黃瓜發(fā)育早期耐旱突變體篩選與鑒定

陳皓煒　劉志宇　安宇寧　王茹　宋蒙飛　陳潔　婁群峰

摘要：以863份黃瓜突變體和長(zhǎng)春密刺野生型為材料，進(jìn)行PEG-6000溶液（200g/kg）模擬干旱發(fā)芽試驗(yàn)，通過(guò)比較發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)發(fā)芽率并綜合胚根生長(zhǎng)情況，初步篩選得到耐旱材料，再對(duì)篩選出的材料和野生型材料長(zhǎng)春密刺進(jìn)行苗期干旱（PEG-6000，200g/kg）處理，并測(cè)定形態(tài)指標(biāo)和生理指標(biāo)，綜合比較篩選得到耐旱新材料。結(jié)果表明，干旱發(fā)芽試驗(yàn)下，初步得到11份耐旱突變體材料。幼苗期干旱脅迫處理下11份突變體材料與長(zhǎng)春密刺野生型各項(xiàng)形態(tài)指標(biāo)和生理指標(biāo)都呈現(xiàn)不同程度的變化，株高、莖粗和地下鮮質(zhì)量均降低，而超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量、脯氨酸（Pro）含量及可溶性蛋白質(zhì)含量上升。隸屬函數(shù)法比較篩選得到7份高耐旱新材料。

關(guān)鍵詞：黃瓜;發(fā)育早期;突變體;耐旱;篩選;鑒定

中圖分類號(hào)：S642.201文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）01-0112-06

作者簡(jiǎn)介：陳皓煒（1999—），男，浙江義烏人，主要從事葫蘆科作物遺傳育種與種質(zhì)創(chuàng)新研究。E-mail：2629015119@qq.com。

通信作者：婁群峰，博士，教授，主要從事葫蘆科作物遺傳育種與種質(zhì)創(chuàng)新研究。E-mail：qflou@njau.edu.cn。

干旱是世界性的主要自然災(zāi)害之一，占所有非生物危害的首位，是限制植物生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量的重要環(huán)境因素[1]。干旱半干旱區(qū)約占全球陸地總面積的30%，我國(guó)干旱半干旱區(qū)約占國(guó)土面積的40%[2]，而根據(jù)模型預(yù)測(cè)，隨著氣候變化的加劇，干旱區(qū)的面積還將繼續(xù)擴(kuò)大[3]。此外，季節(jié)性干旱還時(shí)常影響我國(guó)非干旱的主要農(nóng)業(yè)地區(qū)，如何提高農(nóng)作物的耐旱性一直是研究的熱點(diǎn)[4]。

黃瓜（CucumissativusL.）是世界性的重要蔬菜作物，我國(guó)黃瓜種植面積約126.67萬(wàn)hm2，占世界黃瓜栽培面積的60%，年產(chǎn)量達(dá)6487萬(wàn)t，規(guī)模和年產(chǎn)量都位居世界第一[5-6]。黃瓜根系較淺，且葉片大，耗水量大，生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)于水分的要求高，干旱極易影響黃瓜的生長(zhǎng)發(fā)育、果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量[7]。

黃瓜優(yōu)質(zhì)材料篩選已在耐鹽、低溫、高溫等耐逆方面得到實(shí)現(xiàn)，而耐旱方面研究仍集中于黃瓜生理指標(biāo)對(duì)干旱的響應(yīng)[8-13]，對(duì)耐旱黃瓜種質(zhì)選育的相關(guān)研究較少，現(xiàn)有黃瓜耐旱種質(zhì)資源缺乏。同時(shí)，黃瓜遺傳背景狹窄，現(xiàn)有可用來(lái)表型篩選的種植資源缺乏，而EMS（甲基磺酸乙酯）誘變突變體庫(kù)為篩選目標(biāo)材料提供了豐富的資源，可作為本研究的篩選源[14-15]。但用常規(guī)方法對(duì)植株苗期形態(tài)和生理指標(biāo)鑒定來(lái)篩選耐旱材料在本研究需要花費(fèi)大量的人力和時(shí)間，因此簡(jiǎn)便有效的篩選方法顯得十分必要[16]。種子萌發(fā)期篩選操作簡(jiǎn)單且周期較短，可快速過(guò)濾大量耐旱性較差的材料，縮小篩選范圍，苗期則對(duì)粗篩出的材料進(jìn)一步篩選，得到較可靠的優(yōu)質(zhì)耐旱材料。

研究表明，干旱脅迫會(huì)抑制種子對(duì)水分的吸收，從而使細(xì)胞喪失膨壓，種子生活力下降，影響種子中與碳氮代謝相關(guān)酶的活性及其代謝產(chǎn)物，進(jìn)而顯著抑制種子的萌發(fā)[17]。由于缺乏水分，植株在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)程中表現(xiàn)為地下鮮質(zhì)量變小、株高和莖粗下降，不利于后期的生殖生長(zhǎng)[18]。此外，干旱導(dǎo)致外界環(huán)境擁有較大的滲透壓，植物細(xì)胞失水，導(dǎo)致可溶性蛋白和脯氨酸含量上升[19];且干旱會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜氧化，引起超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛含量上升[20]。由于植株耐旱性是多項(xiàng)生理指標(biāo)共同作用的結(jié)果，以某一指標(biāo)的結(jié)果判斷材料耐旱性過(guò)于片面，且無(wú)法對(duì)所有參試材料的耐旱性進(jìn)行合理的定量比較，隸屬函數(shù)正好可將互相獨(dú)立的數(shù)值轉(zhuǎn)換成綜合指標(biāo)，減小單個(gè)指標(biāo)存在的片面性和誤差，增強(qiáng)評(píng)價(jià)的說(shuō)服力[21]。

本研究利用聚乙二醇6000（PEG-6000）模擬干旱對(duì)黃瓜甲基磺酸乙酯（EMS）突變體庫(kù)材料進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)篩選耐旱突變體材料，再分析鹽脅迫下耐旱突變體材料的形態(tài)和生理指標(biāo)特征，利用平均隸屬函數(shù)值綜合評(píng)價(jià)不同材料耐旱性，篩選出高耐優(yōu)良材料，并闡明黃瓜耐旱生理機(jī)制，為黃瓜耐旱的品種選育提供優(yōu)良材料，同時(shí)為耐旱生理機(jī)制的進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料與處理

本試驗(yàn)使用的材料由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)葫蘆科作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室提供。前期已獲得用EMS誘變處理的華北型黃瓜材料長(zhǎng)春密刺，自交3代獲得突變體庫(kù)。試驗(yàn)于2019年5—11月于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

取上述的863份突變體材料進(jìn)行編號(hào)，每個(gè)編號(hào)取5粒飽滿整齊的種子，用清水沖洗后放入裝有55℃清水的紙杯中浸泡4h，將種子取出吸去多余的水，放入墊有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，加入20mL的200g/kgPEG-6000溶液，置于光培箱中黑暗發(fā)芽，溫度為（28±1）℃，重復(fù)3次。以胚根突破種皮2mm為準(zhǔn)，分別于2d后統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽數(shù)，4d后統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽數(shù)、胚根長(zhǎng)度，最后計(jì)算出各個(gè)編號(hào)種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)發(fā)芽率。根據(jù)種子的各項(xiàng)發(fā)芽指標(biāo)，對(duì)比篩選出耐旱型、中間型、旱敏型3種突變體材料。

將發(fā)芽期初步篩選出來(lái)的耐旱材料和長(zhǎng)春密刺野生型進(jìn)行浸種催芽，待種子出芽后，播入挖有小孔的泡沫板，放入裝有清水的塑料盤中進(jìn)行水培，每天更換清水。在幼苗的子葉展開(kāi)后，換用1/2Hogland營(yíng)養(yǎng)液水培;待幼苗長(zhǎng)至3葉1心后，每份材料挑選12株長(zhǎng)勢(shì)整齊一致的黃瓜苗平均分為2組：處理組和對(duì)照組;處理組營(yíng)養(yǎng)液中加入一定量的PEG-6000使之濃度達(dá)到100g/kg，預(yù)處理1d，再加PEG-6000使其濃度達(dá)到200g/kg，處理2d后測(cè)定植株形態(tài)指標(biāo)和葉片生理指標(biāo)，每個(gè)指標(biāo)設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2測(cè)定指標(biāo)與方法

1.2.1發(fā)芽指標(biāo)發(fā)芽勢(shì)=2d后種子發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)×100%;發(fā)芽率=4d后種子發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)×100%;相對(duì)發(fā)芽率=供試種子發(fā)芽率-對(duì)照長(zhǎng)春密刺種子發(fā)芽率。

1.2.2形態(tài)指標(biāo)用游標(biāo)卡尺于子葉部位向下0.5cm處測(cè)量莖粗（mm）;用直尺測(cè)量從泡沫板表面到幼苗最高生長(zhǎng)點(diǎn)部位的距離（cm）;將幼苗在泡沫板以下的地下部與植株分離，用吸水紙吸干表面殘留的營(yíng)養(yǎng)液，電子天平稱地下部鮮質(zhì)量（g）。

1.2.3生理指標(biāo)超氧化物歧化酶（SOD）采用氮藍(lán)四唑（NBT）還原法[22]測(cè)定;丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法[23]測(cè)定;脯氨酸（Pro）測(cè)定采用酸性茚三酮法[24]進(jìn)行;可溶性蛋白質(zhì)含量用考馬斯亮藍(lán)法[25]測(cè)定。

1.2.4隸屬函數(shù)值模糊集合中的隸屬函數(shù)，可將互相獨(dú)立的數(shù)值轉(zhuǎn)換成1個(gè)綜合的指標(biāo)，現(xiàn)在綜合評(píng)判耐逆性常用此方法。

耐旱性隸屬函數(shù)值算法如下：

若測(cè)得指標(biāo)與耐旱性正相關(guān)，則U=（X-Xmin）/（Xmax-Xmin）;

若測(cè)得指標(biāo)與耐旱性負(fù)相關(guān)，則U=1-（X-Xmin）/（Xmax-Xmin）。

式中：X表示某指標(biāo)的一個(gè)測(cè)定值;Xmin為該指標(biāo)測(cè)定值中的最小值;Xmax為該指標(biāo)測(cè)定值中的最大值;U表示指標(biāo)該測(cè)定值的隸屬函數(shù)值。計(jì)算各指標(biāo)隸屬函數(shù)值的均值，均值越大，則表明耐旱性越強(qiáng)。

1.3數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理分析采用Excel2016和SPSS25.0軟件，顯著水平α=0.05。

2結(jié)果與分析

2.1發(fā)芽期黃瓜耐旱突變體材料的篩選

對(duì)863份黃瓜突變體材料進(jìn)行發(fā)芽指標(biāo)統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)顯示，不同編號(hào)種子之間發(fā)芽指標(biāo)差異較為顯著。絕大部分突變體材料發(fā)芽指標(biāo)弱于或近似長(zhǎng)春密刺野生型（發(fā)芽率17.7%），發(fā)芽率低甚至為0、胚根很短甚至不生長(zhǎng)，表明這些材料耐旱性較差;少部分材料表現(xiàn)出發(fā)芽指標(biāo)顯著優(yōu)于野生型，大部分發(fā)芽甚至全發(fā)芽、胚根長(zhǎng)度較長(zhǎng)。根據(jù)相對(duì)發(fā)芽率將所有材料分為耐旱型、中間型和旱敏型3種材料（表1），其中旱敏型相對(duì)發(fā)芽率小于20%，數(shù)量最多，有591份，占總材料數(shù)的68.48%;中間型相對(duì)發(fā)芽率為20%～80%，有250份，占總材料數(shù)的28.97%;耐旱型相對(duì)發(fā)芽率大于80%，僅有22份，占總材料數(shù)的2.55%。

根據(jù)這22份材料種子的發(fā)芽指標(biāo)，以高發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和較長(zhǎng)胚根長(zhǎng)度，從中選出11份表現(xiàn)優(yōu)異的材料進(jìn)行下一步鑒定（表2）。

2.2幼苗期黃瓜耐旱材料的鑒定

2.2.1形態(tài)指標(biāo)鑒定干旱脅迫下11份黃瓜突變體材料和長(zhǎng)春密刺野生型在各個(gè)形態(tài)指標(biāo)上均呈現(xiàn)不同程度的下降（表3）。除Mu-18-12和野生型外，其余材料的株高在干旱處理和對(duì)照間均無(wú)顯著差異，且共6份材料（Mu-119-6、Mu-18-12、Mu-175-1、Mu-118-5、Mu-47-13、Mu-31-11）株高降低的百分比（5.35%、9.06%、9.25%、9.69%、10.51%、10.53%）小于野生型（11.43%）;僅Mu-33-6和Mu-109-10這2份材料的莖粗在干旱和對(duì)照間無(wú)顯著差異，且7份材料（Mu-118-5、Mu-170-10、Mu-109-10、Mu-33-6、Mu-18-12、Mu-31-10、Mu-31-11）莖粗降低的百分比（4.32%、5.82%、7.57%、7.86%、8.97%、9.05%、9.05%）小于野生型（10.14%）;在干旱處理和對(duì)照間，除Mu-31-11、Mu-67-1和野生型外，其余材料的地下鮮質(zhì)量無(wú)顯著差異，且6份材料（Mu-118-5、Mu-170-10、Mu-119-6、Mu-175-1、Mu-67-1、Mu-31-11）地下鮮質(zhì)量降低的百分比（11.35%、14.95%、18.18%、19.66%、20.00%、20.18%）小于野生型（20.47%）。

2.2.2可溶性蛋白含量鑒定干旱脅迫使12份材料的可溶性蛋白含量均呈現(xiàn)不同程度的上升趨勢(shì)（圖1），除Mu-109-10外，其余材料在干旱和對(duì)照之間的可溶性蛋白含量均存在顯著差異。其中，4份材料（Mu-31-10、Mu-119-6、Mu-67-1、Mu-118-5）的可溶性蛋白上升的百分比（48.55%、44.33%、43.35%、42.86%）大于野生型（41.42%）。

2.2.3SOD活性鑒定干旱脅迫能顯著提高黃瓜幼苗的超氧化物歧化酶（SOD）活性（圖2），每份材料的SOD活性均與對(duì)照有顯著差異。其中，6份突變體（Mu-31-11、Mu-109-1、Mu-47-13、Mu-118-5、Mu-33-6、Mu-67-1）的SOD活性上升百分比（104.07%、86.58%、83.79%、84.14%、82.51%、79.87%）大于野生型（77.43%）。

2.2.4脯氨酸含量鑒定干旱導(dǎo)致不同材料的脯氨酸含量上升（圖3），除Mu-119-6以外，每份材料的脯氨酸含量在干旱脅迫和對(duì)照間均存在顯著差異，其中2份材料（Mu-118-5、Mu-31-10）的脯氨酸含量上升百分比（460.00%、412.50%）大于野生型（402.17%）。

2.2.5丙二醛含量鑒定干旱使不同材料的丙二醛含量呈現(xiàn)不同程度的上升（圖4），除Mu-119-6、Mu-47-13和Mu-170-10以外，其他材料的丙二醛含量在干旱脅迫和對(duì)照間均存在顯著差異。突變體中有9份材料（Mu-170-10、Mu-47-13、Mu-67-1、Mu-119-6、Mu-31-10、Mu-118-5、Mu-175-1、Mu-33-6、Mu-31-11）的丙二醛含量上升百分比（13.60%、13.29%、14.42%、16.04%、25.67%、36.92%、39.39%、45.79%、47.68%）小于野生型（54.87%）。

2.3黃瓜耐旱突變體篩選結(jié)果鑒定

部分突變體在不同指標(biāo)表現(xiàn)差異較大，而單一指標(biāo)無(wú)法評(píng)判植株的耐旱性，同時(shí)不同突變體在正常生長(zhǎng)環(huán)境下同一生理指標(biāo)的結(jié)果也不盡相同，若直接取干旱脅迫下的指標(biāo)進(jìn)行隸屬函數(shù)值計(jì)算，不可避免地存在起始誤差，筆者利用鹽脅迫下同一時(shí)期黃瓜幼苗不同指標(biāo)上升/下降百分比的隸屬函數(shù)值的平均值來(lái)綜合評(píng)價(jià)不同材料的耐旱性，最終得到12份突變體和長(zhǎng)春密刺野生型材料的耐旱性隸屬函數(shù)值（表4），以長(zhǎng)春密刺野生型的表現(xiàn)為分界，根據(jù)平均隸屬度最終篩選出7份優(yōu)質(zhì)耐旱材料，即Mu-118-5、Mu-119-6、Mu-170-10、Mu-67-1、Mu-31-11、Mu-33-6和Mu-47-13，與上述分析結(jié)果基本保持一致。

3討論

干旱嚴(yán)重影響種子萌發(fā)、植株的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化[26-27]。種子的發(fā)芽指標(biāo)和胚根長(zhǎng)度可直接反映其對(duì)逆境的耐受性，且操作簡(jiǎn)單、試驗(yàn)周期短，適合大批量的種子篩選試驗(yàn)。聚乙二醇6000（PEG-6000）是不能透過(guò)細(xì)胞壁的一類大分子滲透調(diào)節(jié)物，其對(duì)細(xì)胞毒性小[13]。本試驗(yàn)選用200g/kg聚乙二醇6000模擬干旱環(huán)境進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)，篩選得到11份相對(duì)耐旱材料，僅占供試材料的1.27%，表明黃瓜EMS突變體中僅有極少數(shù)突變體擁有較好的耐旱性，而絕大部分材料耐旱性較差。

由形態(tài)指標(biāo)結(jié)果可見(jiàn)，12份材料在干旱脅迫后指標(biāo)都下降，但下降比例較小，且不同材料之間差異也較小，形態(tài)指標(biāo)雖能在一定程度上反映植株受干旱危害的程度，但由于形態(tài)指標(biāo)屬于表型，不只受種質(zhì)本身調(diào)控，也受外界各種環(huán)境影響，再加上處理前后指標(biāo)變化幅度不大，所得結(jié)果容易存在誤差，但大體指向仍有參考價(jià)值，此時(shí)需要內(nèi)部生理指標(biāo)來(lái)進(jìn)一步補(bǔ)充。

可溶性蛋白和脯氨酸是植物細(xì)胞中的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在干旱脅迫下大量積累，降低細(xì)胞滲透勢(shì)，促進(jìn)細(xì)胞在干旱環(huán)境下吸收外界的水分，以維持細(xì)胞正常的形態(tài)結(jié)構(gòu)[28]，12份材料的可溶性蛋白呈現(xiàn)10%～50%的增幅，其中增幅為40%～50%的材料耐旱性較好。參試材料脯氨酸含量均呈現(xiàn)成倍增長(zhǎng)，甚至有2份材料出現(xiàn)4倍以上的增幅，表明其擁有較強(qiáng)滲透調(diào)節(jié)能力和耐旱性。除此以外，所有材料在干旱下SOD活性都有40%～100%的顯著提高，研究表明，干旱下細(xì)胞膜脂過(guò)氧化，產(chǎn)生大量的活性氧，而SOD是植物細(xì)胞重要的耐氧化酶，在接收到活性氧大量增加的信號(hào)后，耐氧化系統(tǒng)中SOD活性增強(qiáng)，清除過(guò)量的活性氧，緩解干旱可能造成的膜損傷[29]，SOD活性越高，說(shuō)明對(duì)干旱脅迫的調(diào)節(jié)能力越強(qiáng)。SOD雖然可以緩解膜損傷，但在較強(qiáng)的干旱脅迫下，SOD不足以清除所有增加的活性氧，導(dǎo)致細(xì)胞膜過(guò)氧化、MDA合成增加，故MDA含量是評(píng)價(jià)細(xì)胞膜受損傷程度的指標(biāo)[30]，MDA含量增幅越小，說(shuō)明細(xì)胞膜受損程度越小，植株耐旱性越強(qiáng)，故突變體中9份MDA含量增幅小于野生型的材料擁有較強(qiáng)的耐旱性。綜上所述，可溶性蛋白、脯氨酸含量和超氧化物歧化酶活性與黃瓜幼苗耐旱性呈正相關(guān)，而MDA含量與耐旱性呈負(fù)相關(guān)。

本研究以PEG處理模擬干旱，通過(guò)發(fā)芽期+苗期的篩選形式對(duì)長(zhǎng)春密刺黃瓜突變體材料進(jìn)行耐旱性評(píng)價(jià)，最終由形態(tài)和生理指標(biāo)的平均隸屬度篩選得到7份優(yōu)質(zhì)耐旱材料：Mu-118-5、Mu-119-6、Mu-170-10、Mu-67-1、Mu-31-11、Mu-33-6和Mu-47-13，研究結(jié)果為后續(xù)黃瓜耐旱種質(zhì)的選育和耐旱機(jī)制的深入研究提供理論指導(dǎo)。

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