優(yōu)良株系的后代進(jìn)行了拷貝數(shù)驗(yàn)證。分別采用HindIII和EcoRI 2種酶切、EPSPS基因和CaMV 35S啟動(dòng)子2種探針(探針位置見圖1所示)對它們的T2和T3代陽性株系進(jìn)行 Southern blot檢測, 證實(shí)這些家系的拷貝數(shù)與 T0代檢測結(jié)果一致(圖4)。進(jìn)一步選擇 4個(gè)具有單拷貝插入的株系進(jìn)行了T1代除草劑抗性分離的檢測, 即苗期使用田間推薦濃度的 2倍草甘膦進(jìn)行處理, 結(jié)果可以看出這些家系的存活單株與死亡單株符合 3∶1的分離比(表2), 從而進(jìn)一步證實(shí)了轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。基于上述結(jié)果,從中挑選出 3個(gè)單拷貝插入株系(EPS-2、EPS-6和EPS-7)和2個(gè)雙拷貝插入株系(EPS-1和EPS-5)用于后續(xù)的試驗(yàn)研究。

2.3 單拷貝轉(zhuǎn)化株系中T-DNA插入位點(diǎn)鑒定

利用反向PCR技術(shù)分離T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列, 并將分離的序列與甘藍(lán)型油菜參考基因組序列進(jìn)行比對, 確定了這些轉(zhuǎn)化體中T-DNA整合到染色體中的具體位置(圖5)。在EPS-2轉(zhuǎn)基因系分離得到 1617 bp的側(cè)翼序列, 可以比對到油菜參考基因組的chrA05:16529633處, 序列同源性達(dá)到99%; 該插入位置位于BnaA05g21420D基因的3′末端。EPS-6轉(zhuǎn)基因系分離得到 1578 bp的側(cè)翼序列, 可以比對到油菜參考基因組的 chrC02:9519946處, 序列同源性達(dá)到99%; 該插入位置位于基因BnaC02g14170D和BnaC02g14180D之間的基因間區(qū)。EPS-7轉(zhuǎn)基因系分離得到491 bp的側(cè)翼序列, 可以比對到油菜參考基因組的 chrC07:19068559處, 序列同源性達(dá)到99%; 該插入位置位于基因BnaC07g13430D和BnaC07g13440D之間的基因間區(qū)。

表2 單拷貝轉(zhuǎn)基因家系草甘膦抗性分離鑒定Table 2 Glyphosate-resistant segregation analysis of transgenic lines with single T-DNA insertion

2.4 利用特異性PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)化株系中的T-DNA插入位點(diǎn)

利用上述分離的側(cè)翼序列信息, 分別設(shè)計(jì)了EPS-2、EPS-6和EPS-7等油菜轉(zhuǎn)化體的特異性的上游引物(EPSPS2 F、EPSPS6 F和EPSPS7 F), 分別與載體上的共同下游引物P5進(jìn)行組合, 用于轉(zhuǎn)化體特異性PCR檢測(表1)。

利用轉(zhuǎn)化體特異性引物對這些家系的4個(gè)不同世代的植株(T0～T3)進(jìn)行 PCR 檢測(圖5)發(fā)現(xiàn), 各轉(zhuǎn)化體從 T0～T3世代單株均獲得了預(yù)期特異性片段,而陰性對照 J9707都沒有任何條帶。證明 EPS-2、EPS-6和 EPS-7等油菜轉(zhuǎn)化體基因組中整合的T-DNA在不同世代間的是穩(wěn)定的。

2.5 轉(zhuǎn)基因植株中I.variabilis EPSPS基因的表達(dá)檢測

在T0代, 分別用RT-PCR和Western blot檢測了幾個(gè)轉(zhuǎn)化體的葉片組織中目的基因的表達(dá)情況。從圖7可以看出, 在EPS-1、EPS-2、EPS-5、EPS-6和 EPS-7等轉(zhuǎn)化體中可以檢測到目的基因超量表達(dá), 而在轉(zhuǎn)化受體 J9707中檢測不到明顯的目的基因表達(dá)。

在 T3代, 利用 qRT-PCR技術(shù)檢測了 EPS-2、EPS-6和EPS-7等轉(zhuǎn)化體在幼葉、成熟葉、子葉、下胚軸、根、花蕾和種子等不同組織中的基因表達(dá)量(圖7-C)。相對于轉(zhuǎn)化受體J9707, 3個(gè)轉(zhuǎn)化體在各個(gè)組織中均能檢測到目的基因的上調(diào)表達(dá); 在不同轉(zhuǎn)化體中目的基因的表達(dá)量有所變異, 其中 EPS-6在不同組織中都表現(xiàn)出相對較高的表達(dá)水平。

2.6 轉(zhuǎn)基因植株的除草劑抗性鑒定

在 T1代, 對 EPS-2、EPS-6和 EPS-7等轉(zhuǎn)化體的草甘膦抗性進(jìn)行了初步評價(jià), 以 J9707和常規(guī)品種中雙11號為陰性對照, 苗期使用田間推薦濃度的2倍草甘膦進(jìn)行了處理。由圖8可以看出, 2種陰性對照在處理后藥害嚴(yán)重, 20 d左右植株完全死亡; 而各轉(zhuǎn)化體都表現(xiàn)出對草甘膦的抗性。EPS-6在處理后幾乎未見明顯的藥害, 與對照條件下(噴施等量清水)的植株生長相似, 表現(xiàn)出很好的草甘膦抗性;EPS-2和 EPS-7等轉(zhuǎn)化體也表現(xiàn)較好的抗性, 但是比對照條件下的植株生長弱小, 表現(xiàn)出一定程度的藥害。

為進(jìn)一步確定目標(biāo)除草劑抗性的功能穩(wěn)定性,在 T3代對 EPS-1、EPS-2、EPS-5、EPS-6和 EPS-7等株系進(jìn)行苗期的4種草甘膦濃度的噴施處理(0倍、1倍、2倍和4倍), 以J9707為對照。從圖9可以看出, 陰性對照J(rèn)9707在處理后藥害嚴(yán)重, 在4倍濃度噴施處理后第 4周完全死亡; 而各轉(zhuǎn)化體在 4倍濃度噴施處理后仍未見明顯的藥害發(fā)生, 都表現(xiàn)出很好的草甘膦抗性。

3 討論

根據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織(International Agricultural Biotechnology Application Service Organization, ISAAA)提供的數(shù)據(jù), 截至2020年, 全世界共有70個(gè)國家和地區(qū)種植或進(jìn)口了轉(zhuǎn)基因作物, 全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積達(dá) 1.917億公頃, 涉及32個(gè)作物種類、526項(xiàng)轉(zhuǎn)基因作物事件。其中, 除草劑耐受性的轉(zhuǎn)基因事件達(dá) 341項(xiàng), 占總轉(zhuǎn)基因作物事件的 64.8%, 而抗除草劑轉(zhuǎn)基因油菜轉(zhuǎn)化事件有38項(xiàng), 占轉(zhuǎn)基因油菜轉(zhuǎn)化事件的90.5%。目前應(yīng)用的抗除草劑轉(zhuǎn)基因油菜主要有抗草甘膦、抗草銨膦和抗溴苯氰等類型, 其中種植面積最廣的是抗草甘膦。油菜中廣泛應(yīng)用的的抗草甘膦基因絕大部分來自于孟山都和杜邦等國外生物技術(shù)公司,其中孟山都公司從根癌農(nóng)桿菌CP4菌株中獲得的抗草甘膦CP4-epsps基因應(yīng)用最為成功; 該酶對草甘膦不敏感, 對 EPSPS催化的底物 5-磷酸烯醇式丙酮酸(5-phosphoenolpyruvate, PEP)具有很高的親和力; 因此, 它可以取代植物的內(nèi)源EPSPS合成酶體系, 使莽草酸途徑正常進(jìn)行, 從而達(dá)到抗草甘膦的效果[15,22]。本研究使用的I.variabilis EPSPS是從細(xì)菌I.variabilis中克隆到的一種新型的抗草甘膦基因[11], 與已獲得轉(zhuǎn)基因批準(zhǔn)的CP4-epsps、玉米EPSPS突變體以及GRG23突變體中的EPSPS基因的氨基酸序列同源性分別只有 27.1%、33.5%和31.5%[24]。因此,I.variabilis EPSPS是一種具有完全自主知識產(chǎn)權(quán)的新型抗草甘膦基因[19]。

本研究成功將該基因轉(zhuǎn)入到甘藍(lán)型油菜中, 獲得了一批單拷貝的轉(zhuǎn)基因株系。通過多代的分子特征檢測證實(shí)該基因穩(wěn)定整合到油菜基因組中, 在多個(gè)世代間可以檢測到目的基因的超量表達(dá)。在 T1代對單拷貝家系EPS-2、EPS-6和EPS-7進(jìn)行草甘膦噴施處理發(fā)現(xiàn), 轉(zhuǎn)I.variabilis EPSPS的不同家系均表現(xiàn)出草甘膦抗性, 其中EPS-6家系抗性表現(xiàn)最優(yōu)(圖8),這與該家系中目標(biāo)基因在葉片等組織中的相對表達(dá)量最高一致(圖9), 顯示提高該目的基因的表達(dá)量有利于增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因油菜的草甘膦抗性水平。這3個(gè)家系中, EPS-6和EPS-7的T-DNA都位于基因間區(qū), 理論上對插入位點(diǎn)附近的基因表達(dá)不會產(chǎn)生太大影響,是比較理想的轉(zhuǎn)化株系; 而EPS-2的T-DNA插入在BnaA05g21420D基因的 3′末端, 可能會影響該基因表達(dá), 還需要后續(xù)的試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。在T3代, 進(jìn)一步對這3個(gè)單拷貝家系和2個(gè)雙拷貝插入的轉(zhuǎn)基因家系(EPS-1和 EPS-5)進(jìn)行了 0～4倍田間推薦使用劑量的草甘膦噴施處理, 表明它們都具有很好的抗性。因此,I.variabilis EPSPS基因有望作為一個(gè)新型的草甘膦抗性基因應(yīng)用到油菜抗除草劑品種培育中。

4 結(jié)論

將來自放線菌屬變異白蟻菌中的新型抗除草劑基因I.variabilis EPSPS通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入甘藍(lán)型油菜中, 獲得了 126株轉(zhuǎn)基因陽性單株。通過對外源插入片段的拷貝數(shù)、整合穩(wěn)定性、表達(dá)穩(wěn)定性和目標(biāo)除草劑抗性的穩(wěn)定性等特性的分析, 篩選出優(yōu)異的新型抗廣譜性除草劑草甘膦轉(zhuǎn)基因株系, 將為我國抗除草劑轉(zhuǎn)基因油菜品種培育提供優(yōu)異的種質(zhì)資源。