北京郊區(qū)長角血蜱攜帶立克次氏體、泰勒蟲的分子檢測

王 業(yè) ， 張慶勛 ， 李 英 ， 袁國輝 ， 韓姝伊 ， 何宏軒

(1.中國科學(xué)院動(dòng)物研究所 , 北京 朝陽 100101 ； 2.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院 ， 青海 西寧 810016)

蜱是一種體表寄生的吸血性節(jié)肢動(dòng)物，廣泛分布于世界各地，對(duì)人類及動(dòng)物健康存在較大威脅。全球約有近900種蜱，我國已知的蜱類有130余種，包含硬蜱科的7屬120余種和軟蜱科的3屬10余種[1]。有超過28種蜱能引起多種人類疾病[2]。此外，蜱類還可作為多種病原體(細(xì)菌、病毒和原生動(dòng)物)的傳播媒介和儲(chǔ)存宿主，可以攜帶和傳播多種病原體，除引起人和動(dòng)物過敏反應(yīng)、刺激和皮膚損傷外[3-4]，還可引起人與動(dòng)物的梨形蟲病(Piroplasmosis)、立克次氏體病(Rickettsiosis)和無形體病(Anaplasmosis)，對(duì)全球人類和動(dòng)物都具有重要的意義[4-5]。長角血蜱(Haemaphysalislongicornis,H.longicornis)屬于硬蜱科的一種，廣泛分布于世界各地[2]，在我國大部分地區(qū)均有分布，也是北京地區(qū)的優(yōu)勢蜱種，是人類和動(dòng)物疾病的重要載體，可以攜帶無形體屬(Anaplasmaspp.)、埃立克體屬(Ehrlichiaspp.)、巴貝斯屬(Babesiaspp.)、螺旋體屬(Spirochaeta)、柯克斯體屬(Coxiella)和立克次體屬(Rickettsiaspp.)等多種病原體[2]。王亞偉等[6]曾在北京的長角血蜱中檢測出A.capra，盡管長角血蜱是北京地區(qū)的優(yōu)勢蜱種，但對(duì)于其攜帶的蜱傳病原體的研究仍非常有限，為了解北京地區(qū)長角血蜱攜帶蜱傳病原體的情況，本試驗(yàn)采用分子流行病學(xué)研究的方法對(duì)北京郊區(qū)的長角血蜱攜帶立克次氏體、無形體、梨形蟲等情況進(jìn)行調(diào)查，為北京地區(qū)蜱傳疾病的防控提供科研和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 蜱蟲樣品的采集 2019年7月從北京市昌平區(qū)使用布旗法在草地上采集蜱樣品共計(jì)134只。標(biāo)記時(shí)間、地點(diǎn)、日期等信息，裝入采蜱專用的10 mL離心管內(nèi)，送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行蜱的形態(tài)學(xué)鑒定及基因組DNA的提取。

1.2 蜱的形態(tài)學(xué)鑒定 按照對(duì)蜱的描述，在體視顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，同時(shí)對(duì)蜱進(jìn)行分類。

1.3 組織DNA提取 將分類后的蜱每5只分為一組，置于1.5 mL離心管中，以PBS洗滌，重復(fù)2次。之后使用75%酒精對(duì)蜱進(jìn)行消毒，重復(fù)2次。然后棄去酒精，待晾干后用研缽將其組織磨碎，使用天根生化科技有限公司的血液/組織DNA提取試劑盒提取蜱的組織DNA。

1.4 PCR引物的合成 根據(jù)蜱的16S rDNA基因，參照文獻(xiàn)[7]設(shè)計(jì)蜱種屬鑒定的引物；根據(jù)梨形蟲18S rRNA基因，參照文獻(xiàn)[10-11]設(shè)計(jì)梨形蟲鑒定的通用引物；根據(jù)立克次氏體OmpA基因，參照文獻(xiàn)[12-13]設(shè)計(jì)立克次氏體鑒定的引物。所有引物均由北京六合華大基因科技有限公司合成，引物信息見表1。

表1 蜱種屬及無形體、梨形蟲和立克次氏體檢測引物Table 1 Primers for identification of tick species, Anaplasma spp., Piroplasma spp.and Rickettsia spp.

1.5 蜱蟲的分子鑒定 對(duì)經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定為長角血蜱的蜱蟲使用引物16S rDNA-F和16S rDNA-R對(duì)其16S rDNA基因進(jìn)行擴(kuò)增，采用50 μL的反應(yīng)體系:2×TaqDNA 聚合酶25 μL，16S rDNA-F和16S rDNA-R各1 μL(10 μmol/L)，DNA 3 μL，補(bǔ)足水至50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃，5 min;94 ℃預(yù)變性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，然后使用凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果，將符合目的條帶大小的PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后送北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測序。

1.6 立克次氏體、梨形蟲和無形體的分子鑒定 首先使用引物Piro1-S和Piro3-AS進(jìn)行第1輪PCR反應(yīng)，采用15 μL的反應(yīng)體系:2×TaqDNA 聚合酶7.5 μL，Piro1-S和Piro3-AS各0.5 μL(10 μmol/L)，DNA 3 μL，加水補(bǔ)足15 μL。反應(yīng)條件：94 ℃，5 min;94 ℃預(yù)變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min；待第1輪反應(yīng)結(jié)束后，以第1輪的PCR產(chǎn)物為模版，使用引物PIRO-A1P和PIRO-B進(jìn)行第2輪PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同1.5，退火溫度為55 ℃，對(duì)梨形蟲進(jìn)行檢測。無形體使用引物EHR16SD和16S rDNA-R，立克次氏體使用引物Rr190.70和Rr190.701，按照表1的反應(yīng)條件進(jìn)行PCR，電泳及測序同1.5。

1.7 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 將測序得到的結(jié)果使用BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)與NCBI數(shù)據(jù)庫中的蜱蟲、梨形蟲以及立克次氏體序列進(jìn)行同源性比對(duì)，然后利用軟件MEGA 7.0中的Neighbour-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，采用Bootstrap分析，繪圖重復(fù)參數(shù)為1 000，分析遺傳進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 蜱蟲的形態(tài)學(xué)鑒定 從體型上可以看出該蜱為小型蜱，體色單一，有緣垛，假頭基為四方形，呈矩形，第2節(jié)須肢向外伸展形成角突，無眼，盾板有色斑且分布均勻，基節(jié)Ⅱ～Ⅳ內(nèi)距稍大，口下板齒式為 5/5，氣孔板近似圓形，符合長角血蜱的特征。

2.2 蜱的分子鑒定 經(jīng)PCR擴(kuò)增和電泳鑒定后得到與蜱蟲線粒體16S rDNA基因相符的約455 bp的目的片段，與預(yù)期大小相符(圖1)。經(jīng)BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)本試驗(yàn)鑒定的長角血蜱與河北(KJ710068)鑒定的長角血蜱的相似性最高，為99.74%，與江西(MG696723)的相似性最低，為98.30%，與河南(KX450305)和北京(KC203357)的相似性為99.48%，與湖北的相似性為98.43%。

圖1 蜱16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR detection of tick 16S rRNA geneM：DL-2 000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1～12：樣品M:DL-2 000 DNA marker; 1-12:Sample

2.3 無形體、立克次氏體及梨形蟲的檢測 經(jīng)PCR擴(kuò)增和電泳鑒定，所有樣本的無形體檢測均為陰性，有8個(gè)梨形蟲樣品的目的片段與梨形蟲18S rRNA基因的大小相同，約430 bp(圖2),陽性率為29.63%；得到的立克次氏體的目的片段有21個(gè)和OmpA基因的片段大小相符，陽性率為77.78%(圖3)。經(jīng)BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)本試驗(yàn)分離得到的梨形蟲均為綿羊泰勒蟲，立克次氏體為未定種。其中，綿羊泰勒蟲與突尼斯(KM92442)在綿羊血液中檢測到的相似度最高，為99.48%，與新疆(FJ603460)、伊朗(KX273858)和土耳其(KU714608)在綿羊中分離的相似率為98.98%。

圖2 梨形蟲18S rRNA基因的PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR detection of Piroplasma 18S rRNA geneM：DL-2 000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1～12：樣品M:DL-2 000 DNA marker; 1-12:Sample

圖3 立克次氏體OmpA基因的PCR擴(kuò)增Fig.3 PCR detection of Rickettsia OmpA geneM：DL-2 000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1～12：樣品M:DL-2 000 DNA marker; 1-12:Sample

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化分析 基于蜱蟲的16S rDNA基因和綿羊泰勒蟲的18S rRNA基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)其與其他的長角血蜱聚集在同一分支，種群的遺傳距離非常近(圖4)，說明本試驗(yàn)所收集的蜱確為長角血蜱。根據(jù)綿羊泰勒蟲的18S rRNA基因部分核苷酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)此次檢測到的泰勒蟲為綿羊泰勒蟲(圖5)。根據(jù)立克次氏體的OmpA基因部分核苷酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，得到如圖6所示的系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)分離到的立克次氏體和CandidatusRickettsiajingxinensis聚集在同一分支，說明此次分離到的立克次氏體為jingxinensis立克次氏體候選種(Ca.R.jingxinensis)。

圖4 長角血蜱16S rDNA基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of H.longicornis 16S rDNA gene ▲:本試驗(yàn)獲得的長角血蜱序列▲:Sequence of H.longicornis obtained in this study

圖5 基于綿羊泰勒蟲18S rRNA基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of T.ovis 18S rRNA gene▲:本試驗(yàn)獲得的T.ovis序列▲:Sequence of T.ovis obtained in this study

3 討論

本試驗(yàn)從北京市郊區(qū)獲得的蜱為長角血蜱(H.longicornis)，在其體內(nèi)檢測出綿羊泰勒蟲(T.ovis)和jingxinensis立克次氏體候選種共2種蜱傳病原體，無形體在所有的樣品中均未檢出。從進(jìn)化樹中可以看到我國不同省份的長角血蜱的種群的遺傳距離非常近，這與Jia等[2]的研究結(jié)果較為符合，說明長角血蜱的選擇是為了分散，從而占據(jù)不同的生態(tài)系統(tǒng)，而不是為了地方競爭力。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，更多的立克次氏體不斷被人們所發(fā)現(xiàn)，其中有些甚至可以引起人類感染。在20世紀(jì)30年代，俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)有人感染立克次氏體西伯利亞亞種(Rickettsiasibiricasubsp)[14]，這是關(guān)于其最早的描述。自此，斑點(diǎn)熱群(SFG)立克次體病陸續(xù)在俄國、中國和哈薩克斯坦被發(fā)現(xiàn)[15-16]。BJ-90是R.sibirica的亞種，1990年首次從我國的中華革蜱(Dermacentorsinicus)中分離出來，并于2013年和2016年分別在哈爾濱和北京的患者體內(nèi)被分離出來，感染原因則是因?yàn)楸或缦x叮咬[17]。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的Ca.R.jingxinensis為近年來發(fā)現(xiàn)的新種，目前已在多種蜱中被檢出，有報(bào)道顯示在人類中發(fā)現(xiàn)了一種屬于Ca.R.jingxinensis的變種[18]。因此，盡管目前尚未證實(shí)其致病性，但仍應(yīng)引起重視。T.ovis經(jīng)常在蜱和小反芻動(dòng)物中被檢測到，其在綿羊體內(nèi)感染率可以達(dá)到78%[19]。此外，在牦牛和藏羊中也有T.ovis感染的報(bào)道[20]。本試驗(yàn)是首次在北京地區(qū)的長角血蜱中檢出T.ovis。泰勒蟲病是一種由泰勒蟲感染引起的重要的家畜傳染病，在我國有20多個(gè)省市都有關(guān)于泰勒蟲感染的報(bào)道[21]。除T.ovis外，T.luwenshuni和T.uilenbergi等多種泰勒蟲都曾在山羊和綿羊中被報(bào)道[22]。另外，值得注意的是，雖然本試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)無形體的感染，但鑒于此前曾在北京的H.longicornis中檢測出A.capra，此外，Anaplasmaovis和Anaplasmaphagocytophilum等無形體也都可以引起人類 感 染。如2009年的一項(xiàng)血清學(xué)調(diào)查顯示，我國A.phagocytophilum的感染率為15.4%，其中農(nóng)民受到感染的風(fēng)險(xiǎn)大大增加，然而，即使在城市居民中，也存在感染A.phagocytophilum的風(fēng)險(xiǎn)[23]。

圖6 基于立克次氏體OmpA基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree of Rickettsia OmpA gene ▲:本試驗(yàn)獲得的立克次氏體序列▲:Sequence of Rickettsia obtained in this study

北京作為我國的首都，城區(qū)人口眾多，郊區(qū)成為人們平時(shí)娛樂休閑的主要旅游去處。而郊區(qū)自然環(huán)境復(fù)雜，生態(tài)多樣，這也增加了人們暴露的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)而有被蜱蟲叮咬的危險(xiǎn)，從而感染蜱傳病。因此，應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)北京周邊地區(qū)蜱的種類多樣性及其攜帶病原體的流行病學(xué)調(diào)查，有關(guān)部門應(yīng)該加強(qiáng)主動(dòng)監(jiān)測，防止人和動(dòng)物被蜱叮咬而感染。