Src激酶抑制劑PP2對(duì)癲癇持續(xù)狀態(tài)性大鼠腦水腫形成及ERK1/2和P38信號(hào)通路的影響

楊子茵,李 寧,黃 軍,李佳宇,高安亮

(成都醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院核工業(yè)四一六醫(yī)院神經(jīng)外科,成都 610051;*通訊作者,E-mail:3034240438@qq.com)

癲癇(epilepsy,EP)是一種臨床常見(jiàn)神經(jīng)系統(tǒng)綜合征,大腦皮層神經(jīng)元神經(jīng)過(guò)度興奮以及神經(jīng)元突發(fā)性生物電信號(hào)導(dǎo)致癲癇發(fā)作,持續(xù)發(fā)作時(shí)可導(dǎo)致腦水腫,短暫性損傷大腦功能,并引發(fā)患者焦慮、抑郁等心理疾病,其病情進(jìn)展緩慢,但可反復(fù)發(fā)作、難以治愈,嚴(yán)重威脅患者身心健康,給其家庭和社會(huì)造成沉重負(fù)擔(dān)[1,2]。腦室內(nèi)出血、腦卒中、缺氧缺血等是EP的主要致病因素[3],酪氨酸激酶Src可通過(guò)調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞磷酸酶、張力素同源蛋白的表達(dá)及核因子NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性、核轉(zhuǎn)運(yùn)參與介導(dǎo)神經(jīng)元的發(fā)生發(fā)展[4,5],抑制Src磷酸化激活可改善癲癇模型大鼠臨床癥狀,減輕腦水腫。研究發(fā)現(xiàn),抑制ERK1/2磷酸化可減輕實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠脊髓炎癥及體內(nèi)外神經(jīng)炎癥,降低腦缺血再灌注大鼠腦水腫程度,改善神經(jīng)功能[6-8];EP患者肺組織P38蛋白的磷酸化水平升高,導(dǎo)致神經(jīng)源性肺水腫[9],這些發(fā)現(xiàn)提示ERK1/2和P38信號(hào)可能與癲癇誘導(dǎo)的腦水腫有關(guān),但Src激酶抑制劑PP2是否可影響癲癇持續(xù)狀態(tài)性大鼠腦水腫形成及ERK1/2和P38信號(hào)通路,目前并不清楚,本文通過(guò)建立癲癇大鼠模型,對(duì)此進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,許可證號(hào):SC-XK(滬)20082-005,質(zhì)量合格證號(hào):2015000504404,SPF級(jí),體質(zhì)量200-240 g。飼養(yǎng)條件:大鼠自由飲食、飲水,溫度25 ℃,明12 h/暗12 h,相對(duì)濕度50%,環(huán)境整潔、安靜且通風(fēng)良好。

1.2 材料與儀器

Src激酶抑制劑PP2(貨號(hào)為L(zhǎng)M234),上海聯(lián)邁生物工程有限公司;丙戊酸鈉口服溶液(國(guó)藥準(zhǔn)字H20041435),賽諾菲(杭州)制藥有限公司;戊四氮(貨號(hào)為P6500),上海赫果生物科技有限公司;氯化鋰(貨號(hào)為S24112),上海源葉生物科技有限公司;大鼠TNF-α(ab100785)及IL-6 ELISA試劑盒(ab100772)、兔源ERK1/2(ab17942)、p-ERK1/2(ab223500)、P38(ab170099)、p-P38(ab4822)及GAPDH一抗(ab181602)、羊抗兔二抗(ab150077),美國(guó)Abcam公司;RIPA裂解液(P0013K)、BCA試劑盒(P0011)、HE染色試劑盒(C0105),上海碧云天公司。輪轉(zhuǎn)切片機(jī)、包埋機(jī)、烤片機(jī)(型號(hào)分別為RM2035、EG1160、HI1220),德國(guó)Leica公司;倒置顯微鏡(型號(hào)為1X70),日本Olympus公司;低溫高速離心機(jī)(型號(hào):Centrifuge 5424R),德國(guó)Eppendorf股份公司;酶標(biāo)儀(型號(hào):XElx800),Perkin Elmer公司;蛋白電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀(型號(hào)分別為1659001、Trans-Blot SD),美國(guó)Bio-Rad公司;凝膠成像系統(tǒng)(型號(hào)為2500),上海天能公司。EEG-4418K型腦電圖儀(NIHON KONDEN公司);立體定位儀(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物模型制備及分組給藥 參照文獻(xiàn)[10]制備EP大鼠模型,SD大鼠腹腔注射127 mg/kg的氯化鋰,間隔24 h后,腹腔注射35 mg/kg的戊四氮,于30 min后觀察大鼠行為,當(dāng)其出現(xiàn)面肌抽動(dòng)、肢體陣攣、跌倒等癥狀時(shí),參照Racine分級(jí)[11]評(píng)定癲癇發(fā)作級(jí)別,標(biāo)準(zhǔn)如下:Ⅰ級(jí)為面部陣攣;Ⅱ級(jí)為頸部肌肉痙攣,甩尾或節(jié)律性點(diǎn)頭;Ⅲ級(jí)為單側(cè)前肢抽搐;Ⅳ級(jí)為雙前肢抽搐;Ⅴ級(jí)為四肢抽搐、跳躍、失去平衡或跌倒等。建模大鼠持續(xù)出現(xiàn)Ⅳ級(jí)以上癲癇發(fā)作表現(xiàn),表明建模成功,建模63只,成功60只,將其隨機(jī)分為模型組、PP2低劑量(1 nmol)組、PP2中劑量(2.5 nmol)組、PP2高劑量(5 nmol)組、丙戊酸鈉組,每組12只,另取12只SD大鼠腹腔注射等劑量無(wú)菌生理鹽水,設(shè)為對(duì)照組。

參照文獻(xiàn)[12],在模型制備成功后,腹腔注射300 mg/kg的10%水合氯醛麻醉大鼠,將其頭部固定在立體定位儀上,顱頂備皮后消毒,切開(kāi)皮膚,使用3%雙氧水擦拭骨膜使前囟點(diǎn)清晰暴露,于前囟后0.8 mm,矢狀縫右側(cè)1.5 mm處用針頭鉆一小孔,鉆透顱骨但不傷及大腦,小心插入一個(gè)帶微量進(jìn)樣針的套管,深度為1 mm,然后縫合皮膚后消毒。將Src激酶抑制劑PP2溶于DMSO中配制為0.2,0.5,1 nmol/μl的溶液,PP2各劑量組大鼠每天均以微量進(jìn)樣針緩慢注射5 μl,使最終劑量為:PP2低劑量組1 nmol、PP2中劑量組2.5 nmol、PP2高劑量組5 nmol,丙戊酸鈉組大鼠給予5 mg/kg丙戊酸鈉[13]灌胃治療,假手術(shù)組及模型組大鼠每天以同樣方法緩慢注射5 μl DMSO,并以等劑量生理鹽水灌胃,持續(xù)3 d。期間青霉素抗感染處理。

1.3.2 檢測(cè)大鼠癲癇發(fā)作情況 用藥結(jié)束24 h后,腦電波(electroencephalogram,EEG)采用腦電圖儀記錄,紙速30 mm/s、時(shí)間0.1 s、頻率35 Hz、增益10 μV/mm,連續(xù)描記5 min。觀察各組大鼠活動(dòng)情況,記錄其一天之中癲癇發(fā)作次數(shù)及其持續(xù)時(shí)間。

1.3.3 檢測(cè)大鼠腦水腫情況及標(biāo)本收集 大鼠癲癇發(fā)作情況檢測(cè)結(jié)束后,尾靜脈取血1.5 ml,靜置后離心收集上清,即可得到血清,將其儲(chǔ)存于-80 ℃?zhèn)溆?將各組大鼠麻醉后處死,解剖取出大腦,各組隨機(jī)選取6只大鼠的整個(gè)大腦稱重,即為濕重,將其置于烤箱中烤干,稱重即可得干重,計(jì)算腦組織含水量即可檢測(cè)腦水腫情況,公式為:腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。各組剩余6只大鼠的大腦以PBS沖洗干凈后,剪取約0.5 g,剪碎后加入蛋白裂解液,以勻漿機(jī)制備為勻漿液,離心收集上清,即可得總蛋白樣品液,剩余組織以PBS漂洗干凈后置于4%多聚甲醛中固定,再以80%,90%,100%濃度的酒精依次脫水、二甲苯透明、石蠟包埋,最后使用切片機(jī)做病理切片備用。

1.3.4 檢測(cè)大鼠皮層神經(jīng)元病理變化 選取1.3.3中病理切片完整且含有皮質(zhì)區(qū)組織,脫蠟后,以100%,90%,80%濃度的酒精依次浸泡后,經(jīng)蒸餾水漂洗后,以HE試劑盒進(jìn)行染色,具體參照說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行,經(jīng)再次脫水、透明后封片,置于顯微鏡下觀察大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元病理變化,任選5個(gè)視野拍照。

1.3.5 測(cè)定大鼠腦皮質(zhì)區(qū)ERK1/2和P38通路相關(guān)蛋白表達(dá) 將1.3.3中凍存的蛋白樣品液置于4 ℃冰箱中凍融,以BCA試劑盒測(cè)定其濃度,參照說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行操作,各組取含20 μg總蛋白的樣品液進(jìn)行電泳,使蛋白分離,然后將其轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上,以5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后,根據(jù)目的蛋白分子量截取條帶置于小盒中,經(jīng)兔源ERK1/2、p-ERK1/2、P38、p-P38及GAPDH一抗(稀釋比分別為1 ∶2 000、1 ∶5 000、1 ∶2 000、1 ∶2 500、1 ∶1 000)于4 ℃條件下孵育過(guò)夜后,以TBST漂洗3次,加入羊抗兔二抗(稀釋比為1 ∶2 000),置于搖床上,室溫孵育2 h,以TBST再次漂洗3次,采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色,以凝膠成像儀對(duì)蛋白條帶進(jìn)行拍照,然后以Image Lab軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析,得出各組蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 PP2對(duì)大鼠癲癇發(fā)作的影響

對(duì)照組大鼠皮層區(qū)以基礎(chǔ)波α、β波為主,無(wú)明顯節(jié)律性;模型組大鼠出現(xiàn)散在性癇波,多為尖波、棘波、棘慢復(fù)合波,大量癇性放電;PP2低、中、高劑量組、丙戊酸鈉組均可見(jiàn)到散在的尖波、棘波,而以PP2高劑量組出現(xiàn)的最少(見(jiàn)圖1)。與對(duì)照組相比,模型組大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)、持續(xù)時(shí)間升高(P<0.05);與模型組相比,PP2低、中、高劑量組、丙戊酸鈉組大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)、持續(xù)時(shí)間降低,且PP2三組之間呈劑量依賴性變化(P<0.05),PP2高劑量組與丙戊酸鈉組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)表1)。

圖1 各組大鼠腦皮層區(qū)EEG情況

表1 各組大鼠發(fā)作次數(shù)、持續(xù)時(shí)間

2.2 PP2對(duì)大鼠腦水腫的影響

與對(duì)照組相比,模型組大鼠腦組織含水量升高(P<0.05);與模型組相比,PP2低、中、高劑量組、丙戊酸鈉組大鼠腦組織含水量降低且在不同PP2組間呈劑量依賴性(P<0.05),而PP2高劑量組與丙戊酸鈉組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)圖2)。

與對(duì)照組相比,aP<0.05;與模型組相比,bP<0.05;與PP2低劑量組相比,cP<0.05;與PP2中劑量組相比,dP<0.05

2.3 PP2對(duì)大鼠神經(jīng)元的影響

對(duì)照組大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,排列規(guī)律,細(xì)胞膜及細(xì)胞核完整、清晰,數(shù)量較多;模型組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,變小皺縮,排列紊亂,細(xì)胞膜及細(xì)胞核不清晰,細(xì)胞較多凋亡,數(shù)量減少,出現(xiàn)病理?yè)p傷;與模型組相比,PP2低、中、高劑量組、丙戊酸鈉組大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞病理?yè)p傷減輕,且隨劑量升高減輕程度呈依賴性增強(qiáng),PP2高劑量組與丙戊酸鈉組大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞病理?yè)p傷減輕程度相似(見(jiàn)圖3)。

A.對(duì)照組;B.模型組;C.PP2低劑量組;D.PP2中劑量組;E.PP2高劑量組;F.丙戊酸鈉組

2.4 PP2對(duì)大鼠ERK1/2和P38信號(hào)通路的影響

與對(duì)照組相比,模型組大鼠腦皮層區(qū)p-ERK1/2/ERK1/2、p-P38/P38升高(P<0.05);與模型組相比,PP2低、中、高劑量組和丙戊酸鈉組大鼠腦皮層區(qū)p-ERK1/2/ERK1/2、p-P38/P38降低,且在PP2三組之間降低呈劑量依賴性(P<0.05),PP2高劑量組與丙戊酸鈉組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)圖4)。

與對(duì)照組相比,aP<0.05;與模型組相比,bP<0.05;與PP2低劑量組相比,cP<0.05;與PP2中劑量組相比,dP<0.05

3 討論

EP患者癲癇發(fā)作時(shí),咳嗽反射減弱或消失,造成支氣管痙攣,引起呼吸衰竭,進(jìn)而引起腦組織缺血缺氧,使星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞活化,破壞血腦屏障,導(dǎo)致腦水腫,嚴(yán)重時(shí)甚至可危及生命,目前其病死率高達(dá)2%,找到安全有效的治療藥物具有重要的社會(huì)及臨床意義[14-16]。本文對(duì)SD大鼠進(jìn)行腹腔注射氯化鋰及戊四氮建立EP模型,結(jié)果顯示,建模大鼠出現(xiàn)散在性癇波,多為尖波、棘波、棘慢復(fù)合波,大量癇性放電,皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,變小皺縮,排列紊亂,細(xì)胞膜及細(xì)胞核不清晰,細(xì)胞較多凋亡,數(shù)量減少,出現(xiàn)嚴(yán)重病理?yè)p傷,癲癇發(fā)作次數(shù)及持續(xù)時(shí)間、腦組織含水量增加,表明腹腔注射氯化鋰及戊四氮可使大鼠出現(xiàn)大量癇性放電,同時(shí)皮質(zhì)神經(jīng)元損傷嚴(yán)重,造成腦水腫,模型建立成功。

Src作為一種酪氨酸蛋白激酶,是激活受體并向胞內(nèi)傳遞信號(hào)的核心蛋白激酶,廣泛參與腦組織中神經(jīng)元的突觸可塑性、神經(jīng)元的增殖、凋亡等生理過(guò)程,在神經(jīng)炎癥的發(fā)生發(fā)展中起到重要的調(diào)控作用,激活Src可上調(diào)巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α表達(dá),進(jìn)而促使神經(jīng)炎癥發(fā)生及進(jìn)展[17],通過(guò)抑制Src磷酸化激活可降低其下游ERK1/2及P38蛋白磷酸化水平來(lái)抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化[18];P38信號(hào)參與癲癇大鼠導(dǎo)致心臟損傷病理過(guò)程,上調(diào)其磷酸化水平可促使Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白表達(dá),加重大鼠心肌細(xì)胞疾病發(fā)生與發(fā)展[19],ERK1/2及P38信號(hào)與神經(jīng)元關(guān)系密切,可能參與與腦水腫過(guò)程。本研究結(jié)果顯示,以Src激酶抑制劑PP2處理模型大鼠,可減輕皮質(zhì)神經(jīng)元病理?yè)p傷,降低癲癇發(fā)作次數(shù)及持續(xù)時(shí)間、腦組織含水量、腦組織p-ERK1/2/ERK1/2、p-P38/P38且PP2三組之間變化呈劑量依賴性,表明PP2可降低EP大鼠腦組織ERK1/2及P38磷酸化水平,可減輕癲癇發(fā)作,緩解腦水腫,保護(hù)神經(jīng)功能,改善其臨床癥狀,揭示抑制ERK1/2和P38信號(hào)激活可能是Src激酶抑制劑PP2緩解癲癇持續(xù)狀態(tài)性大鼠腦水腫的作用機(jī)制。

綜上所述,Src激酶抑制劑PP2可能是通過(guò)抑制ERK1/2和P38信號(hào)磷酸化激活緩解腦水腫進(jìn)而緩解癲癇,改善EP大鼠臨床癥狀,但本文未使用ERK1/2、P38信號(hào)通路激動(dòng)劑及抑制劑進(jìn)行對(duì)照驗(yàn)證,關(guān)于其藥理機(jī)制的證據(jù)并不充分,還需后續(xù)的深入研究。