表沒食子兒茶素沒食子酸酯對牙齦卟啉單胞菌細(xì)菌毒力抑制作用的體外研究

齊霞， 孔令雪， 李淑娟， 馬思婷， 齊雅麗， 趙蕾

1. 河北醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院牙周一科，河北省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北省口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，河北 石家莊（050017）； 2.濟(jì)南口腔醫(yī)院牙周黏膜科，山東 濟(jì)南（250001）； 3.口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院牙周科，四川 成都（610041）

牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）是牙周炎的主要致病菌。P. gingivalis 參與形成齦下菌斑生物膜，通過改變生物膜的組成及負(fù)荷，引起菌群失調(diào)，與牙周疾病的發(fā)生發(fā)展及治療失敗相關(guān)［1?3］。P. gingivalis 可分泌牙齦素等毒力因子直接破壞牙周組織［4］，同時(shí)，還可入侵宿主細(xì)胞使其釋放大量炎癥因子，如基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs），導(dǎo)致牙周組織的繼發(fā)性損傷［5?7］。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocate?chin?3?gallate，EGCG）是綠茶兒茶酸中最主要成分，占其總重的59%。研究顯示每天飲用1 杯綠茶，可顯著降低牙周病的發(fā)病率及嚴(yán)重程度［8］。用P.gin?givalis 感染小鼠構(gòu)建牙周炎動(dòng)物模型，口腔內(nèi)注射40 mg/kg 的EGCG 溶液4 周發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組牙周組織炎癥顯著減輕，且血液中上調(diào)的白介素?1β（interleukin?1β，IL?1β）表達(dá)水平顯著降低［9］，提示EGCG 可減輕P.gingivalis 引起的牙周炎癥，但其具體機(jī)制仍有待深入探究。本研究探討EGCG 對P. gingivalis 生物膜、毒力因子的抑制作用及EGCG 對P. gingivalis 刺激的人牙齦成纖維細(xì)胞（human gingival fibroblasts，HGFs）分泌MMPs的能力。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

EGCG（杭州禾田生物制品有限公司）；P. gin?givalis ATCC33277 由四川大學(xué)口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；心腦浸出液培養(yǎng)基（brian heart infusion，BHI）（Oxiod，英 國）；XTT 試 劑 盒（Syn?chem，美國）；精氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（argi?nine gingipain，Rgp）特異性產(chǎn)色底物、賴氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（lysine gingipain，Kgp）特異性產(chǎn)色底物、二硫蘇糖醇（Dithiothreitol，DTT）（Sigma，美國）；胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基（Hyclone，美國）；Trizol（Invitrogen，美國）；人MMP?1、MMP?1 ELISA試劑盒（優(yōu)爾生科技股份有限公司，中國）；RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT?PCR 試劑盒（TakaRa，日本）。酶標(biāo)儀（Thermo，美國）；掃描電鏡（Inspect FEI，荷蘭）；ABI7300 熒光定量PCR 儀（Applied Biosystems，美國）。

1.2 EGCG 對P.gingivalis 浮游菌生長的影響

采用微量稀釋法梯度稀釋EGCG 并加入96 孔板 中 與1 × 108CFU/mL P. gingivalis 菌 懸 液 各100 μL 混合，使EGCG 終濃度為1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.8、3.9 μg/mL，于37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h 后，酶標(biāo)儀A655nm測吸光度值，確定最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）及最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）。另設(shè)不含EGCG的空白對照組。每組設(shè)3個(gè)平行孔。

1.3 EGCG 對P.gingivalis 生 物 膜 的 影 響

1.3.1 結(jié)晶紫染色法檢測EGCG 對P. gingivalis 生物膜形成的抑制作用 將P. gingivalis 菌懸液（100 μL 每孔）與不同濃度EGCG（100 μL 每孔）37 ℃厭氧共培養(yǎng)24 h，另設(shè)陽性對照組（100 μL BHI 及100 μL P. gingivalis 菌懸液），陰性對照組（200 μL BHI）以及藥物對照組（100 μL BHI 及100 μL 不同濃度EGCG）。結(jié)晶紫染色，酶標(biāo)儀A550nm測量吸光度值。藥物最低生物膜抑制濃度（minimum biofilm inhibition concentration，MBIC）為與對照組相比，抑制50%或90%生物膜形成的最低 藥 物 濃 度，即MBIC50和MBIC90［10］。每 組 設(shè)4 個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。計(jì)算生物膜形成的相對形成率：生物膜形成相對抑制率=1-（實(shí)驗(yàn)組A550nm-藥物組A550nm）/（陽性對照組A550nm-陰性對照組A550nm）×100%。

1.3.2 結(jié)晶紫染色法檢測EGCG 對P.gingivalis成熟生物膜的清除作用 P. gingivalis 菌懸液200 μL 培養(yǎng)24 h，形成成熟生物膜，PBS 洗去浮游菌后，加入200 μL微量液體稀釋法梯度稀釋后終濃度為1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.8、3.9 μg/mL EGCG，分別設(shè)置陽性對照組（200 μL P.gingivalis菌懸液），陰性對照組（200 μL BHI）及藥物對照組（200 μL 不同濃度EGCG），繼續(xù)厭氧培養(yǎng)24 h 后，結(jié)晶紫染色，測量A550nm下的吸光度值。計(jì)算藥物最低清除已形成生物膜清除濃度（minimum biofilm reduction concentration，MBRC）［11］，即MBRC50和MBRC90。成熟生物膜相對清除率=1-（實(shí)驗(yàn)組A550nm-藥物組A550nm）/（陽性對照組A550nm-陰性對照組A550nm）× 100%。

1.3.3 XTT 法檢測EGCG 對P. gingivalis 成熟生物膜活性的影響 在P. gingivalis 成熟生物膜中加入不同濃度EGCG，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h 后，每孔加入120 μL XTT?甲萘醌混合溶液，37 ℃黑暗培養(yǎng)2 h，測A490nm下的吸光度值。計(jì)算成熟生物膜活性的最小抑菌濃度（sessile minimal inhibitory concentration，SMIC）［12］，即SMIC50和SMIC90，固著狀態(tài)細(xì)菌活性相對抑制率=1-（實(shí)驗(yàn)組A490nm-藥物組A490nm）/（陽性對照組A490nm-陰性對照組A490nm）× 100%。

1.4 掃描電鏡觀察EGCG 對P.gingivalis 成熟生物膜的清除作用

在24 孔板內(nèi)放置無菌圓形玻片，EGCG 與P.gingivalis 成熟生物膜共培養(yǎng)24 h 后，2.5%戊二醛固定，乙醇梯度脫水，醋酸異戊酯液置換，二氧化碳臨界干燥，離子濺射表面固定鍍膜致材料表面成金黃色，掃描電子顯微鏡（scanning electron micros?copy，SEM）觀察分析。

1.5 EGCG 抑制牙齦素的蛋白水解活性

收集P. gingivalis 并稀釋至Rgp 組P. gingivalis濃度為A660nm=2，Kgp 組為A660nm=1，4 ℃10 000 g 離心10 min 后，取上清液100 μL，依次加入50 μL 終濃度為0、10、50 μg/mL EGCG，25 μL 0.04 mol/L DTT 及濃度為0.016 mol/L Rgp 或Kgp 特異性產(chǎn)色底物，設(shè)無P. gingivalis 的為陰性對照組，將混合物37 ℃暗培養(yǎng)，分別于15 min、30 min、45 min、1 h、2 h、3 h、4 h 在酶標(biāo)儀A490nm測量吸光度值。

1.6 HGFs 的原代培養(yǎng)

采用酶消化聯(lián)合組織塊法培養(yǎng)人原代牙齦成纖維細(xì)胞［7］，第4～6 代用于實(shí)驗(yàn)。本研究已獲四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：WCHSIRB?ST?2012?067）。

1.7 MTT 法測定P.gingivalis 及EGCG 對牙齦成纖維細(xì)胞的細(xì)胞毒性

收集對數(shù)生長期HGFs 接種于96 孔板，并加入濃度為1、10、50、100、250、500 μg/mL EGCG 或感染復(fù)數(shù)為50、100、200、250、500 的P. gingivalis，培養(yǎng)24 h 后，依次加入20 μL MTT 及200 μL DMSO，測量并計(jì)算細(xì)胞存活率。另設(shè)不含EGCG 的空白對照組及不含細(xì)胞的陰性對照組。

1.8 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

接種5×105個(gè)/mL 的HGFs 于6 孔板，培養(yǎng)24 h；同時(shí)，加入P. gingivalis（MOI 值為200）及終濃度為50 μg/mL 和10 μg/mL 的EGCG。另設(shè)不含P. gingi?valis 或EGCG 的對照組。37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)共培養(yǎng)24 h。11 000 g 離心10 min 收集細(xì)胞上清液?20 ℃凍存。

1.9 ELISA 法檢測MMP?1 及MMP?2 的蛋白分泌量

采用BCA 蛋白濃度試劑盒測定總蛋白濃度，ELISA 試劑盒檢測HGFs 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP?1及MMP?2 的含量。

1.10 qRT?PCR 分 析P. gingivalis 感 染 的HGFs 中MMP?1，MMP?2 mRNA 的表達(dá)

Trizol 法提取HGFs 總RNA，分光光度計(jì)測定總RNA 濃度及純度。Takara 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA，進(jìn)行qRT?PCR 定量分析。引物序列見表1。擴(kuò)增條件：預(yù)變性（95 ℃30 s）1 個(gè)循環(huán)；PCR 反應(yīng)（95 ℃變性5 s，60 ℃31 s）40 個(gè)循環(huán)，終止反 應(yīng)（95 ℃5 s；60 ℃30 s；95 ℃15 s）1 個(gè)循環(huán)。按照2?△△Ct法計(jì)算各組的目的基因相對表達(dá)量。

表1 qRT?PCR 反應(yīng)中引物序列Table 1 The primers sequence of the genes used in qRT?PCR

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，定量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（x ± s）表示，符合正態(tài)分布與方差齊性的采用單因素方差分析（ANOVA），若不符合采用Kruskal?Wallis 非參數(shù)檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用LSD 法檢驗(yàn)或Dunnett's T3 檢驗(yàn)。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 EGCG 對P.gingivalis 浮游菌及生物膜的影響

將P. gingivalis ATCC33277 接種于BHI 血瓊脂平板，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，光鏡下為革蘭氏陰性染色的球桿菌（圖1）。EGCG 對P. gingivalis 浮游菌MIC 和MBC 分別為62.5 μg/mL，500 μg/mL（表2）。7.8～125 μg/mL EGCG 對P.gingivalis 生物膜形成具有抑制作用，呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系（P ＜0.05，圖2a）；其中，MBIC50為7.8 μg/mL，MBIC90為31.25 μg/mL。EGCG 對24 h 形成的P. gingivalis 生物膜表現(xiàn)出清除作用，MBRC50為250 μg/mL（圖2b）。125 μg/mL的EGCG 即可抑制50%固著狀態(tài)細(xì)菌活性，即SMIC50；62.5～1 000 μg/mL 的實(shí)驗(yàn)組生物膜細(xì)菌活性均低于空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2c，P ＜0.05）。掃描電鏡觀察結(jié)果顯示：與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組生物膜的量明顯減少，致密結(jié)構(gòu)變得疏松多孔，1 000 μg/mL EGCG組細(xì)胞間幾乎無連接（圖3）。

圖1 P. gingivalis ATCC33277 菌株培養(yǎng)（×1 000）Figure 1 Culture of P. gingivalis ATCC33277（×1 000）

表2 EGCG 對P. gingivalis 浮游菌及生物膜的作用Table 2 Effects of EGCG against P. gingivalis planktonic culture and biofilms

2.2 EGCG 對牙齦素蛋白水解活性的抑制作用

低于MIC 濃度的EGCG 均可抑制Rgp 對蛋白的降解作用（P ＜0.05），10、50 μg/mL 的EGCG 抑制率 分 別 為（49.92 ± 6.41）%，（69.56 ± 3.62）%（圖4a），且10、50 μg/mL EGCG 對Rgp 蛋白降解抑制作用在1、2、3、4 h 組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖4b）。P. gingivalis Kgp 蛋白水解活性同樣被抑制（P ＜0.05），抑制率分別為（37.50 ± 1.91）%和（49.40 ± 3.61）%，50 μg/mL EGCG 對Kgp 蛋白降解抑制作用在3、4 h 組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖4c、4d）。

2.3 P. gingivalis 及EGCG 對HGFs 細(xì)胞活性影響

與對照組相比，P. gingivalis 在MOI 值250∶1 及500∶1 時(shí)對HGFs 的生長有抑制作用（P ＜0.05，圖5a）。500 μg/mL EGCG 抑制HGFs 的生長，250 μg/mL 及以下濃度EGCG 對HGFs 細(xì)胞存活無影響（圖5b）。

2.4 EGCG 對P. gingivalis 刺激下HGFs 表達(dá)MMP?1、MMP?2 水平的影響

與陰性對照組相比，陽性對照組MMP?1 和MMP?2 的分泌分別上升了1.4 倍和1.6 倍。與陽性對照組相比較，50 μg/mL EGCG 實(shí)驗(yàn)組HGFs 上清液中MMP?1 和MMP?2 的分泌被抑制（P ＜0.05），而10 μg/mL EGCG 對其無明顯抑制作用（圖6a、6b）。

Figure 2 Inhibitory effect of different concentrations of EGCG on P. gingivalis biofilm圖2 不同濃度EGCG 對P. gingivalis 生物膜的抑制作用

Figure 3 Effect of the EGCG concentration on the mature biofilms of P. gingivalis using SEM（× 10 000）圖3 SEM 觀察不同濃度EGCG 對P. gingivalis 成熟生物膜的影響（× 10 000）

Figure 4 Effect of EGCG on P. gingivalis Rgp and Kgp activities圖4 EGCG 對P. gingivalis Rgp 及Kgp 蛋白水解活性的影響

qRT?PCR 結(jié)果顯示：與陽性對照組相比，50 μg/mL EGCG 可顯著抑制P. gingivalis 刺激HGFs 后MMP?1 和MMP?2 mRNA 水平升高（P ＜0.05），10 μg/mL 和50 μg/mL 的EGCG 對MMP?1 mRNA 表達(dá)的抑制率分別為（28.3 ± 6.58）%和（50.69 ± 6.95）%（P ＜0.05），50 μg/mL 的EGCG 對MMP?2 mRNA 表達(dá)的抑制率為（62.92 ± 11）%（圖6c、6d）。

Figure 6 Effect of EGCG on the secretion of MMP?1 and MMP?2 by HGFs stimulated by P. gingivalis圖6 不同濃度EGCG 對P. gingivalis 刺激后HGFs 表達(dá)MMP?1 及MMP?2 的影響

3 討 論

綠茶兒茶素具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗癌等多種藥理作用，其主要成分EGCG 抗菌作用最強(qiáng)且抗菌譜廣［13］。EGCG 可在細(xì)胞質(zhì)膜的脂質(zhì)層中產(chǎn)生過氧化氫，導(dǎo)致細(xì)胞的裂解［14］；螯合細(xì)菌生長必須的鐵離子，造成菌體營養(yǎng)缺乏［15］。此外，EGCG 還可抑制細(xì)胞質(zhì)二氫葉酸還原酶，從而抑制核酸前體的合成［16］。EGCG 對牙周炎主要致病菌P.gingivalis有抗菌作用，MIC為31.25～500 μg/mL［17?20］。本研究結(jié) 果 顯 示：EGCG 抑 制P. gingivalis ATCC 33277 浮游菌的生長，MIC 為62.5 μg/mL。

菌斑生物膜形成和成熟是牙周病發(fā)生的關(guān)鍵，且成熟生物膜中細(xì)菌活性更高，較浮游菌對抗生素或宿主防御功能的抵抗作用更強(qiáng)。因此，抑制生物膜形成、清除成熟生物膜和抑制成熟生物膜活性三個(gè)方面能較全面反應(yīng)藥物對菌斑生物膜的影響。本研究發(fā)現(xiàn)：低于MIC 濃度的EGCG 對P.gingivalis 生物膜的形成有顯著的抑制作用，且呈劑量依賴效應(yīng)關(guān)系。以上結(jié)果與Ben 等［15］結(jié)果類似，在不對細(xì)菌生長產(chǎn)生顯著影響的前提下，EGCG 可抑制具核梭桿菌生物膜的形成。本研究發(fā)現(xiàn)EGCG 對已形成的P. gingivalis 生物膜具有清除作用，掃描電鏡分析發(fā)現(xiàn)EGCG 改變P. gingivalis成熟生物膜的結(jié)構(gòu)，生物膜致密結(jié)構(gòu)變薄且疏松，細(xì)菌量減少。此外，XTT 法檢測EGCG 對成熟生物膜 活 性 的 抑 制 作 用，SMIC50為125 μg/mL。Asahi等［21］通過激光共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)EGCG 處理組P.gingivalis 成熟生物膜中死菌的比例明顯高于對照組，進(jìn)一步證實(shí)EGCG 可抑制成熟生物膜活性。根據(jù)以上結(jié)果推測：EGCG 可能通過抑制P. gingivalis的黏附，初步抑制生物膜的形成。此外，EGCG 可抑制成熟生物膜的活性并對成熟生物膜有清除作用，形成疏松多孔的生物膜，利于免疫細(xì)胞、藥物等進(jìn)一步滲透，并利于機(jī)械方法清除齦下菌斑。

多項(xiàng)體外研究證實(shí)，EGCG 可抑制細(xì)菌的毒力因子活性。變異鏈球菌是主要致齲菌，葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（glucosyltransferase，GTF）是變異鏈球菌重要的致病因子。EGCG 可抑制葡糖基轉(zhuǎn)移酶合成葡聚糖，阻礙細(xì)菌黏附形成菌斑生物膜［22］。此外，EGCG可抑制莫雷梭菌（Solobacterium moorei，S moorei）表達(dá)β?半乳糖苷酶基因，從而減少與口臭相關(guān)揮發(fā)性硫化物的產(chǎn)生［23］。牙齦素是P. gingivalis 最重要的毒力因子，參與攝取氨基酸，提供營養(yǎng)；促進(jìn)細(xì)菌黏附共聚及菌毛成熟，形成菌斑生物膜［7，24?25］；降解細(xì)胞間黏附分子及多種細(xì)胞因子、補(bǔ)體成分，入侵宿主防御反應(yīng)，最終導(dǎo)致牙周組織破壞［26?27］。研究發(fā)現(xiàn)EGCG 能抑制rgpA 和kgp 基因的表達(dá)，減少Rgp 和Kgp 的分泌［19］，但尚無對Rgp 和Kgp 活性的研究。本研究結(jié)果顯示：低于MIC 劑量的EGCG 可顯著抑制P. gingivalis 牙齦素Rgp 和Kgp 裂解特異性產(chǎn)色底物釋放顯色團(tuán)P?硝基苯胺的水平。

宿主對牙周致病菌的免疫反應(yīng)是造成牙周組織破壞的主要原因，牙周結(jié)締組織中最主要的細(xì)胞成分為HGFs，牙周致病菌主要通過刺激HGFs分泌MMPs，破壞細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)，引起牙周組織 破壞［28?30］。研究證實(shí)EGCG 可抑制伴放線放線桿菌?LPS［31］及牙齦卟 啉單胞菌?LPS［32］誘導(dǎo)HGFs分泌MMPs。本實(shí)驗(yàn)采用P. gingivalis 直接刺激宿主HGFs 產(chǎn)生MMP?1 和MMP?2，在加入50 μg/mL EGCG 后，HGFs 中MMP?1 和MMP?2 的分泌及表達(dá)均下調(diào)。

日常綠茶飲品中兒茶素平均濃度為1 mg/mL［33］，EGCG 約500 μg/mL，足以抑制P. gingivalis的生長及生物膜的形成，此外，超聲震動(dòng)不會(huì)引起EGCG 的明顯降解［34］?；谕僖旱臎_刷作用，難以保證EGCG 的有效抗菌濃度，50 μg/mL EGCG 仍可抑制P. gingivalis 毒力因子牙齦素，抑制P. gingiva?lis 誘導(dǎo)牙齦成纖維細(xì)胞表達(dá)MMPs。綜上所述，EGCG 可作為伴全身疾病的牙周炎輔助治療的潛在藥物。本課題組后續(xù)將建立動(dòng)物模型，多方面證實(shí)EGCG 的抗菌及抗炎作用，以期為牙周炎的防治提供更多依據(jù)。

【Author contributions】Qi X and Kong LX performed the experi?ments，analyzed the data，and wrote and revised the article. Li SJ，Ma ST，Qi YL wrote and revised the article. Zhao L designed the study，wrote and revised the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.