長(zhǎng)期放射性環(huán)境下微生物群落多樣性變化

安毅夫,孫 娟,高 揚(yáng),連國(guó)璽,楊 冰 (中核第四研究設(shè)計(jì)工程有限公司,河北 石家莊 050021)

鈾尾渣作為鈾礦采冶產(chǎn)生的主要固體廢物,其不僅含有U、226Ra、210Pb、210Po 等天然放射性核素,也包括水冶加工工藝帶入的酸、堿、有機(jī)物等多種化工物料,在降水淋濾和地表徑流的作用下[1],導(dǎo)致污染物的溶出和遷移,可能造成潛在的環(huán)境污染風(fēng)險(xiǎn).

微生物是生態(tài)環(huán)境的重要參與者,對(duì)地質(zhì)構(gòu)造、物質(zhì)循環(huán)和生態(tài)穩(wěn)定等多個(gè)過程均有貢獻(xiàn)[2-4],然而,人類活動(dòng)導(dǎo)致的污染物遷移,會(huì)改變微生物生存場(chǎng)所的pH 值、無機(jī)離子、有機(jī)質(zhì)等環(huán)境因子,抑制了微生物群落的可持續(xù)增長(zhǎng),降低了環(huán)境自凈容量,從而加速污染物的累積.研究微生物群落隨環(huán)境因子的變化規(guī)律,有利于掌握微生物群落在不同污染物水平下的種群協(xié)同作用機(jī)制[5].目前,高通量測(cè)序技術(shù)作為分析微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的有效手段[6],被廣泛用于生態(tài)環(huán)境領(lǐng)域,不過由于采樣手段的限制,大多數(shù)研究多集中于土壤表層[7]、河道沉積物[8]、地表水體[9]等表層介質(zhì),對(duì)于尾礦庫(kù)、尾渣庫(kù)等具有深層結(jié)構(gòu)的微生物群落研究較少.

隨著時(shí)間尺度的延長(zhǎng)和雨水的持續(xù)搬運(yùn),鈾尾渣庫(kù)中放射性核素、重金屬離子等成分易發(fā)生垂向遷移,可能導(dǎo)致不同深度的微生物群落發(fā)生顯著性結(jié)構(gòu)變化[10-12],而且鈾尾渣具有比環(huán)境土壤樣品更大的孔隙度、滲透系數(shù)及更多的放射性核素和重金屬元素,理論上極大影響了深層鈾尾渣中微生物的代謝途徑及對(duì)放射性核素和重金屬的耐受性[13].

因此,本研究通過對(duì)鈾尾渣庫(kù)的鉆井取樣,以不同深度的微生物群落分布特性分析長(zhǎng)期放射性環(huán)境下的微生物群落多樣性變化,揭示微生物與庫(kù)區(qū)內(nèi)部環(huán)境變化的相關(guān)關(guān)系,為放射性環(huán)境下潛在修復(fù)功能菌種的選育提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采樣工作開展于某鈾尾渣庫(kù)及周邊土壤,該鈾尾渣庫(kù)始建于2004 年,所屬地區(qū)為亞熱帶濕潤(rùn)氣候,多年平均降雨量為1500～2200mm.鉆井施工時(shí),以鈾尾渣庫(kù)灘面開展垂直鉆井作業(yè),鉆井施工點(diǎn)位布設(shè)如圖1 所示,靠近壩體為ZK1,采用逆時(shí)針方向編號(hào)ZK2、ZK3、ZK4,中心點(diǎn)位鉆井為ZK5,共5 個(gè)點(diǎn)位.

取樣時(shí),為防止表面受自然沉降雜質(zhì)影響,去除0～40cm 的表層鈾尾渣,將距離表層40～60cm 處樣品列為表層樣品,其余部分以每5m 取1 次樣品,按深度分別編號(hào)為Dep-0、Dep-5、Dep-10、Dep-15 和BOT 組.作為對(duì)照,采集尾渣庫(kù)周邊10～20m 處土壤樣品作為環(huán)境特征樣品,編號(hào)Environs.所有采集樣品以無菌密封袋冷藏避光保存,分別進(jìn)行理化特征的測(cè)試和微生物群落的分析.

圖1 鈾尾渣庫(kù)采樣分布示意Fig.1 Sampling distribution diagram in the dry uranium tailing pond

1.2 理化特性分析

通過前期調(diào)研,鈾尾渣樣品中主要成分包括放射性核素(U、226Ra、210Po、210Pb),金屬元素(Mn、Fe、Ca)和土壤有機(jī)質(zhì)(SOM)等.開展理化性質(zhì)分析時(shí),放射性核素U 和金屬元素Mn、Ca、Fe 采用三酸消化法消解后用ICP-MS 測(cè)定得到物態(tài)全量[14],226Ra 采用硫酸鋇共沉淀法測(cè)定[15],210Po 和210Pb 采用總α 計(jì)數(shù)法[16],pH 值采用電極電位法[17],SO42-采用浸提后離子色譜法測(cè)定[17],有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀容量法[17].鈾尾渣樣品的主要成分含量見表1.

表1 不同深度鈾尾渣樣品主要成分含量Table 1 The main contents in uranium tailings at different depths

1.3 DNA 提取與PCR 擴(kuò)增

鈾尾渣樣品以E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit 試劑盒提取基因組DNA[18],以提取的基因組DNA 為模板,本實(shí)驗(yàn)中采用兩步PCR 法(two-stage PCR)進(jìn)行擴(kuò)增建庫(kù),第一輪PCR 采用16S 的V3-V4區(qū)引物(341F “CCTACGGGNGGCWGCAG”與805R“GACTACHVGGGTATCTAATCC”), 反 應(yīng) 體 系 為2×Hieff? Robust PCR Master Mix 15μL, Bar-PCR primer F 1μL, Primer R 1μL, PCR products 10～20ng,H2O 9～12μL,總體積30μL.反應(yīng)條件為:初始94℃3min,然后以94℃ 30s,45℃ 20s,65℃ 30s 重復(fù)5 次,之后再以94℃ 20s,55℃ 20s,72℃ 30s 重復(fù)20 次,最后以72℃ 5min 后冷卻得到第一輪PCR 擴(kuò)增結(jié)果;第二輪引入Illumina 橋式PCR 兼容引物,反應(yīng)體系為2×Hieff? Robust PCR Master Mix 15μL, Primer F 1μL,Index-PCR Primer R 1μL,PCR products 20～30μL,H2O 9～12μL,總體積30μL.反應(yīng)條件為:初始95℃ 3min,然后以94℃ 30s,55℃ 20s,72℃ 30s 重復(fù)5次,最后以72℃ 5min 后冷卻得到第二輪PCR 擴(kuò)增結(jié)果,完成兩輪PCR 后,以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)文庫(kù)大小,采用Qubit3.0 熒光定量?jī)x進(jìn)行文庫(kù)濃度測(cè)定并回收混合產(chǎn)物,從而完成建庫(kù)過程.將以上檢測(cè)合格后的文庫(kù)在Illumina MiSeq 平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序.

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

本次分析數(shù)據(jù)分別將同一點(diǎn)位或同一深度的結(jié)果聚類,利用Office Excel 2013 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì).基因序列的分析主要包括:將測(cè)序結(jié)果在QIIME 平臺(tái)上去除低質(zhì)量序列,根據(jù)標(biāo)簽序列區(qū)分不同樣品的序列[19].通過Uchime軟件去除PCR過程中形成的嵌合體[20],將收集的高質(zhì)量序列用Usearch方法進(jìn)行聚類[21],以基因序列97%相似度作為分類操作單元OTUs 的劃分標(biāo)準(zhǔn).方差分析(ANOVA)、Pearson 相關(guān)性分析用SPSS Statistics 22.0 軟件完成.采用R 軟件(版本4.0.0)中的多個(gè)數(shù)據(jù)包來完成花瓣圖、PcoA、RDA 等分析和繪圖[21].

2 結(jié)果與分析

2.1 鈾尾渣庫(kù)區(qū)群落微生物多樣性特征

花瓣圖(圖2)反映了鈾尾渣樣品在OTU 水平上的特異性和相似性情況[22].OTU 水平上尾渣與環(huán)境土壤差異性顯著,不同樣品中僅有52 個(gè)OTU 相同,占總量的0.58%～7.36%,而特異性O(shè)TU 數(shù)量呈現(xiàn)Environs＞ZK1＞ZK2＞ZK4＞ZK3＞ZK5,其中,ZK5 在總量上僅為Environs 的7.87%.

生態(tài)學(xué)指數(shù)Shannon、Chao1、ACE 和Coverage能夠共同表征樣品微生物多樣性和數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性[23],其中Shannon 指數(shù)反映OTU 水平上的物種多樣性,Chao1 和ACE 指數(shù)表征物種豐富度,Coverage 指數(shù)則是對(duì)多樣性數(shù)據(jù)的檢驗(yàn).表2 中環(huán)境組的多項(xiàng)指數(shù)均大于鈾尾渣樣品,其中,環(huán)境樣品與鈾尾渣樣品的Shannon 指數(shù)組間差異顯著(P＜0.05),Chao1 和ACE 指數(shù)分別是鈾尾渣樣品的 1.82～7.94 倍和1.82～6.57 倍,通過Coverage 指數(shù)對(duì)OTU 的有效性進(jìn)行驗(yàn)證,所有樣品的Coverage 指數(shù)均大于或等于0.97,說明本次測(cè)序結(jié)果是科學(xué)可靠的.

圖2 微生物群落OTU 分布花瓣Fig.2 Flower plot diagram of OTU diversity of microbial community

表2 鈾尾渣微生物群落多樣性信息Table 2 Microbial community diversity in uranium tailings

圖3 微生物群落多樣性PCoA 分析Fig.3 PCoA analysis of microbial community diversity

基于Bray-Curtis距離的PCoA主坐標(biāo)分析反映了鈾尾渣樣品組間微生物群落的β-多樣性差異.結(jié)果如圖3 所示,微生物群落組成共有75.10%在一維和二維尺度上表達(dá),基本達(dá)到解譯的完整性.點(diǎn)位的離散程度代表微生物群落樣品間的β-多樣性差異,兩點(diǎn)間距離越長(zhǎng)則差異越顯著,結(jié)果顯示,表層鈾尾渣與環(huán)境組的微生物多樣性相似程度較高,而底層鈾尾渣與其他樣品的多樣性差異較明顯.

2.2 鈾尾渣庫(kù)內(nèi)微生物群落分布特征

除去環(huán)境土壤樣品外,鈾尾渣樣品中共發(fā)現(xiàn)0.01%豐度以上共34 門,總體上優(yōu)勢(shì)菌群(豐度＞5%)包括變形菌門Proteobacteria(52.51%)、厚壁菌門Firmicutes(15.96%) 、 放 線 菌 門 Actinobacteria(9.57%)、擬桿菌門Bacteroidetes(6.11%),占總量的84.15%,酸桿菌門Acidobacteria(4.49%)和綠彎菌門Chloroflexi(1.57%)為次優(yōu)勢(shì)菌群(豐度＞1%)(圖4).

圖4 顯示了不同深度下豐度占比排列前20 位的微生物群落門水平分布情況,Proteobacteria 在不同深度的鈾尾渣樣品中均為占比最大的優(yōu)勢(shì)菌群,豐度范圍在36.11%～64.62%,值得注意的是,在長(zhǎng)期放射性環(huán)境下(5m～底層),Actinobacteria 的豐度從4.44%連續(xù)增加至9.07%.

圖4 門水平上的物種分布差異Fig.4 Species distribution differences at the phylum level

屬水平上,所有鈾尾渣樣品中的菌群種類超過500 屬.總體上來說,豐度超過5%的優(yōu)勢(shì)菌群主要有苯基桿菌屬 Phenylobacterium(8.98%)和梭菌屬Clostridium (5.14%)兩類,其余菌群豐度分布較為分散,豐度小于1%的菌屬總占比為64.37%.圖5列出了不同深度下豐度占比排列前20 位的微生物群落屬水平分布情況,對(duì)于表層鈾尾渣,鞘脂菌屬Sphingosinicella、鞘脂單胞菌屬Sphingomonas 和酸桿菌屬Gp1 為優(yōu)勢(shì)菌種,除表層外,Phenylobacterium和Clostridium 均為各個(gè)深度的優(yōu)勢(shì)菌群,另外,在長(zhǎng)期放射性環(huán)境下(5m～底層),隨深度增加時(shí)節(jié)桿菌屬Arthrobacter 的豐度從0.92%連續(xù)升至4.59%、酸桿菌屬Gp16 的豐度從0.04%連續(xù)升至4.08%.

圖5 屬水平上的物種分布差異Fig.5 Species distribution differences at the genus level

2.3 環(huán)境因子對(duì)微生物群落的影響

將深度≥5m 的長(zhǎng)期放射性環(huán)境下的微生物群落(豐度＞1%)與環(huán)境因子之間開展RDA 分析,結(jié)果如圖6 所示,Ca、210Po 和210Pb 是本研究中對(duì)微生物群落作用最大的環(huán)境因子,其次是SO42-、pH 值和U等.微生物群落與環(huán)境因子正相關(guān)表明微生物群落能夠有效適應(yīng)該條件變化,而負(fù)相關(guān)則說明微生物群落很難在該條件下有效繁殖[24].鈾尾渣樣品中,Ca、210Po、210Pb、U、SO42-均與Proteobateria 和Bacteroidetes 顯著正相關(guān),Fe 和226Ra 與Firmicutes顯著正相關(guān),Mn 與Chloroflexi、Acidobacteria 和浮霉菌門 Planctomycetes 顯著正相關(guān), 但與Proteobateria 和Bacteroidetes 顯著負(fù)相關(guān),pH 值、SOM 與Actinobacteria 顯著正相關(guān).

圖6 環(huán)境因子與微生物群落的RDA 冗余分析Fig.6 RDA analysis of environmental factors and microbial community

3 討論

3.1 鈾尾渣理化性質(zhì)特征

鈾尾渣的理化特性均呈現(xiàn)表層樣品中放射性核素和重金屬離子較高,深層鈾尾渣相對(duì)較低的特征,這可能與鈾尾渣堆置時(shí)間以及采用石灰中和法進(jìn)行表層原位固定有關(guān)[25].本研究中,鈾尾渣的取樣深度與堆置時(shí)間呈正相關(guān),表層尾渣堆置時(shí)間較短,而最深處尾渣距今約15a.新堆置的尾渣受到自然環(huán)境,特別是降雨的影響較少,而投加石灰為表層鈾尾渣增加了大量OH-,中和了酸浸過程中殘余的酸性物質(zhì),并且以包裹形式將大部分U、Mn 等元素含量固定于鈾尾渣表面.但是,隨深度增加,堆置時(shí)間較長(zhǎng)的深層尾渣中,石灰的固定化作用減弱,離子的可遷移性增加,導(dǎo)致礦渣中U、226Ra、210Po、210Pb、Mn、Fe 等元素從鈾尾渣表面被釋放.Yin 等[26]報(bào)道在長(zhǎng)期的酸雨淋濾中,尾礦渣表層的礦物溶解可能會(huì)導(dǎo)致放射性核素和重金屬元素的垂向遷移,造成深層污染物富集,在降雨頻繁的春夏季節(jié),這種情況可能被進(jìn)一步加劇[27].

3.2 微生物群落多樣性變化分析

風(fēng)化作用和石灰乳中和等因素對(duì)微生物多樣性的影響較大[28],表層鈾尾渣中物種β-多樣性與深層鈾尾渣出現(xiàn)了顯著差異(圖3),在表層中占比超過1%的candidate division WPS-2(2.03%)、糖化細(xì)菌門Candidatus Saccharibacteria(1.88%)在底層多個(gè)點(diǎn)位中均不足0.01%,Xue 等[29]通過對(duì)酸性土壤投加石灰的研究表明激增的OH-會(huì)迅速改變微生物群落結(jié)構(gòu),進(jìn)而實(shí)現(xiàn)原位處理的酸性土壤改良.然而,在長(zhǎng)期放射性環(huán)境下,隨著重力牽引導(dǎo)致的環(huán)境因子垂向遷移過程中,雖然整體上呈現(xiàn)越深層物種豐富度越低的特點(diǎn),但是特定種屬的微生物由于適應(yīng)性強(qiáng)從而可能發(fā)生物種豐度的增加,例如Arthrobacter 和Gp16 的豐度從5m 至底層連續(xù)上升,這體現(xiàn)了該類微生物對(duì)環(huán)境變化的較強(qiáng)適應(yīng)性[30].

本研究中Proteobacteria 在不同深度鈾尾渣中均為占比最高的優(yōu)勢(shì)生物,該菌群作為土壤中最豐富的門之一,在農(nóng)田[31]、森林[32]、礦區(qū)[30]等均屬于優(yōu)勢(shì)菌群,Rodionov 等[33]對(duì)Proteobacteria 的耐受性機(jī)理開展研究,結(jié)果表明,該類菌群能夠通過EPS、酶促反應(yīng)等生物作用降低重金屬離子的毒害作用,另一方面能夠充分利用植物、其他菌群的有機(jī)質(zhì)為自身提供營(yíng)養(yǎng)成分[34].經(jīng)過多年研究發(fā)現(xiàn), Proteobacteria 門下存在如地桿菌屬 Geobacter[35]、 希瓦氏菌屬Shewanella[36]、脫硫弧菌屬Desulfovibrio[37]、腸桿菌屬Enterobacter[38]等已被證實(shí)具有還原固定鈾等環(huán)境修復(fù)功能的耐受放射性菌種,但是,在本次鈾尾渣中的這些菌種豐度占比較低,這可能是U 等放射性核素在自然條件下無法實(shí)現(xiàn)環(huán)境自凈的原因之一,后續(xù)實(shí)現(xiàn)鈾尾渣庫(kù)整體的環(huán)境修復(fù)治理工程需要增加人工干預(yù)措施.

3.3 環(huán)境因子對(duì)微生物群落的影響

與環(huán)境土壤樣品相比,OTU 水平上的鈾尾渣中微生物多樣性顯著降低(P＜0.05),這說明鈾尾渣中pH 值較低,且存在比環(huán)境土壤含量高出較多的放射性核素U、226Ra、210Po、210Pb 等成分,抑制了非耐受菌群的正常生長(zhǎng).不同深度鈾尾渣中微生物群落多樣性呈現(xiàn)先降低后上升的變化,這可能與不同深度感受放射性核素的強(qiáng)度有關(guān),在5m～15m 之中受到上下層放射性共同影響造成微生物多樣性水平下降,而底層現(xiàn)存污染物濃度較少,削弱了對(duì)微生物群落的抑制作用,使得底層微生物多樣性水平提高.

本次分析中,在長(zhǎng)期放射性環(huán)境下,放射性核素210Po、210Pb 和U 均表現(xiàn)出對(duì)鈾尾渣中細(xì)菌多樣性的顯著影響,而且除放射性核素外,主要來自于石灰的Ca,當(dāng)?shù)亓蛩嵝徒涤甑牡蚿H 值環(huán)境和SO42-以及鈾尾渣中的重金屬M(fèi)n 均對(duì)微生物群落多樣性產(chǎn)生了較強(qiáng)的影響.通過RDA 分析(圖6),鈾尾渣中除Proteobateria、Firmicutes 和Bacteroidetes 外,大多數(shù)菌種均表現(xiàn)出了對(duì)放射性核素210Po、210Pb、U 和226Ra 的不耐受性,這可能是導(dǎo)致鈾尾渣中微生物多樣性比環(huán)境土壤樣品低的另一原因.Zeng 等[24]同樣報(bào)道了Proteobateria、Firmicutes 和Bacteroidetes 在不同濃度放射性核素U 脅迫下,均具有的較高耐受強(qiáng)度.但是,本研究中Mn 作為鈾尾渣中成分占比較高的重金屬元素,對(duì)這3 類菌群卻產(chǎn)生了明顯的抑制作用,加之鈾尾渣中原本就較低的營(yíng)養(yǎng)成分SOM,使得該類菌群對(duì)環(huán)境變化更加敏感[39],從而降低了微生物群落的正常代謝水平,長(zhǎng)期暴露在復(fù)雜的放射性環(huán)境使得鈾尾渣中微生物多樣性(尤其是豐度較低的菌群)受到更多方面挑戰(zhàn).

通過本研究對(duì)鈾尾渣庫(kù)多個(gè)點(diǎn)位不同深度的微生物群落分析,可以看出,在長(zhǎng)期放射性環(huán)境下,放射性核素、重金屬元素的遷移和外界降雨的影響等多個(gè)因素的綜合作用共同決定了微生物群落的多樣性變化.

4 結(jié)論

4.1 鈾尾渣樣品間的理化性質(zhì)差異顯著,長(zhǎng)期堆置下,U、226Ra、210Po、210Pb、Mn、pH 值、SO42-等可遷移性增加,可能會(huì)增加環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)程度,需要對(duì)傳統(tǒng)石灰中和處理法進(jìn)行改良.

4.2 鈾尾渣庫(kù)表層與深層的微生物結(jié)構(gòu)差異顯著,在總體上,Proteobateria、Firmicutes 和Bacteroidetes為門水平上的優(yōu)勢(shì)菌群,而Arthrobacter 和Gp16 在屬水平上表現(xiàn)出較強(qiáng)的生長(zhǎng)能力.

4.3 不同菌群對(duì)環(huán)境因子的適應(yīng)性不同,本研究發(fā)現(xiàn)在長(zhǎng)期放射性環(huán)境下,Proteobateria 和Bacteroidetes 主要表現(xiàn)出對(duì)210Po、210Pb、U 的耐受性,而Firmicutes主要表現(xiàn)出對(duì)放射性核素226Ra 耐受性.