基于介孔硅的姜黃素?siRNA 共遞送系統(tǒng)構(gòu)建及其對(duì)巨噬細(xì)胞M2 型極化的影響

李沛漢， 郎凱， 宋文

1. 軍事口腔醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，口腔疾病國(guó)家臨床醫(yī)學(xué)研究中心，陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，空軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院修復(fù)科，陜西 西安（710032）； 2. 空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院學(xué)員二大隊(duì)七隊(duì)，陜西 西安（710032）

種植修復(fù)目前已逐漸成為口腔牙齒缺失的主要修復(fù)方式，其中種植體與骨組織間形成的骨結(jié)合是其發(fā)揮功能的生物學(xué)基礎(chǔ)［1］。巨噬細(xì)胞是介導(dǎo)固有免疫反應(yīng)的主體細(xì)胞，在外界刺激下可通過(guò)向不同方向極化來(lái)分泌不同細(xì)胞因子，對(duì)局部組織的炎癥反應(yīng)發(fā)揮調(diào)控作用［2］。近年來(lái)，巨噬細(xì)胞在骨結(jié)合形成中的作用越來(lái)越受到重視。研究表明，當(dāng)種植體植入體內(nèi)后，巨噬細(xì)胞首先發(fā)生反應(yīng)，且其極化方向?qū)τ谏锊牧系念A(yù)后具有顯著影響。巨噬細(xì)胞的極化可分為M1 和M2 兩大類，在種植體植入早期為手術(shù)創(chuàng)傷造成的無(wú)菌性炎癥反應(yīng)，巨噬細(xì)胞向M1 方向極化分泌炎性因子，及時(shí)清理局部壞死組織碎片；隨著時(shí)間推移，巨噬細(xì)胞向M2 方向極化，分泌促進(jìn)組織愈合的生長(zhǎng)因子，促進(jìn)種植體建立骨結(jié)合［3］。因此，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2 方向極化目前已經(jīng)成為促進(jìn)種植體骨結(jié)合的新策略［4］。

已有研究證實(shí)多種刺激均可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2 極化，主要包括材料表面的物理形貌刺激［5］、化學(xué)基團(tuán)誘導(dǎo)［6］以及細(xì)胞因子刺激［7］等，其中姜黃素（curcumin，CUR）是最為經(jīng)典的誘導(dǎo)M2 極化的小分子藥物之一，其作用的機(jī)理主要是通過(guò)激活巨噬細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxi?some proliferator?activated receptor γ，PPARγ）誘導(dǎo)M2 極化發(fā)生［8］，被廣泛應(yīng)用于抗炎治療中，是極具治療前景的小分子藥物。另一方面，有研究證實(shí)miRNA?130a?3p 為PPARγ內(nèi)源性抑制分子，采用其反義寡核苷酸（anti?sense oligonucleotides，ASO）轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞后可解除miRNA?130a?3p 對(duì)PPARγ的抑制作用，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2 極化［9］。因此，筆者推測(cè)將ASO 與CUR 共遞送至巨噬細(xì)胞內(nèi)，利用ASO 解除miRNA?130a?3p 對(duì)PPARγ的抑制，有利于CUR 與PPARγ受體的結(jié)合，高效地誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2 型極化。共遞送系統(tǒng)是在一種載體上同時(shí)負(fù)載兩種具有協(xié)同作用的藥物分子，同時(shí)遞送至靶細(xì)胞后二者可發(fā)揮協(xié)同作用，進(jìn)一步增強(qiáng)藥物的治療作用［10］。

基于以上分析，本研究擬采用廣泛使用的介孔硅納米粒（mesoporous silica nanoparticles，MSN）構(gòu)建共遞送系統(tǒng)，利用MSN 內(nèi)部的規(guī)則孔道吸附小分子CUR，在外層利用聚乙烯亞胺（polyethyleni?mine，PEI）吸附siRNA/miRNA 分子［11］，分析其對(duì)巨噬細(xì)胞的作用，為高效誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2 極化提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 主要材料 十六烷基三甲基溴化銨（cetyltri?methylammonium bromide，CTAB）、氫氧化鈉（sodi?um hydroxide，NaOH）、正硅酸四乙酯（tetraethyl or?thosilicate，TEOS）、PEI（Sigma?Aldrich，美 國(guó)）；RAW264.7 小鼠巨噬細(xì)胞系（ATCC，美國(guó)）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青?鏈霉素、PBS 緩沖液、胰蛋白酶等細(xì)胞培養(yǎng)試劑（Hyclone，美國(guó)）；MTT、DAPI、CUR、DiI（MP Biomedical，美國(guó)）；總RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、引物以及實(shí)時(shí)定量PCR 試劑盒（TaKaRa，日本）；抗體（ABCAM，英國(guó)）；靶向GAP?DH 的siRNA（siGAPDH，正義：5'?CACUCAAGAUU?GUCAGCAATT?3'；反義：5'?UUGCUGACAAUCUUG?AGUGAG?3'）、siRNA 陰性對(duì)照（siNC，正義：5'?UU?CUCCGAACGUGUCACGUTT?3'；反義：5'?ACGUG?ACACGUUCGGAGAATT?3'）、miRNA 錯(cuò) 配 序 列 陰性 對(duì) 照（miNC，5'?CGGUACGAUCGCGGCGGGAU?AUC?3'）、miR?130a?3p 反義寡核苷酸（ASO，5'?AUGCCCUUUAACAUUGCACUG?3'）等購(gòu)于上海吉瑪公司。

1.2 MSN 的合成及共遞送系統(tǒng)構(gòu)建

依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［12］，采用常規(guī)sol?gel 方法制備MSN，即稱取0.50 g CTAB 溶解于250 mL 去離子水中，加入1.75 mL 2.0 mol/L NaOH 溶液，充分?jǐn)嚢璨⑸郎刂?0 ℃，反應(yīng)30 min，然后在劇烈攪拌下加入2.75 mL TEOS，至產(chǎn)生白色沉淀后加入2.50 mL 乙酸乙酯，80 ℃反應(yīng)2 h。室溫陳化過(guò)夜后，離心，用超純水和無(wú)水乙醇各洗滌3 次，抽濾，真空干燥，得到白色固體。將白色固體轉(zhuǎn)入三口燒瓶中，加入50 mL 無(wú)水乙醇，2.5 mL 鹽酸充分分散后，80 ℃加熱回流24 h 去除CTAB，用超純水和無(wú)水乙醇各洗滌3 次，抽濾。真空干燥，得到MSN。

1.3 CUR 與siRNA 的共遞送系統(tǒng)構(gòu)建

采用MSN 構(gòu)建CUR 與質(zhì)粒的共遞送系統(tǒng)進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)［13］。取上述MSN 粉末4 mg 加入到1 mL 含有1 mg CUR 的無(wú)水乙醇溶液中，使藥物與載體的質(zhì)量比分別為1∶4，超聲至MSN 完全分散后，磁力攪拌過(guò)夜，將溶液于15 000 rpm/min 離心15 min，沉淀經(jīng)無(wú)水乙醇洗滌3 次，真空干燥，得到淡黃色顆粒CUR@MSN。稱取1 mg PEI 加入到1 mL 無(wú)水乙醇中超聲分散，將CUR@MSN 加到PEI 溶液中，水浴超聲30 min，離心，無(wú)水乙醇洗滌3 次，得到（CUR@MSN）PEI。將（CUR@MSN）PEI 顆粒加入到siRNA（2 μmol/L）溶液中，水浴超聲30 min，離心，無(wú)水乙醇洗滌3 次，得到（CUR@MSN）PEI/siRNA 納米共遞送系統(tǒng)。將樣品分散在無(wú)水乙醇中，滴在銅網(wǎng)上，在室溫下干燥數(shù)小時(shí)后行透射電鏡觀察。

將適當(dāng)稀釋后的CUR@MSN 吸取1 mL 轉(zhuǎn)入透析袋內(nèi)（截留相對(duì)分子質(zhì)量為3 500），密封后放入200 mL 含0.2% SDS 的PBS 溶液中，于37 ℃恒溫水??；分別于2、4、6、12、24、48、72 h 后取透析液1 mL，同時(shí)補(bǔ)充等量的釋放介質(zhì)；通過(guò)在酶標(biāo)儀A425nm處測(cè)定吸光度的方法測(cè)定CUR 含量，并計(jì)算累積釋放百分比。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及活力檢測(cè)

采用巨噬細(xì)胞株RAW264.7 細(xì)胞進(jìn)行后期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞培養(yǎng)液為DMEM+10%胎牛血清+1%青?鏈霉素，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在細(xì)胞密度為80%左右時(shí)進(jìn)行胰蛋白酶消化傳代。將細(xì)胞接種在96 孔板內(nèi)，將（CUR@MSN）PEI 納米粒用培養(yǎng)基倍比稀釋后處理細(xì)胞24 h，隨后換成普通培養(yǎng)基再培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力。具體方法：將5 mg/mL 的MTT 溶液與培養(yǎng)液預(yù)混合（MTT：培養(yǎng)液=1∶4）后加入細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)，每孔200 μL，在細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育4 h 后取出，酶標(biāo)儀A580nm測(cè)吸光度值，并用未處理細(xì)胞進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果觀察

將RAW264.7 細(xì)胞接種在玻底培養(yǎng)皿內(nèi)，使用FAM 熒光標(biāo)記的siRNA 進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，在轉(zhuǎn)染結(jié)束后與含DiI 染料的培養(yǎng)基孵育15 min，吸棄培養(yǎng)液后使用4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，PBS清洗兩遍，DAPI 染色液染色5 min，PBS 清洗兩遍后，使用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果。

另一方面，在轉(zhuǎn)染結(jié)束后立刻采用胰蛋白酶消化，離心收集細(xì)胞團(tuán)塊，采用2.5%戊二醛與4%多聚甲醛混合液（1∶1）進(jìn)行固定后采用1%鋨酸進(jìn)行二次固定，酒精梯度脫水后環(huán)氧樹脂包埋、鉆石刀超薄切片，銅網(wǎng)撈片后行醋酸鈾/檸檬酸鉛染色，透射電鏡觀察納米粒在細(xì)胞內(nèi)的分布情況。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR（RT?qPCR）檢測(cè)GAPDH 的沉默效率

將RAW264.7 細(xì)胞接種在6 孔板內(nèi)，按照轉(zhuǎn)染復(fù)合物的不同分成4 組，即實(shí)驗(yàn)組：CUR?siGAPDH共遞送體系［（CUR@MSN）PEI/siGAPDH］；對(duì)照組：未處理細(xì)胞（未進(jìn)行轉(zhuǎn)染）、空白載體［（CUR@MSN）PEI］、CUR?siNC 共遞送體系［（CUR@MSN）PEI/siNC］。將各組轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，十字混勻；轉(zhuǎn)染4 h 后更換為普通培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；在48 h 后，采用RNA 提取試劑盒提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，采用PrimerScript RT reagent Kit 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA 為模板使用SYBR Premix Ex Taq 試劑盒進(jìn)行RT?qPCR 反應(yīng)，以β?actin 作為內(nèi)參基因，檢測(cè)GAPDH 的沉默效率。其中，小鼠GAPDH 引物序列為：上游引物5'?GTTGTCTCCTGC?GACTTCA?3'，下游引物5'?GGTGGTCCAGGGTTTC?TTA?3’'；小鼠β?actin 引物序列為：上游引物5'?CT?GTCCCTGTATGCCTCTG?3'，下游引物5'?ATGTCA?CGCACGATTTCC?3'。

1.7 CUR?ASO 共遞送體系對(duì)巨噬細(xì)胞M2 型極化的影響

將RAW264.7 細(xì)胞接種在6 孔板內(nèi)，按照轉(zhuǎn)染復(fù)合物的不同分成4 組，即實(shí)驗(yàn)組：CUR?ASO 共遞送體系［（CUR@MSN）PEI/ASO］，其中ASO 為miR?130a?3p 反義寡核苷酸；對(duì)照組：未處理組（未進(jìn)行轉(zhuǎn)染）、空白載體［（CUR@MSN）PEI］、CUR?miNC 共遞送體系［（CUR@MSN）PEI/miNC］。轉(zhuǎn)染4 小時(shí)后更換為普通培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，在3 d 后采用West?ern Blot 進(jìn)行Arg?1 蛋白的表達(dá)檢測(cè)。主要步驟為采用RIPA 加蛋白酶抑制劑裂解細(xì)胞，提取總蛋白，煮沸10 min 后與上樣緩沖液混合進(jìn)行SDS?PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后與Arg?1、β?actin 的一抗孵育過(guò)夜，次日與HRP 偶連的二抗孵育后發(fā)光液成像。采用ImageJ 分析條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用Graphpad Prism 8 軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，不同組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK?q 檢驗(yàn)，校驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 納米粒表征觀察

采用透射電鏡觀察可見制備的MSN內(nèi)部呈現(xiàn)出經(jīng)典的孔道結(jié)構(gòu)，整體納米粒直徑80～100 nm（圖1a）；在吸附CUR 小分子后，MSN 內(nèi)部的孔道結(jié)構(gòu)被低電子密度物填充，提示CUR 成功吸附進(jìn)入MSN 內(nèi)部（圖1b）；在CUR@MSN 表面吸附PEI 大分子后，納米粒的直徑有所增大，內(nèi)部孔道結(jié)構(gòu)仍被低電子密度物充填，表明CUR@MSN 表面形成了PEI 涂層，且MSN 內(nèi)部的CUR 未發(fā)生泄漏（圖1c）。通過(guò)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，可計(jì)算出MSN 對(duì)CUR 的包封率和載藥率分別為65.74%、16.57%，加載siRNA 的效率約94%。通過(guò)累積釋放曲線可見，CUR 被MSN 吸附進(jìn)入內(nèi)部后呈現(xiàn)出緩慢釋放的特征，在最初24 h 內(nèi)可累積釋放約20%，隨后的釋放量較?。▓D1d），表明MSN 可實(shí)現(xiàn)CUR 的長(zhǎng)期攜帶作用。

Figure 1 Transmission electron microscopy observation during the preparation of nanoparticles and release curve after the adsorption of CUR圖1 納米粒制備過(guò)程的透射電鏡觀察及吸附CUR 后的釋放曲線

2.2 細(xì)胞毒性篩查

分別采用不同濃度的（CUR@MSN）PEI 納米粒處理細(xì)胞，采用MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力以評(píng)估對(duì)細(xì)胞安全的濃度范圍?？梢娫诟邼舛鹊募{米粒處理下，細(xì)胞活力受到顯著抑制，當(dāng)粒子濃度低于10 μg/mL 時(shí)細(xì)胞活力在90%以上，未表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞活力抑制（圖2），提示該濃度為安全范圍，在后期細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)中均采用了10 μg/mL 進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染觀察

共聚焦顯微鏡觀察可見綠色熒光聚集在紅色區(qū)域內(nèi)、藍(lán)色細(xì)胞核周圍（圖3a），表明納米?？杀患?xì)胞攝??；同時(shí)，透射電鏡可直接觀察到細(xì)胞內(nèi)的（CUR@MSN）PEI/siRNA 納米顆粒聚集（圖3b），放大觀察后可見納米粒已部分發(fā)生降解（圖3c）。以上結(jié)果表明納米共遞送系統(tǒng)可成功轉(zhuǎn)染進(jìn)入巨噬細(xì)胞，且轉(zhuǎn)染效率較高。

Figure 3 (CUR@MSN)PEI/siRNA nanoparticle uptake observed by confocal microscopy and TEM圖3 共聚焦顯微鏡和透射電鏡觀察細(xì)胞攝取（CUR@MSN）PEI/siRNA 納米粒

2.4 靶基因沉默效率檢測(cè)

采用RT?qPCR 檢測(cè)GAPDH 的表達(dá)變化，在導(dǎo)入GAPDH 的siRNA 后細(xì)胞表達(dá)GAPDH 下降到未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的0.16 倍，即沉默效率高達(dá)80%以上（圖4，P ＜0.01）；陰性對(duì)照siRNA 則未表現(xiàn)出顯著的沉默效果，表明沉默作用是來(lái)自于siRNA 的序列匹配作用。這表明（CUR@MSN）PEI 載體系統(tǒng)可安全高效的遞送siRNA/miRNA，進(jìn)而達(dá)到沉默靶基因的目的。

2.5 巨噬細(xì)胞M2 極化檢測(cè)

與未處理的細(xì)胞組相比，（CUR@MSN）PEI 和（CUR@MSN）PEI/miNC 組的Arg?1 表達(dá)提升2～3 倍（P ＜0.05），（CUR@MSN）PEI/ASO 組的Arg?1 表達(dá)提升約8 倍（P ＜0.05）（圖5）。

Figure 5 Arg?1 protein expression in macrophages after the co?delivery of CUR?ASO圖5 CUR?ASO 共遞送系統(tǒng)轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞后Arg?1 蛋白的表達(dá)

3 討 論

3.1 基于MSN 的共遞送系統(tǒng)制備與表征

種植體在植入體內(nèi)后巨噬細(xì)胞首先發(fā)生反應(yīng)調(diào)控?zé)o菌性炎癥反應(yīng)，其不同的極化方向?qū)τ谘装Y轉(zhuǎn)歸至關(guān)重要，其中M2 方向極化的巨噬細(xì)胞可分泌白介素?4（interleukin?4，IL?4）、血小板衍生生長(zhǎng)因子（platelet derived growth factor，PDGF）等細(xì)胞因子，促進(jìn)局部組織的愈合過(guò)程，有利于骨結(jié)合的快速建立。因此通過(guò)調(diào)控種植體周圍巨噬細(xì)胞向M2 方向極化促進(jìn)其與機(jī)體的整合效果已經(jīng)成為了新的策略。CUR 是較為經(jīng)典的誘導(dǎo)M2 極化的小分子藥物，為更好發(fā)揮CUR 作用，本研究制備出基于MSN 的CUR 與siRNA 的共遞送系統(tǒng)，通過(guò)透射電鏡觀察證實(shí)了合成的MSN 呈現(xiàn)經(jīng)典的規(guī)整孔道結(jié)構(gòu)，內(nèi)部和表面分別成功吸附了小分子CUR 和高分子PEI。由于MSN 的特殊結(jié)構(gòu)，其內(nèi)部孔道可用于吸附分子量較小的分子，表面可吸附分子量較大的分子，是共遞送載體的理想選擇［11］。

多種納米載體系統(tǒng)均可用于共遞送系統(tǒng)的構(gòu)建，除了常用的MSN，還包括有機(jī)陽(yáng)離子聚合物等［14］，這種共遞送系統(tǒng)能夠克服單一藥物的不足，發(fā)揮兩種藥物優(yōu)勢(shì)的協(xié)同作用。例如針對(duì)腫瘤耐藥問(wèn)題，其機(jī)理為耐藥腫瘤細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)P?glyco?protein（Pgp）分子，有研究采用介孔硅內(nèi)部負(fù)載抗腫瘤藥物多柔比星，表面攜帶針對(duì)Pgp 的siRNA，在進(jìn)入細(xì)胞后可沉默細(xì)胞Pgp 分子的表達(dá)，從而解除細(xì)胞對(duì)多柔比星的耐藥性［15］。

3.2 納米粒的毒性及細(xì)胞攝取

在成功構(gòu)建出納米遞送系統(tǒng)后，納米材料的細(xì)胞毒性是進(jìn)行生物應(yīng)用首先考慮的問(wèn)題。與文獻(xiàn)報(bào)道類似［16］，本研究制備的負(fù)載CUR 和PEI 修飾后的MSN 表現(xiàn)出劑量依賴性的細(xì)胞毒性反應(yīng)，在合適的濃度范圍內(nèi)納米粒對(duì)細(xì)胞活力的影響可以被控制在理想范圍，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的藥物遞送作用。在安全的濃度范圍內(nèi)處理細(xì)胞，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡可觀察到細(xì)胞攝取了siRNA 進(jìn)入胞漿，進(jìn)一步采用透射電鏡可直接在胞漿內(nèi)觀察到納米粒聚集存在；此外，在透射電鏡觀察中可見納米粒聚集性存在于囊泡結(jié)構(gòu)中，表明細(xì)胞是通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)行納米粒攝取，這與前期報(bào)道的MSN 進(jìn)入細(xì)胞的途徑一致［17］；部分納米粒的結(jié)構(gòu)變得模糊，表明在被細(xì)胞攝取后逐漸發(fā)生了降解，MSN 的這種快速降解特性也為其生物安全性提供了保證［18］。

3.3 靶基因沉默效率及誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2 極化

采用陽(yáng)性對(duì)照GAPDH siRNA 進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染是評(píng)估轉(zhuǎn)染載體常用的方法，可避免靶基因的差異性對(duì)載體的轉(zhuǎn)染效率產(chǎn)生影響，能夠更好地確定轉(zhuǎn)染載體的作用效率［19］。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的（CUR@MSN）PEI 納米載體可高效實(shí)現(xiàn)RAW264.7的GAPDH 沉默，為負(fù)載功能性的核酸奠定了基礎(chǔ)。

在誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，單純導(dǎo)入CUR 即可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2 極化標(biāo)志物Arg?1 的高表達(dá)，證實(shí)了CUR可通過(guò)激活PPARγ 受體誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的M2 極化。Arg?1 是最為常用的巨噬細(xì)胞M2 極化的標(biāo)志分子，本課題組前期研究也以該分子的變化作為衡量巨噬細(xì)胞M2 極化程度的關(guān)鍵指標(biāo)，是較為簡(jiǎn)便、可靠的方法［20］。Su 等［9］采用高通量組學(xué)的方法系統(tǒng)性探索了巨噬細(xì)胞極化過(guò)程中miRNA 的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)miRNA?130a?3p 在巨噬細(xì)胞M2 極化中表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)其靶基因恰為PPARγ受體，即當(dāng)巨噬細(xì)胞向M2 方向極化時(shí)miR?NA?130a?3p 發(fā)揮內(nèi)源性抑制PPARγ受體的作用，當(dāng)引入miRNA?130a?3p 的反義序列ASO 后，可解除其抑制效應(yīng)，進(jìn)一步提升巨噬細(xì)胞M2 向極化。本研究中也發(fā)現(xiàn)，相比單純CUR 的處理組，同時(shí)轉(zhuǎn)染ASO 后可顯著進(jìn)一步誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2 極化標(biāo)志物Arg?1 的表達(dá)，表明ASO 與CUR 可能發(fā)生了協(xié)同作用，共同提升了巨噬細(xì)胞向M2 極化。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了基于MSN 的CUR 與siRNA/miRNA 的共遞送系統(tǒng)，在安全濃度范圍內(nèi)可高效轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞，發(fā)揮小分子藥物與核酸的協(xié)同作用，高效誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2 向極化。這為誘導(dǎo)種植體周圍巨噬細(xì)胞的M2 向極化，促進(jìn)骨結(jié)合的建立提供了新策略。

【Author contributions】Li PH wrote the article. Lang K analyzed the data. Song W designed the study. All authors read and approved the final manuscript as submitted.