提高PEDV疫苗免疫效果的關(guān)鍵點分析

李少麗，胡曉鳳，康 斌，王家福，尹忠良

（杭州佑本動物疫苗有限公司，浙江杭州 310018）

1 豬流行性腹瀉概述

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）是一種由冠狀病毒科的豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的高度接觸性腸道傳染病，主要特征為豬嘔吐、水樣腹瀉、脫水，哺乳仔豬病死率可高達80%～100%。PED是目前導(dǎo)致哺乳仔豬發(fā)生腹瀉最主要的疫病，可對全球的養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[1]。PEDV可通過母乳、糞-口途徑、污染的飼料、器具及氣溶膠傳播，防控難度較大[2]。

PEDV由約28 kb的單鏈正義RNA基因組構(gòu)成，其中包括編碼纖突糖蛋白（S）、囊膜蛋白（E）、N-糖基化膜蛋白（M）和核衣殼蛋白（N）等4個結(jié)構(gòu)蛋白。S蛋白含1 383個氨 基 酸，約180～220 kDa，分 為S1（1～726 aa）和S2（727～1 386 aa）兩個亞基（以CV777為例）。S1亞基含受體結(jié)合域，可促進病毒與受體的結(jié)合；S2亞基負責(zé)病毒與細胞膜的融合，S蛋白在介導(dǎo)病毒感染宿主產(chǎn)生中和抗體過程中發(fā)揮重要作用[3]。全基因組序列進化樹分析顯示，PEDV可分為2類：包括2010年以前出現(xiàn)的經(jīng)典毒株（G1群）以及目前主要流行變異毒株（G2群）；兩個群又可分為兩個亞類：1a和1b、2a和2b，不同基因型以及亞型之間的交叉保護存在差異[4]。

1971年，英國首次報道了豬群中發(fā)生PED疫情[5]，但未分離到PEDV。1978年，研究證實PEDV CV777株是引起PED發(fā)生的主要原因[6]。1970—1980年間，PED在歐洲廣泛流行，哺乳仔豬損失慘重[7]。1973年，我國上海發(fā)生PED疫情[8]。1994年，PEDV CV777毒株滅活和減毒活疫苗上市。1999年以來，我國豬群廣泛應(yīng)用PED、豬傳染性胃腸炎二聯(lián)滅活疫苗及減毒活疫苗防控豬的腹瀉，直至2010年，我國豬場PED多呈散發(fā)，無大規(guī)模暴發(fā)的報道。

2010年冬季，我國南方超過10個省份的豬場暴發(fā)了PED，造成100萬頭以上仔豬死亡，病死率80%～100%，即使接種了豬流行性腹瀉（CV777）、豬傳染性胃腸炎二聯(lián)滅活疫苗的仔豬病死率也高達50%～100%，對養(yǎng)豬業(yè)造成一定的打擊[8]。Sun等[9]對2010—2011年在中國大規(guī)模暴發(fā)PED豬場的177份病料樣本進行RT-PCR檢測，結(jié)果顯示，共有125份樣本呈PEDV陽性，陽性率70.6%；S基因的遺傳進化分析結(jié)果顯示，所檢測PEDV S基因同源性為99.1%～100.0%，與CV777疫苗株同源性94.5%～95.1%，且在S蛋白區(qū)域有9個氨基酸突變。Li等[10]對我國不同省份的數(shù)十個豬場進行PEDV病原監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，2010年以后流行的PEDV與經(jīng)典CV777毒株的S基因相似性為93%，主要流行變異PEDV毒株的S基因發(fā)生突變。目前，G2群成為國內(nèi)外豬場PEDV的主要流行毒株[11-13]。

根據(jù)免疫豬群的發(fā)病以及PEDV S基因的變異，推斷PEDV疫苗毒株無法對流行毒株產(chǎn)生完全的免疫保護。雖然防控疫情不應(yīng)只靠疫苗，但免疫疫苗能夠提升豬群群體抵御野毒攻擊水平，大幅降低因管理漏洞而造成發(fā)病的概率。因此，開發(fā)與流行毒株基因同源性更高的疫苗仍是防控腹瀉的重要途徑。

2 提高PEDV疫苗免疫效力的關(guān)鍵點

PED常與豬傳染性胃腸炎、豬輪狀病毒混合感染。我國商品化的PED疫苗主要是聯(lián)苗，如豬流行性腹瀉（CV777或PEDV流行毒株）、豬傳染性胃腸炎二聯(lián)活疫苗和滅活疫苗以及豬流行性腹瀉（CV777）、豬傳染性胃腸炎、豬輪狀病毒三聯(lián)活疫苗。國外則以PED單苗為主，如日本的減毒活疫苗（83P-5株）、韓國的SM98-1株減毒活疫苗或滅活疫苗、適于口服的DR13株減毒活疫苗[14-16]，還有美國使用甲病毒RNA復(fù)制子制備的PED核酸疫苗及碩騰的PED全病毒滅活疫苗等[17]。

以PEDV滅活疫苗單苗為例，生產(chǎn)疫苗時，首先應(yīng)篩選出免疫原性強且安全性好的疫苗毒株，將篩選的疫苗毒株按照一定比例接種適宜的細胞，經(jīng)轉(zhuǎn)瓶或生物反應(yīng)器等批量培養(yǎng)，收獲細胞培養(yǎng)物，經(jīng)滅活處理與佐劑按一定比例混合乳化制成。

2.1 選擇與PEDV流行毒株交叉保護能力強的疫苗毒株

疫苗毒株的選擇是影響疫苗免疫效果最主要的因素。通常在發(fā)生病毒性傳染病時，應(yīng)優(yōu)先選擇針對流行毒株的疫苗；PED疫苗也不例外，交叉保護能力是疫苗毒株選擇的首要標準。

不同基因型及亞型PEDV毒株之間的交叉免疫保護效果不同，PEDV G1型毒株疫苗對G2型毒株的攻擊無法或僅能夠產(chǎn)生部分免疫保護。Sato等[18]采用G1型PEDV活疫苗（P-5V株）免疫妊娠母豬，其所產(chǎn)仔豬采用G2型PEDV攻毒，仔豬存活率為80%，而不免疫對照組母豬所產(chǎn)仔豬存活率為0。也有研究表明，G1a型疫苗（CV777和DR13）對G2b型YC2014的免疫保護為0[19]。與CV777等G1型毒株相比，G2型變異毒株制備的疫苗可能具有更好的交叉保護能力。Zhang等[20]采用G1a型（CV777）和G2a型（CH/JX/01）PED滅活疫苗分別免疫母豬2次，對其所產(chǎn)仔豬分別以G1型的CV777和CH/JX/01攻擊；結(jié)果顯示，G2a型滅活疫苗可對同源和異源PEDV的攻擊提供堅強的免疫保護，而G1a型滅活疫苗僅能夠?qū)ν炊局闏V777誘導(dǎo)良好的免疫保護，對異源G2a PEDV CH/JX/01毒株的攻擊只提供部分保護。

Liu等[21]對分離的PEDV G2a和G2b毒株制備疫苗進行了交叉免疫保護試驗，根據(jù)攻毒仔豬的臨床癥狀和糞便排毒進行判定是否保護；結(jié)果顯示，G2a型滅活疫苗對所有仔豬的同源G2a型毒株CH HBXT/2018-P4和異源G2b CH HNPJ/2017-P4病毒攻擊均可起到保護作用，G2b株滅活疫苗對相應(yīng)同源和異源病毒攻擊保護率分別為50%（2/4）和25%（1/4），表明G2a型PED滅活疫苗的交叉免疫能力更強。Tanja等[22]采用PEDV強毒（G2b）對7個月前感染PEDV弱毒（G1b）的母豬所產(chǎn)3日齡仔豬攻毒，結(jié)果顯示，仔豬存活率100%，而早期未感染母豬所產(chǎn)仔豬的存活率只有67%。因此，不同地區(qū)豬場應(yīng)根據(jù)當(dāng)?shù)亓餍械腜EDV情況選擇交叉免疫保護性強的毒株制備疫苗。

2.2 提高PED疫苗中的抗原含量

疫苗中的抗原含量也是影響疫苗免疫效果的關(guān)鍵因素。Collin等[23]采用熒光聚焦中和試驗和ELISA方法檢測采用不同PEDV抗原含量疫苗兩次免疫的試驗豬所產(chǎn)生的抗體水平，結(jié)果顯示，108TCID50/mL組抗體水平均明顯高于106TCID50/mL組。而在疫苗中抗原含量一定的情況下，增加接種劑量也可提高疫苗的有效性。Arriba等[24]對11日齡試驗豬分別口服低、高劑量的CV777活疫苗，并于免疫21 d后采用PEDV強毒攻擊；結(jié)果顯示，50%的高劑量接種試驗組豬未檢出病毒，而低劑量組只有25%的試驗豬無法檢出病毒。

目前，通常將PEDV按一定比例接種于長滿良好單層的Vero細胞，加入含2～20μg/mL胰酶的DMEM維持液培養(yǎng)以提高疫苗抗原含量。1988年，Hofmann等[25]在Vero細胞的培養(yǎng)液中加入胰酶，成功復(fù)制出PEDV。胰酶在促進PEDV進入細胞和釋放出細胞過程中的重要作用得到證實，胰酶能夠使Vero細胞培養(yǎng)液中PEDV的病毒量比不加胰酶時提高100～1 000倍[26]。在Vero細胞培養(yǎng)液中添加胰酶或胰酶替代物已成為PEDV細胞培養(yǎng)的通用方法。然而，胰酶對于一些高度適應(yīng)細胞生長的PEDV的繁殖并非必需，不添加胰酶時，PEDV的感染效率反而可能提高至108TCID50/mL[27-28]。

2.3 控制PEDV疫苗種毒傳代次數(shù)

隨著PED疫苗種毒體外傳代次數(shù)增加，其對細胞的適應(yīng)能力增強，但對豬腸道細胞的感染能力降低。有研究使用親代與經(jīng)Vero細胞培養(yǎng)至第93代的PEDV（DR13株）制備的疫苗，間隔21 d兩次口服接種母豬，并采用10 mL 108.0TCID50/mL的PEDV攻擊接種F93代PEDV疫苗的母豬所產(chǎn)的4頭仔豬；結(jié)果顯示，仔豬僅表現(xiàn)一過性厭食和輕微腹瀉癥狀并于2～3 d內(nèi)恢復(fù)正常，而親代PEDV免疫豬則在攻毒后2～3 d出現(xiàn)典型的腹瀉癥狀，病死率可達10%～100%，表明PEDV分離株經(jīng)多次細胞傳代后對豬的感染力降低[29-30]。Chen等[31]給試驗豬口服接種YN15（傳代15次）或YN144（傳代144次）的YN1毒株，結(jié)果顯示，所有感染YN15的仔豬均死于嚴重腹瀉，而YN144幾乎沒有感染豬的腸上皮細胞且接種仔豬未出現(xiàn)肉眼可見病變，推斷當(dāng)PEDV體外適應(yīng)Vero細胞培養(yǎng)后，其在豬腸上皮細胞中感染和復(fù)制的效率降低?？刂芇EDV的體外傳代次數(shù)是提高其體內(nèi)繁殖能力的保障。因此，生產(chǎn)PED活疫時應(yīng)控制疫苗種毒的傳代次數(shù)，維持疫苗中PEDV抗原含量與其在豬體內(nèi)繁殖能力的平衡。

2.4 制定合理的疫苗免疫程序

PEDV感染主要引起10日齡以內(nèi)仔豬死亡，對仔豬接種疫苗進行主動免疫難以在短時間內(nèi)形成有效保護，只能夠以疫苗免疫母豬群，母豬通過乳汁將分泌型免疫球蛋白A（sIgA）與免疫球蛋白G（IgG）抗體傳遞給仔豬，仔豬獲得被動保護。sIgA在保護動物免受PEDV感染方面比IgG或免疫球蛋白M（IgM）更有效，且感染仔豬血清中IgA的抗體水平與口服接種母豬乳汁中的IgA抗體水平呈正相關(guān)[22]。因此，提高仔豬血液或母豬乳汁中sIgA的抗體水平成為保障疫苗有效性的關(guān)鍵。

PED活疫苗口服免疫和自然感染（含人工感染）是刺激豬群黏膜免疫系統(tǒng)產(chǎn)生sIgA的重要途徑[23]。Song等[16]對PEDV陰性的妊娠母豬口服接種PEDV減毒活疫苗（DR13株）；結(jié)果顯示，與注射免疫相比，此種免疫方式可使哺乳仔豬的病死率降低47%。

在PED暴發(fā)期，豬場一般采用返飼的方法防控PEDV。返飼相當(dāng)于人工感染PEDV，即將發(fā)病12～24 h內(nèi)仔豬的腸組織和腸道內(nèi)容物研磨成勻漿，加入適量抗生素，按一定比例飼喂母豬，使母豬群快速建立整齊的免疫應(yīng)答，進而保護哺乳仔豬免受PEDV感染。與肌肉注射PED疫苗的母豬相比，返飼的母豬可表現(xiàn)出更高水平的sIgA抗體，同場一周內(nèi)即可快速控制疫情，給母豬注射高劑量且毒力更強的PEDV可提高其仔豬的存活率[32]。但返飼的病料是強毒，未經(jīng)滅活，可能含有豬偽狂犬病毒（PRV）、豬繁殖與呼吸綜合征（PRRSV）等其他強毒或致病菌，存在疫情暴發(fā)的風(fēng)險，故不提倡使用。

對于安全性好的PED滅活疫苗，雖通常不會引起陰性豬激發(fā)sIgA，但因感染PED的豬腸道免疫系統(tǒng)已被激活，再次免疫PED滅活疫苗或減毒活疫苗，不僅能夠再次激活sIgA，還能夠使sIgA的分泌產(chǎn)生放大效應(yīng)；并且PED滅活疫苗作為加強免疫的效果優(yōu)于減毒活疫苗，能夠刺激產(chǎn)生高水平的IgG及IgA抗體。因此，母豬兩次免疫PED滅活疫苗或?qū)ED滅活疫苗接種PEDV感染過的豬能夠產(chǎn)生很好的免疫效果。

綜上所述，利用PED活疫苗及滅活疫苗的免疫特點，制定合理的免疫程序，可使疫苗在防控疫情方面起到最大限度的保障作用。因各豬場PEDV感染狀態(tài)不同，其PEDV疫苗的免疫程序必定存在差異。對PED疫苗大致免疫程序為：后備母豬于配種前間隔30 d左右免疫2次；經(jīng)產(chǎn)母豬于產(chǎn)前40 d、產(chǎn)前20 d各免疫1次，免疫母豬所產(chǎn)仔豬于斷奶后7～10 d接種1次；疫病多發(fā)季節(jié)或緊急免疫時，全群種豬普免1～2次。

3 結(jié)論

PED是當(dāng)前除非洲豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征外，導(dǎo)致我國豬群發(fā)病最主要的一類動物疫病。2010年，變異PEDV使我國豬場暴發(fā)流行性腹瀉，接種CV777疫苗的豬場也未能幸免，經(jīng)典CV777疫苗已無法對變異PEDV毒株產(chǎn)生完全的免疫保護，開發(fā)基于PEDV流行毒株的疫苗成為研究熱點。

從疫苗的角度考慮，提高PEDV疫苗免疫效力存在以下關(guān)鍵點：選擇與PEDV流行毒株交叉保護能力強的疫苗毒株，G2型比經(jīng)典G1型PEDV毒株疫苗的交叉免疫保護效果要好；提高PED疫苗中的抗原含量，如PEDV細胞培養(yǎng)時加入一定濃度的胰酶，促進PEDV對細胞的感染和釋放；控制PEDV疫苗種毒傳代次數(shù)，在保證疫苗中含足夠抗原含量的同時，不影響PEDV在豬體內(nèi)的繁殖能力；充分利用PED活疫苗及滅活疫苗的特點，制定合理的免疫程序。對于已經(jīng)感染PEDV或免疫PED活疫苗的豬場，PED滅活疫苗作為加強免疫的效果要優(yōu)于減毒活疫苗，能夠刺激高水平的IgG及IgA抗體產(chǎn)生。

綜上所述，對于PED的防控除了要提高疫苗本身的免疫效力，還要做好飼養(yǎng)管理和生物安全，各方面工作應(yīng)更加規(guī)范、全面，提高母豬的生產(chǎn)性能，有效保障豬場生產(chǎn)效益的穩(wěn)定。