映山紅花瓣花色苷成分組成分析

賀葉風(fēng), 張春英, 劉群錄,*

(1.上海交通大學(xué)設(shè)計(jì)學(xué)院, 上海 200240; 2.上海植物園, 上海城市植物資源開(kāi)發(fā)應(yīng)用工程技術(shù)研究中心, 上海 200231)

映山紅(Rhododendronsimsii)是杜鵑花科(Ericaceae)杜鵑花屬(RhododendronL.)的常綠或半常綠灌木[1]，廣泛分布于我國(guó)長(zhǎng)江以南地區(qū)及臺(tái)灣地區(qū)的丘陵或山地，花色鮮艷且開(kāi)花繁茂，是很多杜鵑花品種的雜交親本[1]?；ㄉ侵参镒钪匾挠^賞指標(biāo)，花瓣細(xì)胞中色素種類與含量是決定花朵最終呈色的一個(gè)重要因素[2]。目前關(guān)于杜鵑花科花色素的研究報(bào)道較少，涉及的物種也少[3]。Hang等[4]研究了來(lái)自越南和日本的映山紅(R.simsii)花瓣，檢測(cè)到了14種花色苷，但是只鑒定了其中2種花色苷，即矢車菊素 3-O-阿拉伯糖苷和矢車菊素 3-O-半乳糖苷；Liu等[5]研究了柳條杜鵑(R.virgatum)、猴斑杜鵑(R.faucium)、硬毛杜鵑(R.hirtipes)等10種杜鵑花屬植物花瓣的類黃酮，得到了5種花色苷和23種黃酮。近年來(lái)，杜鵑花花色苷研究報(bào)道有增加的趨勢(shì)，但仍有許多具有重要育種價(jià)值的杜鵑屬植物花色及花色素組成尚不清楚。本研究以中國(guó)原產(chǎn)映山紅的7個(gè)不同花色株系為材料，研究了其花色素組成以及與花色的關(guān)系，以期為杜鵑花花色改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料來(lái)自于大別山播種苗單株經(jīng)擴(kuò)繁形成的株系，代號(hào)分別為Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7，種植于上海植物園苗圃。映山紅花瓣于2019年4—5月采集，于晴天上午9—11時(shí)，取花瓣，液氮冷凍，置于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 花色描述與測(cè)定

取盛花期的映山紅花瓣，利用第五版英國(guó)皇家園藝學(xué)會(huì)比色卡(Royal Horticultural Society color chart，RHSCC)對(duì)其花色進(jìn)行描述。重復(fù)5次，取頻率出現(xiàn)最高的結(jié)果。目測(cè)和 RHSCC比色光源為非直射的日光光源(通常選擇北面射入的日光)。

花色測(cè)定按照張寶智等[6]方法，采用國(guó)際照明委員會(huì)(International Commission on Illumination, CIE)表色系統(tǒng)表征映山紅花瓣的花色。CIE表色系統(tǒng)的明度L*值、色相a*值、色相b*值在三維色度坐標(biāo)系上，L*軸垂直于a*軸、b*軸組成的平面。L*值從0到100表示明度逐漸增加；紅綠屬性a*值由負(fù)值變化到正值，表示綠色減退、紅色增強(qiáng)；黃藍(lán)屬性b*值由小變大，表示藍(lán)色的減退、黃色的增強(qiáng)。

彩度C*和色相角h*分別根據(jù)以下公式計(jì)算。

h*=arctan(b*/a*)

式中，C*值表示到L*軸的垂直距離，距離越大，彩度越大。

1.3 花色苷總量的測(cè)定

花色苷總量(total anthocyanin，TA)測(cè)定采用pH示差法[7]?；ò暝谝旱醒心コ煞?，稱取0.5 g樣品，加入5 mL的0.1%鹽酸甲醇提取液，10 000 r·min-1離心10 min后，取上清液待測(cè)。分別取1 mL提取液用pH 1.0和4.5緩沖液稀釋定容至3 mL。達(dá)平衡80 min后，分別測(cè)定520 nm的吸光度。用700 nm的吸光度作為模糊度的校正，以蒸餾水做參比液，以矢車菊素3-O-葡萄糖苷作為花色苷標(biāo)準(zhǔn)品?；ㄉ湛偭坑靡韵鹿接?jì)算。

TA(mg·g-1) =AB/eL×MW×D×V/G×1 000

AB= (A520-A700)pH1.0- (A520-A700)pH4.5

式中，TA表示花色苷總量；AB表示兩個(gè)pH下吸光度的差值；Mw表示花色苷分子量(以矢車菊3-O-葡萄糖苷計(jì)，449.2 g·mol-1)；D為稀釋倍數(shù)；e為摩爾消光系數(shù)(以矢車菊3-O-葡萄糖苷計(jì)，29 600 L·mol-1·cm-1)；L為光程(1 cm)；G為花瓣鮮重(g)。

1.4 花色苷組分的定性分析

采用Acquity I-class超高效液相色譜和VION離子淌度四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC-Q-TOF-MS)對(duì)花瓣中花色苷進(jìn)行定性分析。超高效液相色譜條件為：色譜柱為WATERS ACQUITY UPLC BEH C18反相硅膠柱 (2.1 mm ×100 mm，1.7 μm)。流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水；B為0.1%甲酸乙腈。洗脫梯度為0 min，5% B；3 min，20% B；10 min，100% B；12 min，100% B；15 min，95% B；19 min，95% B。流速：0.4 mL·min-1；進(jìn)樣量1 μL；柱溫45 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)520 nm。

質(zhì)譜條件：正離子掃描 (ESI+，質(zhì)荷比50～1 000)，毛細(xì)管電壓2.0 kV；錐孔電壓 40 V；錐孔氣流量50 L·h-1；霧化氣流量900 L·h-1；離子源溫度115 ℃；霧化氣溫度450 ℃。利用Mass Lyn×v4.1軟件分析質(zhì)譜結(jié)果。

1.5 花色苷組分的定量分析

分別以矢車菊素3-O-葡萄糖苷(cyanidin 3-O-glucoside)、飛燕草素3-O-葡萄糖苷(delphinidin 3-O-glucoside)、錦葵素3-O-葡萄糖苷(malvidin 3-O-glucoside)、芍藥花素3-O-葡萄糖苷(peonidin 3-O-glucoside)、牽?；ㄋ?-O-葡萄糖苷(petunidin 3-O-glucoside)為標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析[8]，表示為每克花瓣重量對(duì)應(yīng)苷元的毫克數(shù)。校準(zhǔn)曲線如下。

矢車菊素類糖苷響應(yīng)值(mAU)= 38 562×[Cy(mg·mL-1)]+15 766，R2=0.996 7

飛燕草素類糖苷響應(yīng)值(mAU)= 21 920×[Dp(mg·mL-1)]-1 090.9，R2= 0.999 3

錦葵素類糖苷響應(yīng)值(mAU)=46 634×[Mv(mg·mL-1)]-10 094，R2= 0.999 6

芍藥花素類糖苷響應(yīng)值(mAU)= 58 894×[Pe(mg·mL-1)]+8 123.1，R2= 0.997 9

牽?；ㄋ仡愄擒枕憫?yīng)值(mAU)= 58 072×[Pt(mg·mL-1)]-4 332.3，R2= 0.999 7

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

使用Microsoft Office Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、分析及作圖，利用SPSS statistics 24軟件進(jìn)行方差及顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 花色描述與測(cè)定結(jié)果

表1顯示，根據(jù)RHSCC比色結(jié)果，Y1、Y3、Y4三個(gè)株系的花瓣顏色屬于紅色系(red group)，Y2、Y6、Y7三個(gè)株系屬于紫紅色系(red-purple group)，Y5屬于紫色系(purple group)。7個(gè)映山紅花色在CIE表色系統(tǒng)坐標(biāo)系上分布廣泛，亮度L*值介于47.94～68.38之間，紅綠屬性a*值的范圍介于29.25～49.84之間，黃藍(lán)屬性b*值介于-14.44～29.44之間，彩度C*值的范圍為29.25～55.56之間，色相角h*值的范圍為-89.36°～88.62°之間。由紅綠屬性a*、黃藍(lán)屬性b*值可以得知，映山紅是一個(gè)包含紅色系、紫紅色系在內(nèi)的，色度在紫色到紅色區(qū)間內(nèi)變化的顏色群體。

表1 7個(gè)映山紅株系花色的描述與測(cè)定值Table 1 Description and determination of petal coloration of 7 lines R. simsii

2.2 花色苷總量的測(cè)定結(jié)果

采用pH示差法測(cè)定各株系花瓣的花色苷總量，結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1可知，紅色系的Y1、Y3、Y4的花色苷總量相對(duì)較高。其中，Y4花色苷總量最高，達(dá)到了207.1 mg·g-1FW，是Y5的10倍左右。紫紅色系的Y2花色苷總量最少，僅為23.2 mg·g-1FW，輔助色素可能參與了其花瓣的顯色[9]。

圖1 7個(gè)映山紅株系花瓣花色苷總量Fig.1 Total anthocyanins content in petals of 7 lines of R. simsii

2.3 花色苷組分的定性分析結(jié)果

表2顯示，利用Acquity I-class超高效液相色譜和VION離子淌度四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀在7個(gè)映山紅株系花瓣中共檢測(cè)出5種苷元，13種花色苷。通過(guò)對(duì)各個(gè)組分質(zhì)譜分子離子和特征離子分析，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)樣品，測(cè)定出5種苷元，分別為：矢車菊素(cyanindin，簡(jiǎn)稱Cy)、飛燕草素(delphindin，簡(jiǎn)稱Dp)、錦葵素(malvidin，簡(jiǎn)稱Mv)、芍藥花素(peonidin，簡(jiǎn)稱Pe)、牽?；ㄋ?petunidin，簡(jiǎn)稱Pt)。確定了其中11種花色苷分別為：矢車菊素3-O-葡萄糖苷、飛燕草素3-O-阿拉伯糖苷、矢車菊素3-O-半乳糖苷、錦葵素3-O-葡萄糖苷、矢車菊素3-O-阿拉伯糖苷、芍藥花素3-O-葡萄糖苷、芍藥花素3-O-阿拉伯糖苷、錦葵素3-O-阿拉伯糖苷、牽?；ㄋ?-O-葡萄糖苷、牽?；ㄋ?-O-阿拉伯糖苷、飛燕草素3-O-葡萄糖苷[8,10-15]。其中第12、13兩種物質(zhì)是未能直接確定的花色苷。其中12號(hào)物質(zhì)的二級(jí)質(zhì)譜碎片質(zhì)荷比為303.049 4與Dp一致，質(zhì)荷比為465.102 5的碎片離子為Dp加1個(gè)六碳糖而成，結(jié)合光譜數(shù)據(jù)推定其為飛燕草素六碳糖苷。第13號(hào)物質(zhì)的二級(jí)質(zhì)譜碎片質(zhì)荷比為301.070 1與Pe一致，質(zhì)荷比為463.123 7的碎片離子為Pe加1個(gè)六碳糖而成，結(jié)合光譜數(shù)據(jù)推定其為芍藥花素六碳糖苷。這兩種花色苷的具體結(jié)構(gòu)仍需進(jìn)一步鑒定[16]。

2.4 花色苷組分的定量分析結(jié)果

從表3可以看出，除了株系Y2外，其他各株系中都含有矢車菊素類糖苷。在紅色系的3個(gè)株系Y1、Y3、Y4中，以Cy糖苷和Pe類糖苷為主，Y1、Y4 Cy類糖苷比例分別占96%、97%；Y3 Cy類糖苷比例為44%，Pe類糖苷比例為30%。在紫紅色系的3個(gè)株系中，以Dp類糖苷和Mv類糖苷為主，Y2 Dp類糖苷為41%、Mv類糖苷55%；Y6、Y7 Cy類糖苷分別為25%、26%，Dp類糖苷分別為52%、64%；除此之外，Y6、Y7還含Pt類糖苷比例分別為23%、10%。紫色系的Y5除了含有Cy類糖苷(15%)與Pe類糖苷(4%)，還含有Dp類糖苷(40%)、Pt類糖苷(38%)、Mv類糖苷(3%)。根據(jù)表3中結(jié)果可知，紅色系株系主要以Cy類糖苷和Pe類糖苷為主，紫紅系株系以Cy類糖苷、Mv類糖苷、Dp類糖苷為主，而紫色系主要為Dp類糖苷、Pt類糖苷。此外，偏紫色系的株系比紅色系株系的花色苷種類更多。Mizuta等[17]在分析杜鵑花花色時(shí)也發(fā)現(xiàn)，紫色花瓣中的花色素苷組成(2～6種花色素)比紅色花瓣(2～4種花色素)更加多樣化。由于芍藥花素3-O-阿拉伯糖苷、牽?；ㄋ?-O-阿拉伯糖苷、飛燕草素3-O-葡萄糖苷響應(yīng)值太低，表3中不計(jì)入。

表2 映山紅花色苷結(jié)構(gòu)的鑒定Table 2 Identification of anthocyanin structure of R. simsii

表3 映山紅花色苷組分的組成及定量分析Table 3 Composition and quantitative analysis of anthocyanin components of R.simsii

2.5 花色與花色苷的關(guān)系

表4結(jié)果顯示，映山紅花瓣亮度L*與花色苷量總量(TA)呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。紅綠屬性a*與TA無(wú)顯著相關(guān)性關(guān)系(P>0.05)；而黃藍(lán)屬性b*值、C*和h*分別與TA呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)。表明花色苷量總量越高，花瓣的亮度越低，彩度越高。表5中回歸分析結(jié)果也說(shuō)明了這一點(diǎn)。在各個(gè)花色苷中，Cy類糖苷含量與L*呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，與TA、a*、b*、C*、h*都呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)。說(shuō)明Cy含量越高，花瓣亮度越低；花瓣越紅，彩度越高。Mv類糖苷與Pt類糖苷含量與黃藍(lán)屬性b*值和h*值均呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.01)。表明Mv、Pt含量越高，花瓣越偏藍(lán)。從表5 中方程也可以看出，映山紅花瓣的紅綠屬性a*、黃藍(lán)屬性b*與Cy、Pe呈正相關(guān)關(guān)系，與Dp、Pt、Mv呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。表明Cy、Pe含量越高，花瓣越紅，彩度越高；Dp、Pt、Mv含量越高，花瓣越偏藍(lán)，彩度越低，這一點(diǎn)與Du等[8]的研究結(jié)論相似。

3 討論

本研究通過(guò)分析映山紅不同株系的花色苷組分發(fā)現(xiàn)，偏紫色系株系的花色苷組成比紅色系花瓣更具多樣性，并且紫色系個(gè)體的a*和b*值在CIEL*a*b*坐標(biāo)中比在紅色系中的a*和b*值分布更廣泛。不同色系花瓣花色苷總含量差異很大，紅色系花色苷總含量的平均值為104.25 mg·g-1FW，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于紫紅色系(34.11 mg·g-1FW)和紫色系(22.2 mg·g-1FW)。說(shuō)明紅色花瓣中花色苷含量高，可能是花瓣存在某些轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)花色素生物合成途徑或關(guān)鍵基因[18]。

Asen等[10]在對(duì)杜鵑花色苷的研究中采用薄層色譜檢測(cè)到矢車菊素苷元、芍藥花素苷元、錦葵素苷元；Mizuta等[18]采用HPLC法檢測(cè)到飛燕草素苷元和矮牽牛花素苷元；Liu等[5]研究了10種來(lái)自西藏的杜鵑花瓣花色苷，檢測(cè)到了矢車菊素苷元及錦葵素苷元。在本研究中共檢測(cè)出了5種苷元，分別為矢車菊素苷元、飛燕草素苷元、錦葵素苷元、芍藥花素苷元、牽牛花素苷元；發(fā)現(xiàn)了13種花色苷，鑒定出了11種。其中，矢車菊素3-O-阿拉伯糖苷、矢車菊素3-O-葡萄糖苷、矢車菊素3-O-半乳糖苷、飛燕草素3-O-阿拉伯糖苷、飛燕草素3-O-葡萄糖苷與前人對(duì)于杜鵑屬花瓣花色苷種類檢測(cè)結(jié)果一致[10,16]；錦葵素3-O-阿拉伯糖苷、錦葵素3-O-葡萄糖苷、牽?；ㄋ?-O-葡萄糖苷、芍藥花素3-O-葡萄糖苷、芍藥花素3-O-阿拉伯糖苷和牽?；ㄋ?-O-阿拉伯糖苷6種花色苷為首次在杜鵑屬植物花瓣中檢測(cè)到，但在杜鵑花科藍(lán)莓果實(shí)中曾有過(guò)報(bào)道[11,13-15]。

表4 映山紅花色與花色苷的相關(guān)性分析Table 4 Relative correlation analysis between flower colors and anthocyanins of R. simsii

表5 映山紅花色與花色苷的回歸分析Table 5 Regression analysis between flower colors and anthocyanins of R. simsii

本研究中線性回歸與相關(guān)性分析顯示，映山紅花瓣的亮度L*與紅綠屬性a*之間有極顯著相關(guān)性，這與Liu等[5]的研究結(jié)果一致。并且a*與Cy類糖苷、Pe類糖苷含量呈正相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明Cy類糖苷、Pe類糖苷含量越高，花瓣顏色越紅。此外，Dp類糖苷、Mv類糖苷和Dp素類糖苷含量與b*呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明這3類糖苷含量越多，花瓣越呈現(xiàn)藍(lán)色。這與Liu等[5]的研究結(jié)果一致。

花瓣中花色苷的種類和含量受相關(guān)基因的控制[18]。因此，研究映山紅不同株系間花色苷生物合成途徑中的結(jié)構(gòu)基因和(或)調(diào)節(jié)基因在表達(dá)水平上的差異，可以進(jìn)一步從分子水平上闡明映山紅花瓣呈色機(jī)理，為相關(guān)的育種工作提供科學(xué)依據(jù)。