脂肪干細(xì)胞成骨分化的潛在關(guān)鍵基因與信號(hào)通路▲

李興艷 楊業(yè)靜 黃家志 代萬(wàn)武 黃祖權(quán) 杜勇軍

(廣西醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，南寧市 530031，電子郵箱：448445226@qq.com)

脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是從脂肪組織中分離出的一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞，主要具有恢復(fù)組織細(xì)胞、促進(jìn)細(xì)胞再生的作用，可有效改善亞健康、早衰等疾病，抵抗衰老[1]。此外，ADSCs因其具有來(lái)源充足、取材容易等優(yōu)點(diǎn)，已成為骨組織工程研究的熱點(diǎn)。但ADSCs成骨分化的分子生物學(xué)機(jī)制目前仍未完全闡明[2]。隨著大數(shù)據(jù)及生物信息學(xué)的快速發(fā)展，以及ADSCs在臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用[3]，已有一些學(xué)者針對(duì)ADSCs成骨分化進(jìn)行了RNA芯片及測(cè)序研究，以進(jìn)一步探討這些RNA在ADSCs成骨分化過(guò)程中所發(fā)揮的分子生物學(xué)機(jī)制。因此，本研究應(yīng)用生物信息學(xué)方法篩選ADSCs成骨分化過(guò)程中的差異表達(dá)基因及其涉及的信號(hào)通路，以探討ADSCs成骨分化過(guò)程中潛在的關(guān)鍵基因所發(fā)揮的分子生物學(xué)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 基因表達(dá)譜芯片的搜索 利用NCBI平臺(tái)下的GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，檢索與ADSCs成骨分化相關(guān)的基因數(shù)據(jù)集，在檢索結(jié)果中選擇GSE63754[4]數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘。GSE63754是由國(guó)外學(xué)者使用Agilent-039494 SurePrint G3 Human GE v2 8x60K Microarray 039381探針測(cè)定6個(gè)ADSCs成骨分化相關(guān)樣本的mRNA表達(dá)譜，包括3個(gè)ADSCs樣本和3個(gè)成骨細(xì)胞樣本[5]。

1.2 數(shù)據(jù)處理及差異表達(dá)基因分析 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理及優(yōu)化，如出現(xiàn)同名基因不同表達(dá)量時(shí)取均值，同時(shí)將數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)變換(log2)使得數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布。隨后將數(shù)據(jù)分為成骨細(xì)胞組(實(shí)驗(yàn)組)和ADSCs組(對(duì)照組)，利用R語(yǔ)言的Limma軟件包(版本號(hào)：3.12)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理后進(jìn)行差異表達(dá)基因分析。選取adjP值<0.05、|logFC|>2的基因作為候選差異表達(dá)基因。

1.3 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè) 將差異表達(dá)基因所對(duì)應(yīng)的蛋白上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(版本號(hào)：11.0)，選取打分值(基因或者蛋白之間最低互動(dòng)得分)>0.4的數(shù)據(jù)，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)，并利用Cytoscape軟件(版本號(hào)：v3.7.1)將PPI網(wǎng)絡(luò)可視化。同時(shí)，使用iRegulon軟件(版本號(hào)：1.3)對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子富集預(yù)測(cè)，將標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù)(normalized enrichment score，NES)排名前5的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行可視化。

1.4 關(guān)鍵基因的篩選 為了進(jìn)一步篩選與ADSCs成骨分化過(guò)程相關(guān)的潛在關(guān)鍵基因，使用cytoHubba插件(版本號(hào)：v3.7.1)中的Degree算法對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行重要模塊分析。選擇Degree排名前6的基因作為與ADSCs成骨分化過(guò)程相關(guān)的潛在關(guān)鍵基因。

1.5 關(guān)鍵基因的功能和通路富集分析 采用clusterProfiler包(版本號(hào)：3.12)對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology，GO)和京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)信號(hào)通路富集分析。根據(jù)adjP值<0.05進(jìn)行篩選。

2 結(jié) 果

2.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理及差異分析 將GSE63754數(shù)據(jù)預(yù)處理后各基因的表達(dá)均一化(見(jiàn)圖1A和圖1B)，得到32 055個(gè)基因的表達(dá)矩陣(圖2)。經(jīng)過(guò)差異表達(dá)基因分析后，篩選出556個(gè)差異表達(dá)基因，其中228個(gè)基因在成骨細(xì)胞組處于上調(diào)水平，而另228個(gè)基因在ADSCs組處于下調(diào)水平。在這些差異表達(dá)基因中選取上下調(diào)最明顯的100個(gè)基因(在ADSCs成骨分化過(guò)程中50個(gè)上調(diào)的基因和50個(gè)下調(diào)的基因)繪制熱圖(見(jiàn)圖2)。

圖1 數(shù)據(jù)預(yù)處理結(jié)果注：A為預(yù)處理前的數(shù)據(jù)表達(dá)情況；B為處理后的基因表達(dá)情況，可知數(shù)據(jù)處于同一水平線，代表處理后的數(shù)據(jù)佳。

圖2 差異表達(dá)基因分析結(jié)果注：A為火山圖，紅色代表在成骨細(xì)胞中上調(diào)，藍(lán)色代表在成骨細(xì)胞中下調(diào)；B為熱圖，紅色代表在成骨細(xì)胞中上調(diào)，綠色代表在成骨細(xì)胞中下調(diào)。

2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)及轉(zhuǎn)錄因子 通過(guò)STRING 11.0在線網(wǎng)絡(luò)工具對(duì)556個(gè)差異基因進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，排除242個(gè)無(wú)相互作用的蛋白，最后得到由314個(gè)節(jié)點(diǎn)、852條連接構(gòu)成的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。通過(guò)iRegulon插件對(duì)這些PPI網(wǎng)絡(luò)里的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)，構(gòu)建PPI和轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)出5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，包括ESRP1、PRKAA2、POU5F1B、ATF4HE和ZSCAN4(見(jiàn)圖3)，圖中的蛋白與其他節(jié)點(diǎn)連線越多，表明該蛋白在該網(wǎng)絡(luò)中越重要。

2.3 關(guān)鍵基因的篩選 Degree排名前6的關(guān)鍵基因分別是瘦素(leptin, LEP)、白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β,IL1B)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(fibroblast growth factor 2,FGF2)、鈣黏蛋白1(cadherin 1,CDH1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)和過(guò)氧化物酶體增生激活受體γ(peroxisome proliferative activated receptor gamma,PPARG)(見(jiàn)圖3)。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)和轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)圖注：圓形代表基因，八邊形代表轉(zhuǎn)錄因子，線條代表相互關(guān)聯(lián)

2.4 功能和通路富集分析結(jié)果 LEP、IL1B、FGF2、CDH1、VEGFA和PPARG這6個(gè)關(guān)鍵基因主要富集在p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路，并且可能與破骨細(xì)胞分化相關(guān)。見(jiàn)圖4。

圖4 ADSCs成骨分化過(guò)程相關(guān)的潛在關(guān)鍵基因的富集分析注：A為關(guān)鍵基因的GO富集分析圖(前30);B為關(guān)鍵基因的KEGG信號(hào)通路富集分析圖(前30);C為關(guān)鍵基因的GO富集分析結(jié)果中排名前10的GO條目;D為關(guān)鍵基因的KEGG富集分析結(jié)果中排名前10的信號(hào)通路。

3 討 論

本研究共篩選出556個(gè)差異表達(dá)基因。最終發(fā)現(xiàn)LEP、IL1B、FGF2、CDH1、VEGFA和PPARG為ADSCs成骨分化過(guò)程相關(guān)的潛在關(guān)鍵基因，并且這些基因和信號(hào)通路主要富集在p38 MAPK信號(hào)通路上，可能與破骨細(xì)胞分化相關(guān)。

PPARG為過(guò)氧化物酶體增生激活受體γ的編碼基因，其編碼的過(guò)氧化物酶體增生激活受體γ可以與類(lèi)維生素A受體結(jié)合形成二聚物，該二聚體可以與多種基因的特異DNA序列——過(guò)氧化物酶體增殖反應(yīng)元件(peroxisome proliferators response element，PPRE)結(jié)合，從而激活基因的表達(dá)。PPARG主要與癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病和肥胖癥相關(guān)[6]，但尚未見(jiàn)有關(guān)PPARG調(diào)控細(xì)胞分化的研究。本研究結(jié)果表明PPARG可能是ADSCs成骨細(xì)胞分化過(guò)程中的潛在關(guān)鍵分子，但這只是通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)的結(jié)果，還有待體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證。

CDH1[7]、VEGFA[8]、FGF2[9]都是癌基因。CDH1基因編碼E-鈣黏蛋白，是一種鈣依賴(lài)性細(xì)胞黏附蛋白，屬于鈣黏蛋白家族成員，CDH1基因參與調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、遷移和上皮細(xì)胞增殖，其功能缺失導(dǎo)致細(xì)胞更容易侵襲和轉(zhuǎn)移，該基因的突變與胃癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、甲狀腺癌和卵巢癌密切相關(guān)[10]。VEGFA基因是血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor，PDGF)/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族的成員，是糖基化的有絲分裂原，除可特異性地作用于內(nèi)皮細(xì)胞外，還具有多種作用，包括介導(dǎo)增加的血管通透性、誘導(dǎo)血管生成、血管發(fā)生和內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)細(xì)胞遷移和抑制細(xì)胞凋亡，其主要與糖尿病及動(dòng)脈粥樣硬化等微血管病變相關(guān)[11]。FGF2基因編碼的蛋白是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族的成員，具有廣泛的促有絲分裂和血管生成活性，該蛋白與多種生物學(xué)過(guò)程有關(guān)，如肢體和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、傷口愈合和腫瘤生長(zhǎng)等。

值得注意的是，IL1B[12]、LEP[13]與炎癥相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，兩者是與ADSCs的成骨分化相關(guān)的潛在關(guān)鍵分子。因此，IL1B和LEP調(diào)控的炎癥反應(yīng)是否也參與了ADSCs的成骨分化有待進(jìn)一步研究。

MAPK是一組絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，其能將信號(hào)從細(xì)胞外表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞核的內(nèi)部，能被不同的細(xì)胞外因子刺激所激活，如細(xì)胞黏附因子、神經(jīng)遞質(zhì)因子、生長(zhǎng)因子等。MAPK通路是一種較為保守的三級(jí)激酶模式，依次通過(guò)MAPK激酶激酶、MAPK激酶和MAPK激活下游信號(hào)，共同調(diào)節(jié)著細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、對(duì)環(huán)境的應(yīng)激適應(yīng)、分化和生長(zhǎng)等多種重要的細(xì)胞生理或病理生理過(guò)程。在調(diào)控細(xì)胞炎癥反應(yīng)方面，p38 MAPK在重癥胰腺炎炎癥反應(yīng)中扮演重要角色[14]；而在調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化方面，p38 MAPK能夠促進(jìn)小鼠成骨細(xì)胞增殖、分化并抑制成骨細(xì)胞的凋亡[15]。本研究結(jié)果表明，p38 MAPK信號(hào)通路可能在ADSCs成骨分化的分子生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，這與MAPK信號(hào)通路參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化的作用一致。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中關(guān)于ADSCs成骨分化的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘，發(fā)現(xiàn)ADSCs成骨分化過(guò)程中潛在的關(guān)鍵基因及其涉及的通路。這或可為今后進(jìn)一步開(kāi)展實(shí)驗(yàn)研究，探索ADSCs成骨分化的發(fā)生、發(fā)展及分子生物學(xué)機(jī)制提供新的思路和依據(jù)。