新型冠狀病毒肺炎尸檢樣本中福爾馬林色素的識別與消除

段 裴，劉旭光，付 冉，蔡航航，劉泰文，許三鵬

2019年底至今肆虐全球的新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)已經(jīng)造成全球7 512萬余人感染[1]。新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019, COVID-19)尸檢樣本是珍貴并極具價值的診斷和研究材料。2020年2～3月華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院病理研究所與同濟醫(yī)學院法醫(yī)學系共同完成了9例COVID-19尸檢工作。在病理診斷與研究過程中，首先在部分免疫組化切片中發(fā)現(xiàn)了棕褐色大小不等的圓形球狀顆粒。這些棕褐色顆粒對免疫組化結(jié)果判讀造成了困擾。復習HE切片時，發(fā)現(xiàn)在相同位置存在類似的棕黑色顆粒分布，需與肺部的碳顆粒、含鐵血黃素顆粒、腦的脂褐素、肝臟的膽色素等色素鑒別。綜合分析認為這些棕褐色、棕黑色近圓形顆粒更像是福爾馬林色素。查閱文獻[2]后使用消除福爾馬林色素的方法對相關(guān)切片進行處理，發(fā)現(xiàn)經(jīng)處理后相關(guān)色素消失，證明了最初的推斷?，F(xiàn)對相關(guān)實驗方法、處理經(jīng)驗介紹如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源收集2020年2～3月華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院病理研究所和同濟醫(yī)學院法學系共同尸檢的9例COVID-19，尸檢組織行HE染色，鏡下觀察。取其中1例COVID-19尸檢樣本的心、肝、脾、肺、腎等組織和1例非COVID-19子宮肌瘤手術(shù)樣本(對照組織)制備組織芯片，進行脫色素和相關(guān)實驗。

1.2 試劑配制50 mL氨水加入350 mL無水乙醇，使用蒸餾水補足500 mL，得到10%氨水乙醇溶液。Ki-67(UMAB107，1 ∶400稀釋，北京中杉金橋公司)，免疫組化二抗系統(tǒng)(EnVision K8002，DAKO公司)。HE染色使用日本櫻花全自動HE染色與封片系統(tǒng)進行，Ki-67免疫組化染色在DAKO公司AUTOSTAINER LINK48自動免疫組化儀上進行。

1.3 方法(1)觀察9例COVID-19尸檢樣本HE染色切片中心、肝、脾、肺、腎等組織中福爾馬林色素存在狀態(tài)。(2)取其中1例COVID-19心、肝、脾、肺、腎等樣本和1例非COVID-19子宮肌瘤組織(組織對照)，制作成多組織芯片蠟塊。多組織芯片蠟塊常規(guī)4 μm厚連續(xù)切片5張。取第1張多組織芯片行常規(guī)HE染色。第2張多組織芯片常規(guī)脫蠟后，使用10%氨水乙醇溶液室溫(25 ℃)浸泡20 min，流水沖洗5 min后行常規(guī)HE染色，以明確脫福爾馬林色素操作對HE染色結(jié)果的影響。(3)取第3張多組織芯片行常規(guī)Ki-67免疫組化染色(常規(guī)脫蠟至水；pH 9.0修復液高壓修復，噴氣后計時2 min；3%過氧化氫封閉10 min；Ki-67一抗工作液室溫孵育60 min；Reaction Buffer沖洗；EnVision二抗室溫孵育30 min；Reaction Buffer沖洗；DAB顯色，室溫孵育10 min；蒸餾水沖洗；復染，封片)。第4張常規(guī)脫蠟、修復、10%過氧化氫封閉后，使用10%氨水乙醇溶液浸泡封閉20 min后，流水沖洗5 min，然后按常規(guī)流程行Ki-67免疫組化染色。第5張按第3張多組織芯片行常規(guī)Ki-67免疫組化染色完成后，脫水透明封片前，使用10%氨水乙醇溶液室溫浸泡封閉20 min后，流水沖洗5 min，進行后續(xù)脫水透明與封片，明確10%氨水乙醇溶液脫福爾馬林色素操作對免疫組化染色的影響。通過上述10%氨水乙醇溶液脫福爾馬林色素前后HE和免疫組化染色的比較，明確COVID-19尸檢樣本中福爾馬林色素存在狀態(tài)和10%氨水乙醇溶液褪色的效果及其對相關(guān)染色的影響。

2 結(jié)果

2.1 HE染色切片中福爾馬林色素的分布心、肝、脾、肺、腎等組織中均有不同程度的福爾馬林色素出現(xiàn)。不同組織中存在的程度不同，差異明顯；按照色素多少排序，脾臟>腎臟>肺臟>腦>肝臟。其中脾臟在細胞間質(zhì)和脾臟細胞中廣泛存在；腎臟中近曲小管、遠曲小管和腎小球的細胞質(zhì)中均存在(圖1)；肺臟中的福爾馬林色素出現(xiàn)在血管上皮胞質(zhì)和紅細胞表面，少量吞噬細胞中也可查及(圖2)。腦組織和肝臟中較少出現(xiàn)。福爾馬林色素在HE染色切片中呈現(xiàn)大小不等的棕黑色圓形球狀顆粒。

2.2 HE染色切片中福爾馬林色素的消除其中1例COVID-19尸檢樣本的心、肝、脾、肺、腎和非COVID-19子宮肌瘤組織芯片常規(guī)脫蠟后使用10%氨水乙醇溶液室溫浸泡20 min，水洗5 min后與對照未處理切片一起行HE染色，封片。各組織中所有棕黑色福爾馬林色素完全消失(圖3、4)，與對照組HE染色差異無顯著性。對照組子宮肌瘤組織處理前后HE染色未見明顯差異。

2.3 福爾馬林色素消除對免疫組化判讀的影響Ki-67常規(guī)免疫組化染色切片中可見棕褐色、大小不等的圓形球狀顆粒，其分布數(shù)量和位置與HE染色切片中的分布一致，胞核陽性的Ki-67免疫組化染色切片中可見胞質(zhì)和胞膜中的福爾馬林色素(圖5)，除了分布特點不同幾乎與DAB顯色的顏色和深淺完全一致，難以鑒別。免疫組化反應(yīng)前和免疫組化反應(yīng)后分別使用10%氨水乙醇溶液進行脫色素處理福爾馬林色素，幾乎完全消除(圖6)，僅在部分區(qū)域可見非常淺的棕色色素殘留痕跡，易與DAB顯色的色素鑒別。3張組織芯片中各組織中Ki-67的表達未見明顯差異。

圖1 腎臟HE染色可見腎小球、近曲小管和遠曲小管細胞質(zhì)中存在福爾馬林色素顆粒(黃色箭頭) 圖2 肺臟HE染色可見紅細胞表面、血管上皮細胞質(zhì)和少量吞噬細胞胞質(zhì)中存在福爾馬林色素顆粒(黃色箭頭) 圖3 腎臟經(jīng)10%氨水乙醇溶液脫色后進行HE染色、腎小球、近曲小管和遠曲小管細胞質(zhì)中棕黑色福爾馬林色素完全消失，HE染色未見明顯影響 圖4 肺臟HE染色可見紅細胞表面、血管上皮細胞質(zhì)和少量吞噬細胞胞質(zhì)中福爾馬林色素顆粒完全消失，HE染色未見明顯影響 圖5 脾臟Ki-67免疫組化染色可見除Ki-67胞核陽性，在組織細胞中廣泛存在深棕褐色福爾馬林色素顆粒(黃色箭頭)難以與DAB色素區(qū)分 圖6 脾臟使用10%氨水乙醇溶液進行脫色，可見福爾馬林色素完全消失，Ki-67免疫組化染色結(jié)果未受明顯影響

3 討論

10%中性緩沖福爾馬林作為標準固定液在臨床外科病理診斷工作的樣本處理過程中廣泛、規(guī)范使用，在常規(guī)病理診斷工作中已經(jīng)很難查見福爾馬林色素。COVID-19尸檢團隊首先在COVID-19尸檢樣本的免疫組化染色切片中發(fā)現(xiàn)了定位清晰，分布廣泛的圓形棕褐色圓形球狀顆粒，尤其是在進行病毒蛋白的染色預實驗時，這種顆粒最初甚至被認為是病毒顆粒染色。后來經(jīng)過仔細閱片，發(fā)現(xiàn)HE切片中同樣位置有圓形棕黑色球樣顆粒存在，懷疑這些色素并非病毒顆粒的陽性染色而是某種假陽性或內(nèi)源性顆粒。多次實驗后逐步排除了這類棕褐色或棕黑色顆粒是內(nèi)源性地高辛、內(nèi)源性生物素和內(nèi)源性過氧化物酶作用結(jié)果的可能性。其與老年性脂褐素和肝臟的膽色素在形狀、分布和顏色上差異有顯著性，易識別，最終我們將目標鎖定為“福爾馬林色素”[3-5]。

因此，設(shè)計了本實驗，驗證推測并明確脫色處理對于后續(xù)HE染色、免疫組化染色的影響。根據(jù)文獻[2-5]，最初將目標脫色液設(shè)定為飽和苦味酸乙醇溶液；實驗準備時，發(fā)現(xiàn)苦味酸屬于?；罚喾角筚従促彽?。繼續(xù)檢索文獻[3,6-8]發(fā)現(xiàn)1%NaOH乙醇溶液、1%KOH乙醇溶液、10%氨水乙醇溶液均可作為福爾馬林脫色溶液。考慮到NaOH和KOH均為強堿，難以購買，而氨水化學性質(zhì)較平和、安全、易購，所以選擇10%氨水乙醇溶液作為本實驗的福爾馬林色素脫色溶液。實驗結(jié)果顯示，10%氨水乙醇溶液可以有效去除尸檢組織細胞中的棕黑色或棕褐色圓形球狀顆粒樣色素，這即明確了福爾馬林色素的存在，同時也說明該脫色液是有效的；使用該脫色液進行脫色并充分水洗后，進行后續(xù)的HE和免疫組化染色，對結(jié)果無影響。以Ki-67免疫組化染色為例，于免疫組化反應(yīng)前或后進行脫色反應(yīng)，對免疫組化染色結(jié)果無影響，但考慮到免疫組化染色過程中眾多影響因素的不確定性，筆者建議可以在完成免疫組化的DAB顯色后再進行脫色反應(yīng)，即不會影響免疫組化染色，也不會對DAB染色結(jié)果造成影響。10%氨水乙醇脫色液作用時間短，脫福爾馬林效果理想，可以作為病理科脫福爾馬林色素的首選方法。需要注意的是，10%氨水乙醇脫色液具有較強的刺激性氣味，儲存液體需使用帶蓋可密封的塑料瓶室溫避光保存，脫色時使用玻璃帶蓋考普林瓶，操作時人員帶手套，口罩，處于上風口，避免吸入刺激性氣味。

通常，人們認為組織長期在酸性福爾馬林的固定下酸性甲醛作用于組織內(nèi)血紅蛋白形成酸性甲醛正鐵血紅素復合物，即福爾馬林色素[4]。本次尸檢樣本采用了40%甲醛溶液，進行短時間固定，也出現(xiàn)了福爾馬林色素，說明其可能與福爾馬林的濃度也有關(guān)系。有研究顯示，在腐敗的尸檢組織中福爾馬林色素的數(shù)量更多，認為組織和細胞在腐敗過程中的酸化也會導致福爾馬林色素的產(chǎn)生[7]。傳統(tǒng)上認為福爾馬林色素往往出現(xiàn)在出血較多即血紅蛋白豐富的組織和細胞區(qū)域，但對本次尸檢樣本的觀察發(fā)現(xiàn)，福爾馬林色素除了在脾臟組織間質(zhì)和細胞內(nèi)廣泛存在，在腎臟中主要存在于腎小管和腎小球的細胞質(zhì)中，那里并沒有血紅蛋白的大量存在。也未發(fā)現(xiàn)廣泛出血的肺組織中存在大量的福爾馬林色素，而主要聚集于血管基底細胞的胞質(zhì)中和血管內(nèi)紅細胞的胞膜上，類似黏附存在。這些均說明，福爾馬林色素的組成成分可能并非之前認識的那樣。此外，很多文獻描述福爾馬林色素是不定形色素，但本組實驗觀察發(fā)現(xiàn)福爾馬林色素顆粒是非常規(guī)整的圓形球狀顆粒，雖然大小有所差異，但直徑比在3倍以內(nèi)，可以認為其是一種一致性較強的圓形球狀結(jié)構(gòu)。最后，關(guān)于福爾馬林色素的化學性質(zhì)，通常認為其為酸性化合物，這一點可通過本實驗(10%氨水乙醇溶液，堿性)和NaOH、KOH乙醇溶液可有效脫色推斷和解釋，但飽和苦味酸乙醇溶液也被認為是一種有效的脫色液，苦味酸pH值為0.38，是一種強酸，那么苦味酸是如何與福爾馬林色素反應(yīng)使其脫色的？明確福爾馬林色素的化學構(gòu)成，關(guān)系到理解福爾馬林色素產(chǎn)生的機制及其脫色原理。這提醒病理工作者，對于很多病理現(xiàn)象我們?nèi)匀恢跎?，需要繼續(xù)深入探究。