加拿大煙葉與云南KRK26煙葉香氣成分差異分析

帖金鑫,張青松,李永生,廖付,吳繼忠,白冰,楊靖,李石頭

1.浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 寧波卷煙廠,浙江 寧波 315504;2.浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 技術(shù)中心,浙江 杭州 310000;3.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 煙草科學(xué)與工程學(xué)院,河南 鄭州 450001

0 引言

位于加拿大最南部的安大略省,自然條件良好,氣候溫和、晝夜溫差大,降雨量、日照、土質(zhì)均適于煙草生長[1],其優(yōu)越的生態(tài)條件使得產(chǎn)自該地的煙葉具有明亮度高、香氣優(yōu)雅、勁頭適宜、工業(yè)可用性高等優(yōu)點,也稱為加拿大煙葉。但加拿大煙葉的產(chǎn)量較小,不能很好地滿足部分國產(chǎn)品牌卷煙配方和生產(chǎn)的需要,因此尋找和開發(fā)相似的國產(chǎn)煙葉替代加拿大煙葉,成為解決該問題的關(guān)鍵[2]。研究[3-5]發(fā)現(xiàn),煙葉香氣風(fēng)格和感官品質(zhì)與其化學(xué)成分的種類及含量密切相關(guān),通過比較加拿大煙葉與國內(nèi)優(yōu)質(zhì)煙葉香氣成分的差異,有助于揭示加拿大煙葉香氣風(fēng)格形成的內(nèi)在因素,為國產(chǎn)替代煙葉的確定提供理論依據(jù)。

代謝組學(xué)是一種識別和量化小分子代謝物的新型研究手段,它從整體角度出發(fā),運用現(xiàn)代檢測技術(shù)對食品、植物、生物樣品中盡可能多的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析檢測[6-10],通過主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)、正交偏最小二乘判別分析(Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis,OPLS-DA)等方法找出不同組別樣本的差異代謝物(差異成分),已在種類鑒別[11-14]、食品加工前后成分變化[15-16]、中藥產(chǎn)地溯源[17-18]、煙葉香型區(qū)分[19-20]等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。

云南KRK26煙葉為引進(jìn)津巴布韋煙葉[21],其與加拿大煙葉同屬優(yōu)質(zhì)煙葉,但二者香氣風(fēng)格存在差異。鑒于此,本文擬以加拿大煙葉和云南德宏KRK26煙葉為研究對象,借鑒代謝組學(xué)研究方法,采用二維氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)和多元統(tǒng)計分析方法,通過二者香氣成分的差異性分析,探討其風(fēng)格特征的不同成因,以期為煙葉原料的開發(fā)、應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐與參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

主要材料:加拿大煙葉C3F MK、津引云南德宏KRK26煙葉C3F,浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司。

主要儀器:8860-5977B型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國安捷倫公司;SSM 1810型固態(tài)熱調(diào)制器,雪景電子科技(上海)有限公司。

主要試劑:二氯甲烷(色譜純),天津市凱通公司;正己烷(色譜純),山東禹王公司;異丙醚(色譜純),東京化成株式會社;異丙醇(色譜純),德國默克公司;無水硫酸鈉、無水乙醇(均為分析純),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;2,6-二氯甲苯、硝基苯、反式-2-己烯酸(純度均大于99%),百靈威科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制準(zhǔn)確稱取2,6-二氯甲苯、硝基苯和反式-2-己烯酸,分別用二氯甲烷定容,配制成質(zhì)量濃度分別為0.556 7 mg/mL、0.548 7 mg/mL和0.827 3 mg/mL的中性、堿性和酸性內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 煙葉揮發(fā)性成分提取揮發(fā)性成分的提取方法參照文獻(xiàn)[22],并略有改進(jìn)。不同批次的加拿大煙葉和云南KRK26煙葉各抽取5份,粉碎后過40目篩,共10份樣品。稱取30.0 g煙末于1000 mL圓底燒瓶中,加入400 mL去離子水,另一側(cè)燒瓶加入100 mL二氯甲烷,同時蒸餾萃取2.5 h后,萃取液先用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%鹽酸水溶液(30 mL×3)洗滌,然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%氫氧化鈉水溶液(30 mL×3)洗滌,得到中性萃取液;鹽酸水溶液合并后,加氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至12,用二氯甲烷(30 mL×3)萃取,合并有機相得到堿性萃取液;氫氧化鈉水溶液合并后,加鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至2,用二氯甲烷(30 mL×3)萃取,合并有機相得到酸性萃取液。在中性、酸性、堿性萃取液中加入適量的無水Na2SO4,冷藏過夜后過濾,常壓濃縮至1 mL,進(jìn)行GC-MS分析,每個樣品重復(fù)3次,定量結(jié)果取平均值。

1.2.3 分析條件1)色譜條件。中性和堿性組分:進(jìn)樣量為1 μL,進(jìn)樣口溫度為280 ℃,分流比為10∶1;第一維色譜柱為DB-5 MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm),第二維色譜柱為DB-17 MS(1.2 m×0.18 mm×0.18 μm),載氣為氦氣,流量為1.2 mL/min;程序升溫起始溫度為100 ℃,保持2 min,以4 ℃/min的速率升溫到270 ℃,保持5 min。

酸性組分:進(jìn)樣量為1 μL,進(jìn)樣口溫度為280 ℃,分流比為10∶1;第一維色譜柱為DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm),第二維色譜柱為DB-17 MS(1.2 m×0.18 mm×0.18 μm),載氣為氦氣,流量為1.2 mL/min ;程序升溫起始溫度為40 ℃,保持2 min,以6 ℃/min升溫到250 ℃,保持5 min。

調(diào)制柱為HV調(diào)制柱(1.2 m×0.25 mm),調(diào)制周期為5 s,解析時間為1 s;N2補償氣為0.15 MPa,同步GC升溫程序,調(diào)制器進(jìn)口溫度比柱箱高30 ℃,調(diào)制器出口溫度比柱箱高120 ℃,冷阱保持-50 ℃。

2)質(zhì)譜條件。電子轟擊源(EI),電離能為70 eV;離子源溫度為230 ℃,MS傳輸線溫度為280 ℃,四極桿溫度為150 ℃;EM電壓為862 V;采集質(zhì)量范圍為41～350 amu,采集速度為23 Hz,溶劑延遲時間分別為中性和堿性組分時2.5 min,酸性時5 min。

3)譜圖處理。采用全二維數(shù)據(jù)處理工作站軟件Canvas載入數(shù)據(jù),自動繪制全二維TIC輪廓圖,并對圖中信噪比大于10的峰自動識別,標(biāo)識出的每一個峰點即代表1種化合物,每個化合物由1對保留時間確定,X軸方向為第1維保留時間/min,Y軸方向為第2維保留時間/s,通過正構(gòu)烷烴進(jìn)行保留指數(shù)計算。在Canvas軟件上,通過對每種化合物的質(zhì)譜圖進(jìn)行NIST20標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫比對檢索、結(jié)合保留指數(shù)(Retention Index,RI)等信息,對化合物進(jìn)行定性分析,同時根據(jù)峰面積,利用內(nèi)標(biāo)校正得到各香氣成分的相對含量。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理采用Excel、SPSS19及多元統(tǒng)計軟件SIMCA14.1進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.2.5 差異成分篩選采用多元統(tǒng)計分析方法,對兩組樣本首先進(jìn)行PCA,以便初步了解各組樣本間的總體成分差異和組內(nèi)樣本間的變異度大小。根據(jù)OPLS-DA預(yù)測模型穩(wěn)定可靠性,利用多維統(tǒng)計變量重要性投影(Variable Importancein Project,VIP)值、獨立樣本T檢驗P值及差異倍數(shù)(FC值)篩選差異成分。

2 結(jié)果與討論

2.1 兩種煙葉揮發(fā)性成分分析

運用二維氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分別對加拿大煙葉和云南KRK26煙葉中的中性、堿性和酸性成分進(jìn)行分離鑒定,種類及含量見表1,其中中性成分按照來源分為類胡蘿卜素降解產(chǎn)物、西柏烷類降解產(chǎn)物、棕色化反應(yīng)產(chǎn)物、苯丙氨酸類降解產(chǎn)物等,堿性成分主要為生物堿,酸性成分主要分為揮發(fā)性有機酸、半揮發(fā)性有機酸和酚類。由表1可知,加拿大煙葉和云南KRK26煙葉共鑒定出117種香氣成分,加拿大煙葉有114 種,云南KRK26煙葉有113 種,其中110 種為兩者共有。中性香氣成分有63種,其中類胡蘿卜素降解產(chǎn)物均為21種,但含量差異較大,加拿大煙葉含量較高的分別是巨豆三烯酮、金合歡基丙酮、(E)-β-大馬酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、二氫大馬酮、香葉基丙酮、5,6-環(huán)氧-β-紫羅蘭酮和3-氧代-α-紫羅蘭醇,云南KRK26煙葉含量較高的分別是巨豆三烯酮、金合歡基丙酮、(E)-β-大馬酮、香葉基丙酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、二氫大馬酮、5,6-環(huán)氧-β-紫羅蘭酮、脫氫二氫-β-紫羅蘭酮和3-氧代-α-紫羅蘭醇;茄酮作為典型的西柏烷類降解產(chǎn)物,在加拿大煙葉、云南KRK26煙葉中的含量分別為11.54 μg/g、16.57 μg/g;此外,二者的棕色化反應(yīng)產(chǎn)物均為11種;苯丙氨酸類降解產(chǎn)物均為4種;余下主要為含倍半萜結(jié)構(gòu)的醇、醛、酮、萜烯等,共26種。兩種煙葉堿性香氣成分共18種,主要為吡啶和喹啉類化合物,其中加拿大煙葉16種,云南KRK26煙葉18種。酸性香氣成分共36種,包括揮發(fā)性有機酸、半揮發(fā)性有機酸和酚類,其中加拿大煙葉35種,云南KRK26煙葉34種。

2.2 兩種煙葉香氣差異成分分析

兩種煙葉樣本的PCA得分圖如圖1所示,其中每個點代表1個獨立樣品,C代表加拿大煙葉樣本,Y代表云南KRK26煙葉樣本。由圖1可知,2個主成分的累計貢獻(xiàn)率達(dá)到90.1%,2組樣品之間的分離趨勢明顯,表明加拿大煙葉和云南KRK26煙葉之間存在明顯差異。進(jìn)一步采用具有監(jiān)督的模式識別方法OPLS-DA對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,提取相關(guān)性較小變量的主要信息,除去不相關(guān)的差異以篩選差異變量,模型的可解釋變量R2(R2X=0.752、R2Y=1.000)及可預(yù)測度Q2(Q2=0.991)均較高,表明該模型的穩(wěn)定性和預(yù)測性較好,可較好反映兩種煙葉樣品之間的香氣差異成分。為驗證模型是否存在過擬合現(xiàn)象,對模型進(jìn)行了200次響應(yīng)排序,結(jié)果如圖2所示。由圖2可知,R2和Q2的截距分別為0.641和-0.498,說明模型有效,不存在過擬合現(xiàn)象。

基于OPLS-DA結(jié)果,根據(jù)獲得的多變量分析OPLS-DA模型的VIP值,以其表示對應(yīng)香氣成分的組間差異在模型各組樣本分類判別中的影響強度,一般認(rèn)為VIP≥1的物質(zhì)為差異顯著,可初步篩選出兩種煙葉間的差異成分。對云南KRK26煙葉和加拿大煙葉進(jìn)行篩選,共得到的差異成分9類65種(P<0.001),結(jié)果見表2。由表2可知,整體上,云南KRK26煙葉和加拿大煙葉差異成分(65 種)占共有香氣成分(117種)的50.6%,說明兩種煙葉香氣成分差異顯著。其中差異成分較多的種類是類胡蘿卜素降解產(chǎn)物和有機酸,占比分別為13.7%和15.4%,其次為其他中性香氣成分(14.5%)和生物堿(5.1%),苯丙氨酸類降解產(chǎn)物有2種差異成分,西柏烷類降解產(chǎn)物和棕色化反應(yīng)產(chǎn)物各有1種差異成分。

表1 兩種煙葉中揮發(fā)性香氣成分種類及含量Table 1 Types and content of volatile aroma components of two tobacco leaves μg/g

表1(續(xù))

圖1 兩種煙葉樣本的PCA得分圖Fig.1 PCA score plot for two types of tobacco leaves

圖2 兩種煙葉樣本OPLS-DA 200次交叉驗證圖Fig.2 Cross-validation plot of OPLS-DA with 200 permutation test for two types of tobacco leaves

為方便觀察代謝物變化規(guī)律,簡單、直觀地反映代謝物的變化情況,對差異顯著的代謝物進(jìn)行歸一化處理,并繪制聚類熱圖(見圖3)。由圖3可知,兩種煙葉香氣成分含量整體上差異明顯。結(jié)合表1和表2可知,類胡蘿卜素降解產(chǎn)物是煙葉中重要的致香成分,其種類及含量與煙葉香氣風(fēng)格的形成至關(guān)重要,16種VIP>1的類胡蘿卜素降解產(chǎn)物,在云南KRK26煙葉中的含量均顯著高于加拿大煙葉,包括巨豆三烯酮、大馬酮、二氫大馬酮等,盡管差異倍數(shù)不大,但由于其含量較高,香氣閾值較低,可認(rèn)為是兩種煙葉的關(guān)鍵差異成分。中性香氣成分中,新植二烯、螺巖蘭草酮和α-香附酮含量較高,且在加拿大煙葉中均高于或遠(yuǎn)高于云南KRK26煙葉。此外,有機酸是兩種煙葉中化合物數(shù)量較多、含量較高且差異較大的一類物質(zhì)。根據(jù)結(jié)構(gòu)差異,煙葉中的脂肪酸又可分為揮發(fā)性有機酸和半揮發(fā)性有機酸,云南KRK26煙葉揮發(fā)性有機酸含量高于加拿大煙葉,而加拿大煙葉半揮發(fā)有機酸含量明顯高于云南KRK26煙葉,其可能與煙葉香氣風(fēng)格的形成密切相關(guān)。

表2 兩種煙葉中差異成分分析結(jié)果Table 2 Analysis of differential components between two types of tobacco leaves

為比較兩種煙葉香氣成分定量信息發(fā)生的差異倍數(shù)變化,將差異倍數(shù)進(jìn)行處理(log2FC),變化排在前30的差異表達(dá)代謝成分如圖4所示。由圖4可知,加拿大煙葉含7種有機酸(壬酸、異丁酸、月桂酸、油酸、棕櫚油酸、3-甲基戊酸和肉豆蔻酸),2 種酚類(2-甲氧基-5-甲基苯酚和4-乙烯基愈創(chuàng)木酚),6種其他中性香氣成分(香葉醇、α-香附酮、氧化石竹烯、螺巖蘭草酮、乙酸乙酯和香葉基香葉醇)的含量顯著高于云南KRK26煙葉;而云南KRK26煙葉含4 種類胡蘿卜素降解產(chǎn)物(β-二氫紫羅蘭酮、4-氧代異佛爾酮、香葉基丙酮和二氫-β-脫氫紫羅蘭酮),2種生物堿(4-苯基吡啶和喹啉甲醛),1 種酚類(苯酚),2 種脂肪酸(丁酸和異戊酸),1 種苯丙氨酸類降解產(chǎn)物(苯乙醇),5 種其他中性香氣成分(1-戊烯-3-酮、6-甲基-5-乙基-3-庚烯-2-酮、異戊烯醛、γ-辛內(nèi)酯和6-甲基-2-庚酮)的相對含量顯高于加拿大煙葉。

圖3 差異成分聚類熱圖Fig.3 Heat map for differential components

圖4 兩種煙葉中含量差異最大的30 種化合物Fig.4 Thirty most significantly differential components between two types of tobacco leaves

2.3 兩種煙葉風(fēng)格差異分析

從煙氣特征來看,加拿大煙葉香氣細(xì)膩、透發(fā)、圓潤感好,香氣量尚足,煙氣濃度中等、柔和,吸味甜、勁頭足、余味舒適;云南KRK26煙葉香氣豐滿清雅,自然醇和,煙草本香凸顯,刺激性稍大,吸味津甜,細(xì)膩圓潤。兩種煙葉感官品質(zhì)及香氣風(fēng)格相似的同時也存在差異,這與其香氣成分種類及含量有關(guān)。分析結(jié)果表明:加拿大煙葉與云南KRK26煙葉的堿性香氣成分差異不大,而酸性香氣成分和中性香氣成分差異明顯。加拿大煙葉半揮發(fā)性中長鏈脂肪酸含量明顯高于云南KRK26煙葉,半揮發(fā)性有機酸可柔和煙氣,提升煙氣圓潤感和透發(fā)性,是煙葉形成濃香型風(fēng)格的重要影響因素。云南KRK26煙葉中類胡蘿卜素降解產(chǎn)物和西柏烷類降解產(chǎn)物含量占比均較高,其中巨豆三烯酮、β-大馬酮、β-二氫大馬酮、茄酮等成分對增加煙氣的清甜感及凸顯煙草本香具有重要作用,而加拿大煙葉中萜烯、萜酮含量較高,類胡蘿卜素降解產(chǎn)物含量雖低于云南KRK26煙葉,但仍處于較高的水平,這使得加拿大煙葉形成了獨特的“濃中透清”煙氣風(fēng)格。

王曉輝[23]以煙葉中β-紫羅蘭酮、β-二氫大馬酮和巨豆三烯酮總量的聚類分析結(jié)果為分組依據(jù),建立了化學(xué)分組方法用來指導(dǎo)葉組配方,發(fā)現(xiàn)配方模塊的香氣特性及煙氣特性與類胡蘿卜素標(biāo)志性轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量呈明顯的相關(guān)性,類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量高的煙葉,香氣特性較好,即煙香豐富、香氣量足,而類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量中等的煙葉,煙氣特性較好,即煙氣細(xì)膩、煙香明快、刺激性小。從本文研究結(jié)果可知,云南KRK26煙葉中巨豆三烯酮、β-大馬酮、β-二氫大馬酮、β-紫羅蘭酮等香氣成分總量高,香氣豐滿、香氣量充足,但酸性成分含量相對較低,使得煙氣刺激性稍大,煙氣略顯粗糙,柔順性有待提升,配伍性稍差,可作為主料煙使用,以彰顯卷煙香氣風(fēng)格;加拿大煙葉中類胡蘿卜素降解產(chǎn)物含量適中,半揮發(fā)性有機酸含量較高,使得其煙氣盡管香氣量一般,但舒適性、柔順性較好,在葉組配方中使用時,自身的香氣風(fēng)格不易顯露,在提升香氣格調(diào)的同時,又能有效降低煙氣刺激性,使煙氣柔和細(xì)膩,改善煙氣特性。

3 結(jié)論

本文通過主成分分析、正交偏最小二乘判別分析等方法對加拿大煙葉和云南KRK26煙葉香氣成分進(jìn)行了對比分析,篩選得到差異成分65種,占共有香氣成分的50.6%。加拿大煙葉中有22 種成分含量較高,主要為半揮發(fā)性有機酸類和倍半萜類;云南KRK26煙葉中有43種成分含量較高,主要為類胡蘿卜素降解產(chǎn)物,如巨豆三烯酮、大馬酮、二氫大馬酮等。類胡蘿卜素降解產(chǎn)物和半揮發(fā)性有機酸含量的差異與兩種煙葉香氣風(fēng)格密切相關(guān),因此,在加拿大煙葉替代篩選時,可將化學(xué)成分作為判定指標(biāo),重點關(guān)注類胡蘿卜素降解產(chǎn)物含量中等、半揮發(fā)性有機酸含量較高的煙葉,并在葉組配方中將其作為調(diào)味煙葉使用,可與濃香型或清香型主料煙進(jìn)行較好的配伍,提升煙草制品品質(zhì)。