赤泥改良過(guò)程中微生物群落及酶活性恢復(fù)研究

董夢(mèng)陽(yáng),董遠(yuǎn)鵬,徐子文,邵翼飛,劉喜娟,胡欣欣,劉愛(ài)菊* (.山東理工大學(xué)農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院,山東 淄博 5509；.山東理工大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院,山東 淄博 5509)

赤泥是氧化鋁工業(yè)提煉過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)品,2018 年全球堆積鋁土礦殘?jiān)鼛?kù)存達(dá)到約4.60×109t,年產(chǎn)量約為2.00×108t,成為有色金屬冶煉行業(yè)最主要的固體廢棄物[1-2].我國(guó)作為氧化鋁生產(chǎn)大國(guó),有遠(yuǎn)超于7000 萬(wàn)t 的赤泥需要處理,且大量赤泥處置主要以堆存方式為主[3].這種處置方式除占用大量土地外,赤泥因團(tuán)聚性差、顆粒小、鹽堿性強(qiáng),易造成揚(yáng)塵、游離堿及重金屬滲漏等環(huán)境問(wèn)題[2],進(jìn)而極易引發(fā)土壤、空氣和地下水污染及安全事故,對(duì)周邊生態(tài)環(huán)境及居民生產(chǎn)生活產(chǎn)生嚴(yán)重的威脅[4-5].國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者在赤泥減量化、土壤化、資源化等方面做了大量卓有成效的工作,但赤泥的規(guī)?；刻幚砼c處置仍是一個(gè)挑戰(zhàn)[6],對(duì)其處置區(qū)域的現(xiàn)場(chǎng)和場(chǎng)外造成潛在的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)越來(lái)越受到人們的關(guān)注.近年來(lái),將其轉(zhuǎn)化為生態(tài)工程土壤進(jìn)行原位恢復(fù)和發(fā)展可持續(xù)的植被生態(tài)系統(tǒng)被認(rèn)為是實(shí)現(xiàn)赤泥堆場(chǎng)環(huán)境安全管理的最有效方式[7-8].目前赤泥土壤化的改良主要是摻拌糖蜜酒精廢液[9]、氟石膏、磷石膏[10]、糠醛渣[11]、污泥[12]、泥炭土、蛭石[13]等改良劑的方式進(jìn)行;同時(shí)研究表明這些改良劑可通過(guò)酸堿中和作用、沉淀作用或抑制作用顯著降低赤泥堿性,并可增加基質(zhì)中有機(jī)質(zhì)含量及有效持水能力;但同時(shí)也顯著增加了赤泥的重金屬或表層鹽堿含量[14].其中,有機(jī)質(zhì)不僅在促進(jìn)赤泥基質(zhì)顆粒團(tuán)聚方面的作用優(yōu)于其他基質(zhì)改良材料,同時(shí)顯著提升了微生物群落的代謝能力及其胞外酶活性,且隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加其質(zhì)地組成逐漸趨于參照土壤[15].

土壤酶參與土壤中絕大多數(shù)營(yíng)養(yǎng)元素的生物循環(huán)、腐殖質(zhì)的分解與合成以及有機(jī)化合物的轉(zhuǎn)化,在赤泥這種不利于土壤微生物增殖的基質(zhì)中,也起非常重要的作用[16].土壤酶活性不僅反映土壤中生物化學(xué)過(guò)程的強(qiáng)度和方向,也是評(píng)價(jià)土壤肥力狀況的指標(biāo)[17],并廣泛用作指示土壤生態(tài)系統(tǒng)的健康和可持續(xù)性,是反映土壤質(zhì)量變化的生物活性指標(biāo)[18-19].土壤微生物群落結(jié)構(gòu)是表征土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性的重要參數(shù).此外,土壤微生物也是反映土壤微環(huán)境變化的敏感性指標(biāo)[20],其數(shù)量、組成及多樣性的變化對(duì)土壤功能和生態(tài)循環(huán)具有決定性作用,是評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)[21].土壤微生物與土壤酶緊密聯(lián)系,在土壤生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)傳遞過(guò)程中扮演重要的角色[22],兩者參與有機(jī)物質(zhì)分解和合成,以及無(wú)機(jī)物的氧化與還原的過(guò)程,因此是土壤生態(tài)系統(tǒng)代謝的重要?jiǎng)恿?然而,對(duì)于赤泥的土壤化修復(fù),通常主要選擇化學(xué)和礦物學(xué)性質(zhì)來(lái)評(píng)估其進(jìn)展和土壤形成軌跡,對(duì)微生物群落發(fā)育的考慮不夠充分[23].因此,通過(guò)對(duì)赤泥基質(zhì)酶活性、微生物群落結(jié)構(gòu)組成和豐度及其功能多樣性恢復(fù)過(guò)程的監(jiān)測(cè),可更為全面地評(píng)價(jià)其土壤化修復(fù)效果.

為此,本研究本著“以廢治廢”的原則,選用粉煤灰、蛭石為主要基質(zhì)改良材料,以園林落葉為有機(jī)質(zhì)來(lái)源.采用室外培養(yǎng)方法,通過(guò)研究分析不同培育時(shí)間改良基質(zhì)的pH 值、EC、CEC 等理化指標(biāo)、氮素(-N)以及關(guān)鍵土壤酶、微生物群落多樣性和群落結(jié)構(gòu)組成等生物指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化,來(lái)評(píng)估赤泥土壤化修復(fù)效果,以期為赤泥的無(wú)害化土壤化修復(fù)與治理提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試拜耳法赤泥由山東鋁業(yè)公司提供,其化學(xué)成分如表1 所示.現(xiàn)場(chǎng)提取樣品,經(jīng)自然風(fēng)干后過(guò)2mm 樣篩備用.經(jīng)XRD 衍射分析,赤泥的主要礦物組成為赤鐵礦、鋁針鐵礦、石英、三水鋁石、方鈉石、銳鈦礦;粉煤灰的主要礦物組成為莫來(lái)石、磁鐵礦、赤鐵礦、石英、方解石等;蛭石的主要礦物組成:輝石、方解石、變體云母、磷灰石、石英、蛇紋石等.

表1 試驗(yàn)材料化學(xué)成分(%)Table 1 Chemical composition of the used materials (%)

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)共設(shè)置3 個(gè)不同處理:純赤泥(RM)、赤泥+粉煤灰(F-RM)、赤泥+蛭石(V-RM),其中,粉煤灰和蛭石的添加量分別為10%和2%.將各處理按10%比例添加有機(jī)質(zhì),混合均勻后裝盆、編號(hào),放置于室外自然條件下培養(yǎng),定期澆水,保持使其含水率在70%田間持水量左右,每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)平行.在培養(yǎng)后第30,180,540d 取樣進(jìn)行分析測(cè)定,將采集的赤泥樣品過(guò)2mm 篩后,一部分自然風(fēng)干用于土壤理化性質(zhì)的測(cè)定; 另一部分放入4℃冰箱保存,用于土壤酶活性、微生物群落功能多樣性以及微生物高通量測(cè)序的分析與測(cè)定.

1.3 主要測(cè)試指標(biāo)及測(cè)試方法

1.3.1 改良基質(zhì)的基本理化特性分析 采用環(huán)刀法測(cè)定各處理樣品的容重(ρb),采用比重瓶法測(cè)定其顆粒密度(ρs)[24],并通過(guò)二者計(jì)算各樣品的孔隙度.將各處理樣品按1:5 固液比浸提后,采用pH 計(jì)( 801型)測(cè)定其pH 值,采用6061 型電導(dǎo)率測(cè)試儀測(cè)定其EC 值[25].陽(yáng)離子交換量的測(cè)定:采用醋酸銨提取、電感耦合等離子體光譜儀(ICP-AES,Optima 5300DV,美國(guó)Perkin Elmer公司生產(chǎn))測(cè)定浸出液中的陽(yáng)離子濃度,以各陽(yáng)離子的總量作樣品的陽(yáng)離子交換量[24],以Na+占陽(yáng)離子交換量的百分比作各樣品的鹽堿度.采用紫外分光光度法測(cè)定各處理樣品中NO3--N 含量,具體試驗(yàn)步驟見(jiàn)土壤NO3--N 測(cè)試盒(購(gòu)自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)說(shuō)明書(shū).

1.3.2 土壤酶活性測(cè)定 采用土壤酶試劑盒(購(gòu)自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)分析各改良處理培養(yǎng)過(guò)程中脫氫酶、脲酶、堿性磷酸酶等關(guān)鍵酶活性的恢復(fù)過(guò)程.其中,脲酶活性采用苯酚鈉—次氯酸鈉比色法測(cè)定,脫氫酶活性采用TTC 分光光度法測(cè)定,堿性磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法測(cè)定[16].

1.3.3 Biolog-Ecoplate 分析 采用Biolog Ecoplate (BIOLOGTM, USA)分析各改良處理微生物群落及其代謝功能的恢復(fù)過(guò)程[26]:稱(chēng)取相當(dāng)于5g 干重的新鮮樣品于100mL 三角瓶中,加入45mL 0.05mol/L的滅菌磷酸緩沖液,200r/min振蕩30min混勻.靜置30min,取上清液,按倍數(shù)稀釋法依次用0.05mol/L 的滅菌磷酸緩沖液稀釋1000 倍作樣品的微生物接種液.在無(wú)菌環(huán)境條件下,用八通道移液槍移取150μL的接種液移至BiologTMEco-plate 微孔中,之后置于(25±1)℃恒溫條件下避光培養(yǎng)7d,每隔12h 用酶標(biāo)儀(infinite F200Pro)讀取其在590nm 處吸光值[27].

1.3.4 微生物高通量測(cè)序 使用OMEGA 提取試劑盒( E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit)按說(shuō)明書(shū)提供的步驟對(duì)赤泥土壤樣品進(jìn)行細(xì)菌和真菌的DNA 提取.之后對(duì)細(xì)菌16S rDNA 中的V3—V4 高變區(qū)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增, 引物序列為 341F(5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3')和805R(5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3');對(duì)真菌的ITS1 區(qū)基因進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增,引物為 fITS7(5'-GTGARTCATCGAATCTTTG-3')和 ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3').將擴(kuò)增所得的PCR 產(chǎn)物純化回收處理后,利用Qubit? 2.0DNA 試劑盒對(duì)所得DNA 準(zhǔn)確定量,并將樣品按測(cè)序量比例混合后,利用Illumina Hiseq/Miseq PE300 序列平臺(tái)(由杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司提供)進(jìn)行測(cè)序分析.測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)拼接、過(guò)濾、剔除嵌合體,舍棄低質(zhì)量序列等得到精準(zhǔn)分析的優(yōu)質(zhì)序列,優(yōu)質(zhì)序列用于可操作分類(lèi)單元(OTU)分類(lèi)與多樣性指數(shù)計(jì)算及物種豐度分析.

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010 和SPSS version 19.0 處理.赤泥樣品數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析 (ANOVA)和方差齊性檢驗(yàn).所有圖表均通過(guò)Origin 8.0 繪制.利用Mothur 軟件對(duì)每個(gè)樣品OTUs做 α-多樣性指數(shù)(Observed species、Chao1、Goods_coverage、Shannon、Simpson)分析.

其中,土壤微生物群落整體代謝活性用孔顏色平均變化率(AWCD)表征,用Shannon 和Simpson 多樣性指數(shù)來(lái)描述土壤微生物種群的豐富度和最常見(jiàn)物種的優(yōu)勢(shì)度.計(jì)算公式如下:

式中:Ci為每孔在590nm 下的吸光值;R 為對(duì)照孔吸光值;pi為第i 孔相對(duì)吸光值與整板相對(duì)吸光值總和之比.

2 結(jié)果與分析

2.1 改良赤泥基質(zhì)的基本理化性質(zhì)

堿性強(qiáng)、鹽分含量高、物理結(jié)構(gòu)差、抗侵蝕能力弱等是赤泥土壤化及資源化利用的關(guān)鍵限制因素[1].而赤泥土壤pH 值、EC 以及鹽堿度是評(píng)價(jià)赤泥基質(zhì)鹽堿性改良的重要指標(biāo),能夠較好地指示土壤鹽害、堿害的風(fēng)險(xiǎn)和鹽堿度的強(qiáng)弱[28].故本研究定期分析測(cè)定各處理組的容重、孔隙度等物理結(jié)構(gòu)改良指標(biāo)的同時(shí),重點(diǎn)監(jiān)測(cè)了其pH 值、EC、ESP 等指標(biāo)在不同培養(yǎng)時(shí)間的變化,以分析蛭石和粉煤灰對(duì)赤泥基質(zhì)理化性質(zhì)的改良效果(表2).

孔隙度是土壤具有良好保水、透氣性的重要指標(biāo),當(dāng)其達(dá)到50%～60%時(shí),即可為生物生長(zhǎng)營(yíng)造出良好的孔隙狀態(tài).由表1 可知,粉煤灰和蛭石的添加并未顯著降低赤泥基質(zhì)容重,但卻顯著增加了其孔隙度,經(jīng)粉煤灰改良后,赤泥基質(zhì)孔隙度增長(zhǎng)到58.15%,達(dá)到有效范圍.這與Zhu 等[29]研究結(jié)果一致,可能由于赤泥基質(zhì)中含有的大量可交換性Na+降低了有機(jī)質(zhì)和礦物組分之間的共價(jià)作用,從而導(dǎo)致基質(zhì)中團(tuán)聚體及黏粒的崩解和分散.而添加粉煤灰后,其含有的大量可交換Ca2+減少了土壤分散性黏粒的數(shù)量,促進(jìn)團(tuán)聚體的形成和穩(wěn)定,從而改善了赤泥土壤的環(huán)境,有利于微生物的生存及植物的定植[30].

相比之下,不同處理組的鹽堿性指標(biāo)(pH 值、EC、ESP)均存在顯著性差異(P＜0.05).培養(yǎng)30d 時(shí),與對(duì)照組(RM)相比:V-RM 組pH 值由11.25 降低至10.57,ESP 由79.40%降至75.21%,EC 無(wú)明顯變化;F-RM 組pH 值由11.25 降低至10.70,ESP 由79.40%降至66.23%,EC 由1.05mS/cm 降低至0.82mS/cm.隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),V-RM 和F-RM 組pH 值、EC、ESP 均降低.培養(yǎng)540d 后,V-RM 和F-RM 組的pH值分別降至9.85 和9.44, ESP 分別降至19.10%和8.02%,EC 降至0.27 和0.35mS/cm,均顯著低于對(duì)照處理(RM)的相應(yīng)指標(biāo)值(表2).這是因?yàn)?粉煤灰的礦物相中含有石膏,其含有的Ca2+能與空氣中的CO2以及赤泥中OH－等堿性陰離子發(fā)生沉淀反應(yīng),起到一定的中和作用;同時(shí)Ca2+還能與赤泥基質(zhì)中的Na+發(fā)生置換反應(yīng),故通過(guò)添加粉煤灰可降低赤泥基質(zhì)的鹽堿性[14].且相比之下,粉煤灰添加對(duì)赤泥基質(zhì)的理化環(huán)境的改良效果優(yōu)于蛭石處理.通過(guò)一段時(shí)間的改良修復(fù),赤泥基質(zhì)的理化性質(zhì)能基本恢復(fù)到對(duì)照土壤的正常水平,改良效果較為顯著.

表2 各處理樣品的理化指標(biāo)變化Table 2 Changes of physical and chemical indexes of samples treated

2.2 改良赤泥基質(zhì)的肥力變化

氮是植物生長(zhǎng)不可或缺的營(yíng)養(yǎng)元素,因此赤泥土壤中氮的含量會(huì)在很大程度上決定植物的生長(zhǎng)情況和發(fā)育狀態(tài).由圖1(a)可知,本研究對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間的改性赤泥的氮素含量進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)通過(guò)添加粉煤灰和蛭石改良后赤泥基質(zhì)的硝態(tài)氮含量有所增加,并且隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),增長(zhǎng)更為顯著.培養(yǎng)540d 時(shí),V-RM 和F-RM 組的NO3--N 含量均高于RM 組,分別增加3.41 和28.27mg/kg,F-RM 組改良效果更為顯著.

圖1 不同改良處理對(duì)硝態(tài)氮及陽(yáng)離子交換量的影響Fig.1 Effects of different improved treatments on nitrate nitrogen and cation exchange capacity

陽(yáng)離子交換作用是土壤最重要的化學(xué)性質(zhì)之一,是土壤緩沖性能的主要來(lái)源,直接反映了土壤保存、供應(yīng)和緩沖陽(yáng)離子養(yǎng)分的能力,是土壤中普遍存在的現(xiàn)象,也是改良土壤、合理施肥的重要依據(jù).由圖1(b)可知,不同改良處理組的交換性陽(yáng)離子變化趨勢(shì)基本一致,隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而逐漸降低,且V-RM 組中陽(yáng)離子交換量下降最為顯著;在培養(yǎng)540d 后,各處理組中交換性陽(yáng)離子含量由高到低依次為:RM 組＞F-RM 組＞V-RM 組.分析其原因,可能是由于粉煤灰或蛭石添加提升了基質(zhì)的孔隙度,進(jìn)而增加赤泥基質(zhì)中Na+離子的淋洗效果(表2);而且,F-RM 組中陽(yáng)離子交換量高于V-RM 處理組可能與粉煤灰提供的Ca2+的補(bǔ)給作用相關(guān).這進(jìn)一步表明粉煤灰對(duì)赤泥基質(zhì)的改良效果優(yōu)于蛭石的改良作用.

2.3 改良赤泥基質(zhì)的土壤酶活性的變化

土壤酶活性是近年來(lái)土壤質(zhì)量及生態(tài)功能評(píng)價(jià)中不可缺少的內(nèi)容[21].本研究主要選取了土壤脫氫酶、土壤脲酶和土壤堿性磷酸酶來(lái)評(píng)價(jià)赤泥土壤化修復(fù)過(guò)程中酶活性的動(dòng)態(tài)變化,以反映赤泥基質(zhì)中的物質(zhì)循環(huán)及轉(zhuǎn)化動(dòng)態(tài)[31].其中土壤中脲酶促進(jìn)酰胺鍵的斷裂,參與氮的循環(huán)[32],磷酸酶參與土壤中磷的循環(huán),促進(jìn)土壤中有效磷的含量和腐殖質(zhì)的合成.脫氫酶的活性與土壤中生物體的絕大多數(shù)氧化還原反應(yīng)息息相關(guān)[31].

由圖2 可知,RM 組3 種土壤酶活性在自然生長(zhǎng)狀況下總體增長(zhǎng)較為平緩,而經(jīng)過(guò)粉煤灰和蛭石改良處理后,3 種土壤酶活性均顯著增強(qiáng),即土壤酶活性大小順序?yàn)?F-RM 組＞V-RM 組＞RM 組.其中,脫氫酶及脲酶均隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)酶活性顯著增長(zhǎng),而堿性磷酸酶活性在培養(yǎng)180d 時(shí)增長(zhǎng)較為緩慢,180d 后快速增長(zhǎng).在培養(yǎng)到 540d時(shí),F-RM 組的土壤脫氫酶、脲酶及堿性磷酸酶活性較RM 組相比分別增長(zhǎng)了114.98%、321.26%和560.88%,V-RM 組分別增長(zhǎng)了33.53%、215.66%和174.85%.其主要原因?yàn)橥ㄟ^(guò)添加粉煤灰和蛭石改善了赤泥基質(zhì)的基本理化性質(zhì),從而更適宜微生物生存繁殖以及多種酶活性的增長(zhǎng).但相比之下,粉煤灰添加處理對(duì)土壤酶活性恢復(fù)的促進(jìn)作用顯著高于蛭石添加處理.

圖2 不同改良處理中典型土壤酶酶活性的動(dòng)態(tài)變化Fig.2 Variation of the typical enzymes’ activity in the improved treatments of red mud

2.4 基質(zhì)改良對(duì)赤泥微生物群落功能多樣性的影響

平均顏色變化率(AWCD),指Biolog-Eco微平板95 個(gè)孔吸光度的平均值,其大小隨時(shí)間的變化可作為評(píng)價(jià)微生物群落整體活性的有效指標(biāo)之一,與土壤中利用單一碳源的微生物的數(shù)目和種類(lèi)有關(guān)[33].本研究通過(guò)測(cè)定AWCD 隨培養(yǎng)時(shí)間的變化來(lái)反映經(jīng)不同改良處理的赤泥基質(zhì)中的微生物活性及微生物群落功能多樣性[34].

表3 土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)Table 3 Functional diversity index of soil microbial community

微生物群落多樣性作為衡量土壤質(zhì)量和評(píng)價(jià)土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定的重要生物學(xué)指標(biāo),能夠敏感地反映土壤環(huán)境的微小變化[35].由表3 可知,不同改良處理組的AWCD 值隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷地增加.其中,RM 組AWCD 值在前180d 增長(zhǎng)緩慢,而180d 后增長(zhǎng)迅速;其余處理組均隨時(shí)間顯著增長(zhǎng).在培養(yǎng)540d 時(shí),RM 組的AWCD 值相對(duì)較低為(0.504±0.004);V-RM 組為(0.588±0.012),與RM 組相比增加了16.67%;F-RM 組AWCD 值最高為(0.882±0.011),與RM 組相比增加了75%.AWCD 值越大說(shuō)明其微生物的密度越大,活性越高[36],故不同改良處理的改良效果為F-RM 組＞V-RM 組＞RM 組.

群落多樣性指數(shù)可以用來(lái)分析土壤微生物群落的功能多樣性,反映土壤微生物群落利用碳源類(lèi)型的差異[37].由表3 可知,不同改良處理組隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,Shannon 指數(shù)在不斷地增加,即微生物物種豐富度不斷增大.利用粉煤灰和蛭石改性赤泥均促進(jìn)了赤泥基質(zhì)中微生物Shannon 指數(shù)的增長(zhǎng),且添加粉煤灰改良效果更加明顯.在培養(yǎng)30d 時(shí),V-RM、F-RM 組與RM 組相比Shannon 指數(shù)分別增加了0.01 和0.52;培養(yǎng)540d 時(shí),V-RM、F-RM 組的Shannon 指數(shù)較RM 組增長(zhǎng)了0.26 和 2.485.在微生物優(yōu)勢(shì)物種方面,在 540d 時(shí)不同處理組的Simpson 指數(shù)存在顯著差異性,說(shuō)明赤泥基質(zhì)改良處理可顯著改變其優(yōu)勢(shì)物種的組成.

本研究通過(guò)2種不同改良處理赤泥基質(zhì)AWCD值與純赤泥相比顯著增大,說(shuō)明粉煤灰和蛭石的添加改善了赤泥基質(zhì)的土壤環(huán)境.Jones 等也通過(guò)對(duì)赤泥進(jìn)行改良,從而提高其有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分含量,使赤泥基質(zhì)的土壤環(huán)境更適宜微生物的生長(zhǎng)和繁殖[38].同時(shí)根據(jù)土壤微生物群落多樣性指數(shù)分析結(jié)果表明,各處理組隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),Shannon 指數(shù)在不斷地增加.粉煤灰和蛭石的添加能夠促進(jìn)赤泥基質(zhì)中微生物群落物種豐富度的快速增長(zhǎng),并且粉煤灰的改良效果更加明顯.

2.5 基質(zhì)改良對(duì)赤泥微生物群落結(jié)構(gòu)變化的影響

2.5.1 α-多樣性分析 OTU 是系統(tǒng)發(fā)生學(xué)或群體遺傳學(xué)研究中,劃定的一個(gè)分類(lèi)單元,通過(guò)歸類(lèi)操作,按照97%的相似性閥值將序列劃分為不同的OTU,每個(gè)OTU 被視為一個(gè)微生物物種,OTU 的數(shù)量可以代表樣品物種的豐度.Coverage 指數(shù)可用來(lái)判斷本次測(cè)序結(jié)果能否代表樣本的實(shí)際情況.其數(shù)值越高,表明樣本文庫(kù)覆蓋率越高.Chao1 指數(shù)可用于反映樣品微生物豐度,而Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)則用于表征微生物群落多樣性.Chao1 指數(shù)值越大,樣品中細(xì)菌微生物群落的豐富度就越高;Shannon 指數(shù)值越大,細(xì)菌群落的多樣性越高;Simpson 指數(shù)值越小,土壤微生物均勻度越高[39].

表4 不同處理下土壤微生物OTU 及α-多樣性指數(shù)Table 4 The α-diversity index and OTU of soil bacterial and fungal under different treatments

由表4 可知,所有處理Coverage 指數(shù)均在0.99以上,表明本次測(cè)序數(shù)據(jù)能夠覆蓋當(dāng)前狀態(tài)下不同處理樣品中的細(xì)菌及真菌種類(lèi),符合微生物多樣性分析的要求,能真實(shí)反映樣本中的菌群落情況,可用于后續(xù)分析.與添加蛭石、粉煤灰修復(fù)處理(T5、T6)30d 相比,對(duì)照組(T4)在無(wú)任何改良措施的條件下,自然恢復(fù)540d 赤泥基質(zhì)中微生物的OTU、Shannon、Chao1 指數(shù)值并未發(fā)生顯著變化;但培養(yǎng)至540d時(shí),OTU、Shannon、Chao1 指數(shù)顯著增加,說(shuō)明粉煤灰和蛭石的加入可有效促進(jìn)赤泥基質(zhì)微生物菌群的豐度和多樣性的恢復(fù).其原因可能是由于粉煤灰及蛭石的加入改善了赤泥基質(zhì)的基本理化性質(zhì),為土著微生物提供了良好的生存環(huán)境,致使赤泥基質(zhì)中細(xì)菌及真菌菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化,但與純土壤(T1)相比仍較低,需進(jìn)一步培養(yǎng)恢復(fù).

2.5.2 微生物群落結(jié)構(gòu)分析 由高通量測(cè)序分析可知,本研究中細(xì)菌主要分屬15 個(gè)門(mén)(圖3),包括變形菌門(mén)(Proteobacteria),酸桿菌門(mén)(Acidobacteria),芽單 胞 菌 門(mén) (Gemmatimonadetes), 放 線(xiàn) 菌 門(mén)(Actinobacteria),浮霉菌門(mén)(Planctomycetes),擬 桿 菌門(mén)(Bacteroidetes),綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)等.通過(guò)不同改良處理,細(xì)菌群落在門(mén)水平上的差異較為顯著.其中變形菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)和芽單孢菌門(mén)為純赤泥基質(zhì)(T4)中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén),其相對(duì)豐度分別為21.39%、38.78%和18.42%.在培養(yǎng)540d 后,與純赤泥(T4)相比,兩種改良處理(T5、T6)均顯著抑制了芽單胞菌門(mén)(Gemmatimonadetes)及厚壁菌門(mén)(Firmicutes)的生長(zhǎng).其中所包含的芽孢桿菌是一類(lèi)好氧和兼性厭氧型革蘭氏陽(yáng)性桿狀細(xì)菌或球狀細(xì)菌,抗逆性強(qiáng)、生長(zhǎng)快、分布極其廣泛,是土壤和植物根際的重要微生物種群[40],因此對(duì)赤泥鹽堿環(huán)境具有很好的適用性.而經(jīng)過(guò)改良,赤泥基質(zhì)理化性質(zhì)得到一定改善,其所占比例也隨之下降.添加粉煤灰改良(T6)處理后,酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)菌群豐富度較純赤泥基質(zhì)(T4)有顯著增加,即其在菌群中的占比由0.51%增長(zhǎng)到5.43%,但仍顯著低于其在自然土壤中的菌群占比(24.17%).Schmalenberger 等[41]研究發(fā)現(xiàn),通過(guò)菌種鑒定和PCR技術(shù)分析,經(jīng)石膏和堆肥處理改良后的赤泥中含有大量酸桿菌,這些菌群通過(guò)代謝產(chǎn)酸作用可實(shí)現(xiàn)對(duì)赤泥堿性的中和調(diào)控,有利于促進(jìn)赤泥堆場(chǎng)生物修復(fù),在對(duì)赤泥強(qiáng)堿性環(huán)境的適應(yīng)及堿性調(diào)控方面有其潛在優(yōu)勢(shì)[42].同時(shí),隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),赤泥基質(zhì)理化性質(zhì)得到改善,土壤酶活性提高,更加適宜生物生存和繁殖,故細(xì)菌的數(shù)量及種類(lèi)均得到提升.但其微生物群落組成仍與自然土壤存在顯著差異,分析其原因可能與各改良基質(zhì)的鹽堿性環(huán)境相關(guān).

圖3 不同改良處理下細(xì)菌門(mén)水平的相對(duì)豐度Fig.3 The relative abundance of the dominant bacterial phylum under different improved treatments

對(duì)不同處理組中的真菌門(mén)水平群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行 了高通量測(cè)序分析,結(jié)果如圖4 所示.所測(cè)不同處理組赤泥基質(zhì)中的真菌主要分屬9 個(gè)門(mén),包括子囊菌門(mén)(Ascomycota),未分類(lèi)真菌(Fungi_unclassified),擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota),接合菌門(mén)(Zygomycota),鞭毛菌門(mén)(Mortierellomycota),壺菌門(mén)(Chytridiomycota),球 囊 菌 門(mén) (Glomeromycota) 和 羅 茲 菌 門(mén)(Rozellomycota)等.當(dāng)修復(fù)方法不同時(shí),赤泥基質(zhì)中的真菌在門(mén)水平上的差異較為顯著.純赤泥基質(zhì)中微生物量占比最大的為子囊菌門(mén)(Ascomycota,85.71%),其次是未分類(lèi)真菌(Fungi_unclassified,13.43%)及擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota,0.82%).與純赤泥組(T5)相比,改良處理后會(huì)降低赤泥基質(zhì)中未分類(lèi)真菌(Fungi_unclassified)的比例;而粉煤灰的添加(T6)還會(huì)增大擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)所占比例、抑制子囊菌門(mén)的生長(zhǎng).這與陳凱麗[43]利用有機(jī)物修復(fù)鹽堿土壤結(jié)果相同.綜上可得,粉煤灰和蛭石的添加可顯著改變赤泥土壤真菌的微生物群落結(jié)構(gòu),與細(xì)菌變化相同,赤泥基質(zhì)中真菌的數(shù)量和種類(lèi)也明顯增加,通過(guò)聚類(lèi)分析可知,添加粉煤灰改良后赤泥基質(zhì)土壤化程度得到一定提升.

圖4 不同改良處理下真菌門(mén)水平的相對(duì)豐度Fig.4 The relative abundance of the dominant fungal phylum under different improved treatments

2.6 微生物群落結(jié)構(gòu)與主導(dǎo)環(huán)境因子

圖5 環(huán)境因子對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)影響的冗余分析Fig.5 Redundancy analysis between soil properties and microbial community structure

將各處理組門(mén)水平優(yōu)勢(shì)種群與環(huán)境因子相結(jié)合,利用冗余分析(RDA)探究微生物菌群與環(huán)境變化的關(guān)系.如圖5,通過(guò)微生物群落與環(huán)境因子間的冗余分析結(jié)果可知,第一、二排序軸分別解釋了89.46%和10.54%的變異,且微生物群落分布特征主要受赤泥土壤pH 值、堿化度ESP、電導(dǎo)率EC、孔隙度及-N 等理化指標(biāo)影響.V-RM 處理組樣本點(diǎn)分布在第二象限,F-RM 處理組樣品點(diǎn)分布在第四象限,而RM 處理組樣品點(diǎn)處于第三象限,表明不同處理組之間微生物群落組成具有明顯的差異性.此外,分析各環(huán)境因子與優(yōu)勢(shì)種群之間的關(guān)系可知,細(xì)菌酸桿菌門(mén)(Acidobacteria) 、 變形菌門(mén)(Proteobacteria)及疣微菌門(mén)(Verrucom)與孔隙度和硝態(tài)氮呈正相關(guān)關(guān)系,而藍(lán)藻菌門(mén)(Cyanobac)、芽單孢菌門(mén)(Gemmatimonadetes)及厚壁菌門(mén)(Firmicutes)則主要受pH 值、堿化度ESP 及電導(dǎo)率EC 的影響比較大.

3 結(jié)論

3.1 通過(guò)添加蛭石和粉煤灰進(jìn)行改良,有效調(diào)控了赤泥基質(zhì)鹽堿性,其pH 值、堿化度ESP 和EC 值均顯著降低.其中540d 時(shí),F-RM 組pH 值已降至8.49,趨近于參照土壤(8.51);同時(shí),容重、孔隙度也得到明顯改善.

3.2 在肥力水平方面,F-RM 組硝態(tài)氮含量顯著提高,達(dá)到了28.27mg/kg,為微生物生存繁殖提供了良好的營(yíng)養(yǎng)條件.

3.3 與此同時(shí),理化性質(zhì)及肥力水平的改善,進(jìn)一步刺激了赤泥基質(zhì)酶活性,大幅提高了微生物群落多樣性,表征微生物群落代謝水平的AWCD 值也由0.059 增長(zhǎng)至0.882(F-RM 組).

3.4 改良培養(yǎng)后,赤泥基質(zhì)中的微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化,代謝產(chǎn)酸能力較強(qiáng)的微生物,如酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)、放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria)的所占比例顯著提升,成為優(yōu)勢(shì)種群.這些菌群通過(guò)代謝產(chǎn)酸作用可實(shí)現(xiàn)對(duì)赤泥堿性的中和調(diào)控,有利于促進(jìn)赤泥堆場(chǎng)生物修復(fù).

3.5 綜合比較分析各處理的赤泥土壤化修復(fù)改良效果可知,粉煤灰添加處理對(duì)赤泥微生物群落結(jié)構(gòu)、代謝活性以及土壤酶功能的促進(jìn)作用均優(yōu)于蛭石改良處理.這為赤泥土壤化修復(fù)在改良材料的選擇方面提供了有效參考.