薄層色譜法和高效液相色譜法在柴苓清肝丸質(zhì)量控制中的應(yīng)用價值

彭善祥，杜希揚(yáng)，范天柱，朱玉蘋

（臨沂市中醫(yī)醫(yī)院，山東 臨沂 276002）

中成藥具有成分多樣的特點。中成藥的質(zhì)量控制一直是中醫(yī)藥領(lǐng)域研究的難點。柴苓清肝丸由柴胡、茯苓、牡丹皮、黃芪、黃芩、黃連、赤芍、郁金、薏苡仁等19 味中藥組成。我院常用柴苓清肝丸治療肝郁脾虛、濕毒內(nèi)蘊(yùn)之證[1]。臨床上常用薄層色譜法和高效液相色譜法對藥物進(jìn)行質(zhì)量控制。本次研究主要是分析薄層色譜法和高效液相色譜法在柴苓清肝丸質(zhì)量控制中的應(yīng)用價值。

1 儀器與試藥

本次實驗使用的儀器是KDM 型連續(xù)可調(diào)控溫電熱套（山東省鄄城華魯電熱儀器有限公司生產(chǎn)）、ZF-2 型三用紫外分析儀（邢臺潤聯(lián)科技開發(fā)有限公司生產(chǎn)）、TG328A（S）分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)）、ZB-1A型智能崩解儀（上海黃海藥檢儀器有限公司生產(chǎn)）、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（滄州雙興儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)）、硅膠G( 青島海洋化工有限公司生產(chǎn))。本次實驗使用的試藥是丹皮酚（110708-201407）、黃芪甲苷（0781-200210）、黃連（120913-201611）、黃芩苷（110715-201720）、芍藥苷（110738-201337），這些試藥均購自于中國藥品生物制品檢定所。本次實驗使用的試劑均為分析純級別，使用的水均為純化水。本次實驗使用的三個批次的柴苓清肝丸（批號分別為20170401、20170413、20170421）均購自于臨沂市中醫(yī)醫(yī)院中藥制劑中心。

2 用薄層色譜法鑒別柴苓清肝丸中相關(guān)成分的方法及結(jié)果

2.1 用薄層色譜法鑒別柴苓清肝丸中牡丹皮的方法及結(jié)果

取1g 的柴苓清肝丸粉末，將其加入到試管中，另在試管中加入10ml 的乙醚。密塞試管，振搖10 分鐘后進(jìn)行濾過處理。揮干濾液中的溶劑，在殘渣中加入2ml 的丙酮，使其溶解，將此溶液作為供試品溶液。另取適量的丹皮酚對照品，加入丙酮，制成每1ml 中含有2mg 丹皮酚對照品的溶液，將此溶液作為對照品溶液。取處方中除牡丹皮以外的其他藥物，按照處方的比例制成獨缺牡丹皮的陰性對照樣品。按照制備供試品溶液的方法，將獨缺牡丹皮的陰性對照樣品制成陰性對照溶液[2]。吸取上述兩種溶液各10μl，將其分別點在同一個硅膠G 薄層板上。將環(huán)己烷- 乙酸乙酯- 冰醋酸（4:1:0.1）作為展開劑對硅膠G 薄層板上的溶液進(jìn)行展開處理，然后取出、晾干，噴上濃度為2% 的香草醛硫酸乙醇溶液。將硅膠G 薄層板放到105℃的環(huán)境中加熱至斑點顯色清晰。檢視供試品色譜，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上若顯現(xiàn)出相同顏色的主斑點，表示檢測結(jié)果為陰性，無干擾。對三批樣品進(jìn)行檢驗的結(jié)果顯示，此法的操作簡便，重現(xiàn)性良好。見圖1。

圖1 用薄層色譜法鑒別柴苓清肝丸中牡丹皮的結(jié)果

2.2 用薄層色譜法鑒別柴苓清肝丸中黃芪的方法及結(jié)果

取17 g 的柴苓清肝丸，將其研磨呈粉末。在柴苓清肝丸粉末中加入50ml 的甲醇，經(jīng)超聲處理30 分鐘后，進(jìn)行濾過處理。將濾液蒸干，在殘渣中加入30ml 的水，使其溶解，用經(jīng)水飽和處理的正丁醇提取2 次（30ml/ 次），合并正丁醇液。加三倍量的氨試液，搖勻，放置，使其分層，蒸干正丁醇液。在殘渣中加入1ml 的甲醇，使其溶解，將此溶液作為供試品溶液[3]。另取適量的黃芪甲苷對照品，在此對照品中加入甲醇，制成每1ml 中含有1mg 此對照品的溶液，將此溶液作為對照品溶液。取處方中除黃芪以外的其他藥品，按照處方的比例制成獨缺黃芪的陰性對照樣品。按照制備供試品溶液的方法將獨缺黃芪的陰性對照樣品制成陰性對照溶液[4]。分別吸取5 μl 的供試品溶液、5 μl 的陰性樣品溶液、2 μl 的對照品溶液，將上述溶液分別點在同一個硅膠G 薄層板上。將三氯甲烷- 甲醇- 水（13:7:2）放置在10℃的環(huán)境中，放置使其分層，取下層溶液作為展開劑對硅膠G 薄層板上的溶液進(jìn)行展開處理，取出、晾干，噴上10% 的硫酸乙醇溶液。將硅膠G 薄層板放到105℃的環(huán)境中加熱至斑點顯色清晰。在紫外光燈（波長為365nm）下進(jìn)行檢視，在供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上若顯現(xiàn)出相同顏色的斑點，表示檢測結(jié)果呈陰性，無干擾。對三批樣品進(jìn)行檢驗的結(jié)果顯示，此法的操作簡便，重現(xiàn)性良好。見圖2。

圖2 用薄層色譜法鑒別柴苓清肝丸中黃芪的結(jié)果

2.3 用薄層色譜法鑒別柴苓清肝丸中黃連的方法及結(jié)果

取0.25g 的柴苓清肝丸，將其研磨呈粉末。在此粉末中加入25ml 的甲醇，超聲處理30 分鐘后，進(jìn)行濾過處理，將濾液作為供試品溶液。另取0.25g 的黃連對照藥材，采用同樣的方法制成對照藥材溶液。取處方中除黃連以外的其他藥品，按照處方的比例制成獨缺黃連的陰性對照樣品。按照制備供試品溶液的方法，制成獨缺黃連的陰性對照樣品[5]。吸取上述三種溶液各1μl，分別點在同一個高效硅膠G 薄層板上。將環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺（3:3.5:1:1.5:0.5:1）作為展開劑，將此試劑置于用濃氨試液預(yù)飽和處理20 分鐘的展開缸內(nèi)進(jìn)行展開處理后，取出、晾干，置于紫外光燈（波長為365nm）下進(jìn)行檢視。在檢視的供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上若顯現(xiàn)出相同顏色的主斑點，表明檢測結(jié)果呈陰性，無干擾。對三批樣品進(jìn)行驗證的結(jié)果顯示，此法的操作簡便，重現(xiàn)性良好。見圖3。

圖3 用薄層色譜法鑒別柴苓清肝丸中黃連的結(jié)果

2.4 用薄層色譜法鑒別柴苓清肝丸中黃芩的方法及結(jié)果

取1g 的柴苓清肝丸粉末，將其加入到30ml 的乙酸乙酯-甲醇（3:1）混合溶液中。將此溶液加熱、回流30 分鐘后，放冷、濾過，蒸干濾液。在殘渣中加入5ml 的甲醇，使其溶解，取上清液作為供試品溶液。取黃芩苷對照品，將其加入到甲醇中，制成每1ml 中含有1mg 黃芩苷對照品的溶液，將此溶液作為對照品溶液。取處方中除黃芩以外的其他藥品，按照處方的比例制成獨缺黃芩的陰性對照樣品[6]。吸取上述三種溶液各2μl，分別點在同一個硅膠G 薄層板上。將甲苯-乙酸乙酯- 甲醇- 甲酸（10:3:1:2）作為展開劑，預(yù)飽和處理30 分鐘后，將硅膠G 薄層板展開、取出并晾干，置于紫外光燈（波長為365nm）下檢視。在檢視的供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上若顯現(xiàn)出相同顏色的主斑點，表明檢驗結(jié)果呈陰性，無干擾。對三批樣品進(jìn)行驗證的結(jié)果顯示，此法的操作簡便，重現(xiàn)性良好。見圖4。

圖4 用薄層色譜法鑒別柴苓清肝丸中黃芩的結(jié)果

2.5 用薄層色譜法鑒別柴苓清肝丸中赤芍的方法及結(jié)果

取0.5g 的本品粉末，將其加入到10ml 的乙醇中，振搖5 分鐘后，濾過，蒸干濾液。在殘渣中加入2ml 的乙醇，使其溶解，將此溶液作為供試品溶液。另取芍藥苷對照品，在此對照品中加入乙醇，制成每1ml 中含有2mg 此對照品的溶液，將此溶液作為對照品溶液。取處方中除赤芍以外的其他藥品，按照處方的比例制成獨缺赤芍的陰性對照樣品。按照制備供試品溶液的方法，制成陰性對照溶液[7]。吸取上述三種溶液各4μl，分別點在同一個硅膠G 薄層板上。將三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40:5:10:0.2）作為展開劑，對硅膠G 薄層板進(jìn)行展開處理后，取出、晾干，噴上5%的香草醛硫酸溶液，加熱至斑點顯色清晰。在檢視的供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上若顯現(xiàn)出相同顏色的主斑點，表示檢驗結(jié)果為陰性，無干擾。經(jīng)三批樣品驗證，此法的操作簡便，重現(xiàn)性良好。見圖5。

3 用高效液相色譜法檢測柴苓清肝丸中丹皮酚含量的方法及結(jié)果

采用蒸餾- 煎煮法和超聲提取法提取丹皮酚。結(jié)果顯示，經(jīng)超聲提取獲得丹皮酚的提取量較高[8]。考慮到提取方法的省時性，故采用甲醇作為溶劑，采用超聲提取30 min的方法提取柴苓清肝丸中的丹皮酚[9]。

3.1 色譜條件

本次實驗使用的色譜柱為WondaSil C18 色譜柱（4.6×150mm，5μm），流動相為甲醇- 水（45:55）。流動相的流速為1ml/min，檢測波長為274nm，柱溫為25℃，按照丹皮酚峰計，理論板數(shù)應(yīng)不低于3000。

3.2 制備溶液的方法

本次實驗使用的溶液包括供試品溶液、陰性對照品溶液、對照品溶液。1）制備供試品溶液的方法是：精密稱取2.047g 的柴苓清肝丸，將其置于50ml 的容量瓶中。在容量瓶中加入適量的甲醇，經(jīng)超聲處理（功率為250W，頻率為50 KHz）30 分鐘后，放冷，用甲醇定容至50ml，搖勻后進(jìn)行離心處理，取上清液。對上清液進(jìn)行濾過處理，取續(xù)濾液，即得本次實驗的供試品溶液。2）制備陰性對照品溶液的方法是：去除處方中的牡丹皮，制成陰性樣品。按照制備供試品溶液的方法制備陰性對照品溶液。3）精密稱取0.6mg的丹皮酚對照品，加入甲醇，制成每1ml 中含有120 μg 丹皮酚的溶液，即得本次實驗的對照品溶液。將制備好的供試品溶液、陰性對照品溶液、對照品溶液分別注入到色譜儀中進(jìn)行檢測。本次實驗供試品溶液、對照品溶液、陰性對照品溶液的色譜圖見圖6。

圖6 本次實驗供試品溶液、對照品溶液、陰性對照品溶液的色譜圖

3.3 進(jìn)行線性關(guān)系考察實驗的方法及結(jié)果

精密稱取1.2mg 的丹皮酚對照品，加入甲醇，制成每1ml中含有120 μg 丹皮酚的溶液，即得本次實驗的丹皮酚對照品溶液。精密量取1ml 的丹皮酚對照品，加入甲醇，制成每1ml 中含有96 μg 丹皮酚的溶液。精密稱取1ml 第一個丹皮酚對照品，加入甲醇，制成每1ml 中含有60 μg 丹皮酚的溶液。精密稱取1ml 第二個丹皮酚對照品，加入甲醇，制成每1ml 中含有30 μg 丹皮酚的溶液。精密稱取1ml 第三個丹皮酚對照品，加入甲醇，制成每1ml 中含有15 μg丹皮酚的溶液。分別吸取10μl 這四種濃度的對照品溶液，將其分別注入到液相色譜儀中。測得丹皮酚的峰面積，回歸方程f(x)=0.9226x+1.1884，R=0.9996。結(jié)果表明，丹皮酚在15 ～120 μg/ml 范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好。見圖7。

3.4 進(jìn)行精密度實驗的方法及結(jié)果

精密吸取濃度為120μg/ml 的對照品溶液，按照本次實驗的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，考察色譜峰相對保留時間和峰面積比值的一致性。結(jié)果表明，RSD 值為0.5%，符合指紋圖譜研究的技術(shù)要求。

3.5 進(jìn)行重復(fù)性實驗的方法及結(jié)果

取同一批次的樣品（批號為20170401），制備六份供試品溶液。按照本次實驗的色譜條件分別進(jìn)樣測定，色譜峰相對保留時間和峰面積比值無明顯變化，RSD 值為0.5%。這表明，本次實驗的重復(fù)性良好。

3.6 測定柴苓清肝丸中丹皮酚含量的方法及結(jié)果

取3 個批號的柴苓清肝丸，制備六份供試品溶液。按照本次實驗的色譜條件測定三個批號柴苓清肝丸樣品中丹皮酚的含量。測得的RSD 值分別為1.1%、1.2%、1.8%，丹皮酚的含量分別為960 μg/g、940 μg/g、953 μg/g，丹皮酚含量的平均值為951 μg/g。見表1。

表1 三個批次柴苓清肝丸中丹皮酚含量的測定結(jié)果

4 討論

在本次研究中，采用薄層色譜法鑒別柴苓清肝丸中的牡丹皮、黃芪、黃連、黃芩、赤芍。研究結(jié)果證實此鑒別方法的專屬性強(qiáng)，操作簡便。用高效液相色譜法對柴苓清肝丸的主要成分丹皮酚進(jìn)行含量測定。結(jié)果顯示，此法的靈敏度高、重現(xiàn)性好，這為柴苓清肝丸的質(zhì)量控制和進(jìn)一步研究提供了參考依據(jù)。