馬蘭紅 白 玲 李奇鳳
(新疆兒童醫(yī)院1 兒科,2 科教科,烏魯木齊市 830000,電子郵箱;xingbabke@163.com)
支氣管哮喘是多種炎癥細胞(如肥大細胞、T淋巴細胞等),以及多種炎癥因子參與的慢性變態(tài)反應(yīng)性疾病,其特征是發(fā)生氣道高反應(yīng)性[1]。兒童支氣管哮喘的特點是起病急、癥狀重,病情不易控制,如病情長期遷延可導(dǎo)致哮喘反復(fù)發(fā)作,不利于兒童生長發(fā)育[2]。因此,深入研究支氣管哮喘的發(fā)生與發(fā)展的機制,有助于尋找評估哮喘嚴重程度的指標(biāo)及有效的治療藥物。支氣管哮喘的病理生理表現(xiàn)為支氣管局部大量炎癥細胞浸潤,且伴有大量炎癥因子的釋放,如Th1型細胞可產(chǎn)生γ-干擾素,而Th2型細胞能夠分泌白細胞介素(interleukin,IL)-4及IgE,IgE誘導(dǎo)肥大細胞及嗜酸性粒細胞脫顆粒,進而釋放組胺等介質(zhì),導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性[3]。此外,炎癥因子還可刺激氣道平滑肌細胞增生肥大及氣道纖維化等,引起氣道重塑及氣道狹窄的發(fā)生。解整合素-金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase,ADAM)33基因位于20p13,該基因編碼13個外顯子,編碼的蛋白屬于ADAM家族成員,具有ADAM家族共有的一個解體蛋白和金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域。ADAM33是膜錨定蛋白,參與了細胞-細胞和細胞-基質(zhì)相互作用的各種生物過程,如受精、肌肉發(fā)育和神經(jīng)發(fā)生等生理過程,以及腫瘤、炎癥等疾病的發(fā)生和發(fā)展[4-5]。近年來有研究顯示,ADAM33基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)與支氣管哮喘的易感性有關(guān),其參與了支氣管哮喘中氣道高反應(yīng)性的發(fā)生[6]。本研究通過檢測支氣管哮喘患兒血漿ADAM33 rs678881及rs2853209基因SNP,以及血漿γ-干擾素、IL-4、IgE的表達水平,分析ADAM33 rs678881及rs2853209與兒童支氣管哮喘的易感性及其與γ-干擾素、IL-4、IgE的關(guān)系。
1.1 臨床資料 選取2016年2月至2019年2月期間于我院兒科門診診治的238例支氣管哮喘患兒作為哮喘組,其中男性115例、女性123例,年齡2~14(6.2±2.4)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)均為初次診治,支氣管哮喘診斷均符合《兒童哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)》[7];(2)患兒1月內(nèi)無呼吸道感染、泌尿系統(tǒng)感染等感染性疾病發(fā)生;(3)無嚴重心臟及其他肺部等疾病。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)近期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等藥物的患兒;(2)合并過敏性紫癜等其他免疫性疾病的患兒;(3)患兒家屬拒絕參加本研究。以同期進行健康體檢的160例兒童作為對照組,其近1個月均無感染性疾病病史、無合并免疫性疾病或糖皮質(zhì)激素用藥史、無嚴重心肺疾病。其中男性88例、女性72例,年齡1~14(6.3±2.5)歲。哮喘組和對照組兒童的性別、年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05),具有可比性。本研究經(jīng)本院倫理委員會審核批準(zhǔn)通過。
1.2 觀察指標(biāo)的檢測
1.2.1 標(biāo)本的獲取及處理:取兩組兒童晨起空腹靜脈血約4 mL,乙二胺四乙酸抗凝,其中2 mL全血用于提取外周血DNA,另外2 mL標(biāo)本在4℃條件下2 000 r/min離心10 min分離血漿,用于檢測血漿中γ-干擾素、IL-4、IgE水平。
1.2.2 ADAM33基因rs678881及rs2853209的SNP檢測:采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性法進行檢測。應(yīng)用基因組DNA提取試劑盒(日本Takara公司,批號:KA5801CA)提取外周血DNA,實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。應(yīng)用NaroDrop2000超微量分光光度計(美國賽默飛公司)檢測DNA的濃度及純度,核酸電泳鑒定其完整性,置于-20℃冰箱保存。ADAM33 rs678881上游引物5′-TTCAAAGCCTCCCCCTCTCATC-3′,下游引物5′-TGATCCAGGAAAAGCCACAGC-3′;ADAM33 rs2853209上游引物5′-AGGGTGAGGCAGCCAGCT-3′,下游引物5′-CTTCCTCAGTGGCCTCCCAGTCAATCG-3′。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。PCR總反應(yīng)體系25 μL,包括模板DNA 0.2 mg,上下游引物各0.1 μmoL,12.5 mL PCR Master,雙蒸水補足體系。PCR程序為在95℃下預(yù)變性3 min,94℃下變性30 s,60℃下退火45 s,72℃下延伸30 s,72℃延伸7 min,共45個循環(huán)。限制性內(nèi)切酶的酶切反應(yīng)總體體系10 μL,包括PCR產(chǎn)物8 μL,核酸限制性內(nèi)切酶(EcoRⅠ)2 U,雙蒸水補足體系。酶切反應(yīng)條件為37℃水浴4 h。產(chǎn)物進行凝膠電泳,鑒定基因型。
1.2.3 血漿γ-干擾素、IL-4、IgE水平的檢測:應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血漿中γ-干擾素、IL-4、IgE水平,試劑盒購自英國Abcam公司(貨號:ab46025、ab215089、ab108650),操作嚴格按照說明書進行 。
1.3 記錄哮喘組的并發(fā)癥發(fā)生情況 觀察支氣管哮喘患兒的消化道反應(yīng)(包括腹痛腹瀉、消化道出血、糞便隱血實驗陽性)、縱隔或皮下氣腫、呼吸衰竭、心律失常、腎炎等并發(fā)癥的發(fā)生情況。
1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以(x±s)表示,組間比較采用獨立樣本t檢驗或方差分析;計數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示,組間比較采用χ2檢驗;采用Logistic回歸模型計算比值比(odds ratio,OR)以分析ADAM33基因rs678881、rs2853209位點各基因型、等位基因與兒童支氣管哮喘易感性的關(guān)系。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 ADAM33 rs678881、rs2853209基因型和等位基因的分布及其與支氣管哮喘易感性關(guān)系 (1)ADAM33 rs678881: 哮喘組與對照組的ADAM33 rs678881 GC、CC及GG基因型比例差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=26.189,P<0.001);與攜帶ADAM33 rs678881 GG基因型相比,攜帶GC、CC基因型的兒童更易發(fā)生支氣管哮喘(均P<0.05)。哮喘組ADAM33 rs678881 C等位基因分布頻率高于對照組(χ2=30.329,P<0.001);與攜帶ADAM33 rs678881G等位基因相比,攜帶C等位基因型的兒童更易發(fā)生支氣管哮喘(P<0.05)。(2)ADAM33 rs2853209 :兩組ADAM33 rs2853209各基因型比例以及等位基因分布頻率比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.108,P=0.948;χ2=0.153,P=0.696)。見表1。
表1 ADAM33基因rs678881、rs2853209位點各基因型、等位基因分布及其與支氣管哮喘易感性的關(guān)系[n(%)]
2.2 兩組研究對象血漿γ-干擾素、IL-4、IgE水平的比較 與對照組相比,哮喘組患兒血漿IL-4、IgE水平較高,而γ-干擾素水平較低(均P<0.05),見表2。
表2 兩組研究對象血漿γ-干擾素、IL-4、IgE水平的比較(x±s)
2.3 ADAM33 rs678881、rs2853209各基因型哮喘組患兒的血漿γ-干擾素、IL-4、IgE水平的比較 ADAM33 rs678881各基因型患兒之間血漿γ-干擾素、IL-4、IgE水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=34.011,P<0.001;F=9.637,P=0.001;F=103.882,P<0.001),其中攜帶ADAM33 rs678881 GG、GC、CC基因型患兒血漿IL-4、IgE水平依次升高,而γ-干擾素依次降低(均P<0.05)。rs2853209各基因型患兒之間血漿γ-干擾素、IL-4、IgE水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.535,P=0.591;F=0.393,P=0.677;F=2.064,P=0.130)。見表3。
表3 ADAM33 rs678881、rs2853209各基因型支氣管哮喘患兒的血漿γ-干擾素、IL-4、IgE水平的比較(x±s)
2.3 ADAM33 rs678881、rs2853209各基因型與支氣管哮喘并發(fā)癥發(fā)生情況的比較 與攜帶ADAM33 rs678881 GG基因型相比,攜帶GC、CC基因型支氣管哮喘患兒的并發(fā)消化道反應(yīng)發(fā)生率較高(均P<0.05),而縱隔或皮下氣腫、呼吸衰竭、心律失常、腎炎的發(fā)生率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05),見表4。rs2853209各基因型支氣管哮喘患兒的消化道反應(yīng)、縱隔或皮下氣腫、呼吸衰竭、心律失常、腎炎發(fā)生率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05),見表5。
表4 ADAM33 rs678881各基因型支氣管哮喘患兒的并發(fā)癥發(fā)生情況的比較[n(%)]
表5 ADAM33 rs2853209各基因型支氣管哮喘患兒的并發(fā)癥發(fā)生情況的比較[n(%)]
支氣管哮喘是兒童常見的呼吸系統(tǒng)慢性疾病。近年來我國兒童支氣管哮喘的患病率有逐漸增高的趨勢,其不僅影響患兒健康,還給家庭及社會帶來沉重負擔(dān)[8]。多數(shù)支氣管哮喘患者經(jīng)規(guī)范、足療程的支氣管擴張劑和吸入激素治療后病情可達到完全控制,但仍有部分患者的病情不能完全控制,特別是支氣管哮喘患兒,治療難度大,病情遷延易導(dǎo)致哮喘反復(fù)發(fā)作。因此,深入研究支氣管哮喘的發(fā)病機制,尋找關(guān)鍵的診斷治療靶點具有重要意義。支氣管哮喘是一種與多基因遺傳有關(guān)的疾病,受到遺傳和環(huán)境等因素的影響,目前已發(fā)現(xiàn)多種支氣管哮喘的易感基因,影響疾病的發(fā)生和發(fā)展[9]。ADAM33基因是近年來發(fā)現(xiàn)的新的支氣管哮喘易感基因,其為ADAM家族成員,編碼蛋白含800個氨基酸,包含許多保守的結(jié)構(gòu)域等,如信號肽、金屬蛋白酶、解整合素、跨膜結(jié)構(gòu)域及細胞內(nèi)糖蛋白結(jié)構(gòu)域,通過相應(yīng)結(jié)構(gòu)域參與各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。研究表明,ADAM33蛋白在平滑肌細胞及間質(zhì)細胞中表達豐富,而上皮細胞中表達量較低,ADAM33蛋白水解酶活性的提高與支氣管哮喘發(fā)生時氣道高反應(yīng)性及肺功能下降關(guān)系密切,參與氣道重塑等病理過程[10]。而ADAM33基因的SNP能影響支氣管哮喘的遺傳易感性[11]。因此,深入研究影響支氣管哮喘發(fā)生和發(fā)展的ADAM33基因關(guān)鍵SNP位點,為防治支氣管哮喘提供理論依據(jù)具有重要意義[12]。
本研究分析ADAM33 基因rs678881位點的SNP與支氣管哮喘易感性的關(guān)系,結(jié)果顯示,與對照組比較,哮喘組ADAM33 rs678881 GC、CC基因型比例以及C等位基因頻率均更高(均P<0.05);與攜帶ADAM33 rs678881 GG基因型、G等位基因相比,攜帶GC、CC基因型及C等位基因的兒童更易發(fā)生支氣管哮喘(P<0.05)。這表明ADAM33 rs678881 GC、CC基因型與支氣管哮喘的遺傳易感性有關(guān),C等位基因型增加兒童支氣管哮喘的易感性[12]。分析原因可能是由于ADAM33 rs678881的基因位點位于基因啟動子區(qū)CpG島的位置,正常上皮細胞中CpG島處于高甲基化狀態(tài),而間質(zhì)細胞如平滑肌細胞中甲基化程度較低,支氣管哮喘發(fā)生時該位點的SNP導(dǎo)致ADAM33基因甲基化程度減弱,促進該基因的表達,ADAM33進而參與促進氣道高反應(yīng)性及氣道重塑性改變[5,13]。而本研究結(jié)果提示ADAM33 基因rs2853209位點的SNP未增加支氣管哮喘患兒的遺傳易感性,其機制尚不清楚,可能是該位點位于內(nèi)含子區(qū)域,對ADAM33蛋白表達量及活性的影響不明顯。
此外,本研究中攜帶ADAM33 rs678881 GC、CC基因型的支氣管哮喘患兒血漿IL-4、IgE水平均明顯高于攜帶GG基因型的患兒,而γ-干擾素水平均低于GG基因型患兒(均P<0.05),表明ADAM33 基因rs678881的SNP可能與反映支氣管哮喘嚴重程度的血漿指標(biāo)γ-干擾素、IL-4、IgE水平有關(guān),ADAM33基因rs678881的SNP也參與促進支氣管哮喘的發(fā)展。其原因可能為:一方面,ADAM33 基因的表達受到氣道炎癥程度的調(diào)控。研究顯示,支氣管哮喘發(fā)生時,Th2類細胞因子如IL-4、轉(zhuǎn)化生長因子β能夠直接促進ADAM33 基因的表達,促進成纖維細胞的分化及增殖,導(dǎo)致氣道重塑[14],而抑制ADAM33 基因表達的γ-干擾素顯著下調(diào),進一步促進成纖維細胞的增殖[15]。另一方面,ADAM33本身具有金屬蛋白酶活性,能夠促進膜結(jié)合的生長因子及其相應(yīng)受體的釋放,如表皮生長因子及其受體、胰島素生長因子及其受體等,促進T細胞向Th1和Th2亞型分化,促進Th2亞型IL-4的表達,招募并活化B細胞產(chǎn)生IgE[16-17]。因此,ADAM33與γ-干擾素、IL-4等炎癥介質(zhì)間可能存在正反饋環(huán)路,共同促進支氣管哮喘的發(fā)展。
本研究進一步分析ADAM33基因rs678881及rs2853209位點各基因型與支氣管哮喘患兒并發(fā)癥的關(guān)系,結(jié)果顯示攜帶ADAM33基因rs678881 GC、CC基因型支氣管哮喘患兒的消化道反應(yīng)的發(fā)生率高于GG基因型(P<0.05),而不同rs2853209基因型患兒間的并發(fā)癥的發(fā)生率差異并無統(tǒng)計學(xué)意義,表明ADAM33 rs678881 GC、CC基因型可能有助于判斷支氣管哮喘患兒有無消化道反應(yīng)的發(fā)生,其原因可能是rs678881 GC、CC基因型患兒的機體處于炎癥反應(yīng)狀態(tài)較重,引起胃腸道功能紊亂,導(dǎo)致嘔吐、腹瀉等臨床癥狀[18]。
綜上所述,ADAM33 rs678881 GC、CC基因型及C等位基因增加支氣管哮喘患兒的易感性,而rs2853209基因SNP可能與支氣管哮喘患兒的易感性無關(guān)。同時,攜帶ADAM33 rs678881 GC、CC基因型的支氣管哮喘患兒血漿IL-4、IgE水平較高而γ-干擾素水平較低,且消化道反應(yīng)的發(fā)生率高,ADAM33 rs678881 GC、CC基因型可能參與了兒童支氣管哮喘的發(fā)展。但本研究樣本量較小,未能考慮環(huán)境因素對支氣管哮喘的影響,因此有待進一步研究以驗證ADAM33基因SNP對兒童支氣管哮喘發(fā)生與發(fā)展機制的影響。