棉花耐旱耐鹽堿生理和分子機制研究進展

馬盼盼, 趙曾強, 祝建波, 孫國清

(1.新疆農墾科學院生物技術研究所, 作物種質創(chuàng)新與基因資源利用兵團重點實驗室, 新疆 石河子 832000；2.石河子大學生命科學學院, 新疆 石河子 832003；3.中國農業(yè)科學院生物技術研究所, 北京 100081)

隨著全球氣候變化，非生物環(huán)境因素對植物生長影響日趨嚴重，其中低溫、干旱和鹽堿是影響農作物生長、發(fā)育和產量的主要非生物脅迫因素[1-3]。棉花作為重要的經濟作物和紡織原料，是不可或缺的戰(zhàn)略儲備物資。然而，土壤鹽堿化和水資源短缺等生態(tài)環(huán)境問題造成棉花產量下降及品質變差，已成為制約棉花可持續(xù)發(fā)展的重要因素[4-5]。利用現(xiàn)代分子育種技術提高棉花抗逆性是解決棉花抗逆育種的有效途徑。棉花基因組的測序完成以及高通量測序技術的發(fā)展為棉花耐旱耐鹽等抗逆基因的功能及其分子機制提供了極大便利。研究者通過分子生物學技術和手段分離鑒定獲得了大量的耐旱耐鹽堿相關基因，并對其抗逆分子機理進行了探索。本文主要從干旱和鹽堿對棉花的影響，棉花對干旱、鹽堿脅迫的形態(tài)適應性、生理調節(jié)和分子機制，轉基因耐旱、耐鹽堿棉花材料的抗逆性研究進展等方面進行了闡述，以期為后續(xù)棉花抗旱耐鹽堿基因工程研究提供理論參考。

1 干旱、鹽堿對棉花生長發(fā)育的影響

干旱脅迫嚴重影響棉花的生長發(fā)育，如株高、葉片干重、葉面積指數(shù)、果節(jié)數(shù)、纖維品質、冠層及根系生長等[5]。水分脅迫下，不同棉花品種的凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導度及水勢顯著降低[6-7]。王俊娟[8]對41份陸地棉材料干旱脅迫處理前后的農藝性狀和纖維品質指標進行了比較和分析，結果表明，全生育期干旱處理條件下，41份陸地棉的株高、果枝數(shù)、單株成鈴數(shù)均有不同程度的降低，平均值均極顯著降低，說明這些農藝性狀容易受到干旱脅迫的影響。干旱脅迫使纖維品質變劣，表現(xiàn)為纖維長度極顯著降低，整齊度極顯著下降，麥克隆值極顯著升高，斷裂比強度極顯著降低，伸長率極顯著升高。

棉花雖然具有一定的耐鹽性，但是不同品種間的耐鹽性差異較大，而且同一品種具有生育階段差異性。當土壤含鹽量在0.2%～0.3%時，出苗困難；當土壤含鹽量在0.4%～0.5% 時，種子不能出土；當土壤含鹽量大于0.65%時，種子很難發(fā)芽[9]。鹽脅迫可引起棉花形態(tài)和一系列生理變化，葉片和根干重、根長、根直徑、葉綠素和脯氨酸含量、凈光合速率和氣孔導度降低[10]。長期鹽脅迫可導致棉花長勢下降，出葉速度減慢，果枝數(shù)減少，現(xiàn)蕾、開花、結鈴推遲，花鈴期縮短，蕾鈴脫落增加，產量降低[4]。鹽脅迫對棉花衣分、纖維長度影響不大，對纖維細度、強度、成熟度影響較大，棉鈴發(fā)育受到抑制，纖維素含量降低，導致棉鈴及纖維發(fā)育不充分[11]。

2 棉花耐旱、耐鹽堿機制

棉花是耐鹽性較強的農作物，其耐鹽能力與鹽分類型、棉花品種、棉花不同生長階段等因素有關。當遭遇干旱和高鹽脅迫時，棉花自身會從生長習性與結構方面適應脅迫環(huán)境。也可通過離子區(qū)域化分布、滲透調節(jié)物質合成與積累、膜脂過氧化清除系統(tǒng)等一系列生理生化調節(jié)機制來適應或抵抗干旱和高鹽等非生物脅迫。

2.1 棉花耐旱、耐鹽堿的形態(tài)學適應機制

植物與其生長環(huán)境是一個統(tǒng)一的整體，在長期的共生過程中形成了適應性的形態(tài)建成，適應性的形態(tài)結構、生理生化特征。最初的棉花耐旱性研究集中在棉花根系的系統(tǒng)結構和形態(tài)生理研究方面，主要通過提高根系吸收水分的能力來減輕干旱抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，干旱條件下，棉花的根系長度增加，但根系直徑變小[12]，根密度增加，側根數(shù)增加[13]，根系分布受到影響。除根系外，植物還會在干旱前期調整氣孔的開度和葉片形態(tài)特征，以此來減少水分的散失[6-7]。

棉花因土壤鹽分類型、基因型、生長發(fā)育階段、器官組織的不同而表現(xiàn)出不同的耐鹽性。研究發(fā)現(xiàn)，棉花對土壤中各種鹽分的敏感程度依次為MgSO4>MgCl2>Na2CO3>Na2SO4>NaCl > NaHCO3[14]。種屬間耐鹽性差異也較大，4個栽培種中非洲棉和海島棉的耐鹽材料較多，陸地棉耐鹽材料次之，亞洲棉中耐鹽材料極少[15]，這與各自的起源和遺傳背景有關。戴海芳等[16]通過對17份棉花品種的耐鹽性評價研究發(fā)現(xiàn)，與鹽敏感品種相比，強耐鹽棉花品種幼苗在鹽脅迫下相對電導率較低，凈光合速率、葉綠素含量、葉面積和鮮重則能保持較高水平，且其幼苗真葉面積可達其他類別品種的近 2 倍。強耐鹽棉花品種幼苗葉片在鹽堿環(huán)境中受到傷害較輕，能保持較高的真葉面積和光合能力，有利于提高植株耐鹽能力和光合產物積累，降低土壤中離子毒害，增強植株耐鹽性。棉花不同生育階段的耐鹽性差異較大，王俊娟等[17]研究發(fā)現(xiàn)，萌發(fā)出苗期是鹽敏感期，隨著生育期的延長，棉花的耐鹽性逐漸提高。

2.2 棉花耐旱、耐鹽堿的生理生化調節(jié)機制

2.2.1棉花體內離子區(qū)隔化分布及離子平衡

研究表明，不同植物在鹽脅迫下的耐鹽機理存在差異。鹽脅迫下，棉花體內以Na+為主要毒害因子[18]，耐鹽性不同的棉花根、莖、葉內Na+積累量存在顯著差異。相同NaCl濃度處理下，耐鹽材料根中的Na+含量高于地上組織器官，而地上組織能維持相對較高的K+、Ca2+、Mg2+含量和較低的Na+/K+，表明根系能積累一部分的Na+，從而減輕Na+對地上組織的損傷[19-20]。這說明棉花品種的耐鹽性是通過鹽分在地上部的區(qū)隔化分布實現(xiàn)的。鹽離子在細胞內的區(qū)域化分布也是植物耐鹽的重要機理。鹽脅迫條件下，Na+在細胞內超量積累，而耐鹽品種則具有將Na+液泡區(qū)域化和Na+外排能力來降低Na+在細胞質中的濃度[21]。Wu等[22]克隆出了液泡膜上Na+/ H+逆向轉運蛋白基因，通過轉基因的方法證明棉花的耐鹽性與GhNHX1基因的表達有關?？梢?，棉花也可能存在將Na+離子排出胞外或將Na+區(qū)隔化到液泡中等離子的區(qū)域化分布機制。

2.2.2滲透調節(jié) 干旱和高鹽等脅迫條件均能導致植物細胞水分虧缺，誘發(fā)滲透脅迫，造成根系細胞脫水，葉片萎蔫，進而影響植物的生理功能。植物細胞主要通過無機離子和小分子有機物質的積累、運轉及區(qū)域化等機制解除滲透脅迫[23]。這些有機物質如脯氨酸、甘氨酸、甜菜堿、甘露醇、海藻糖等，有助于保護蛋白質和膜免受干旱脅迫下高濃度無機離子和氧化損傷的損害[24]。近年來，研究者將滲透調節(jié)物質脯氨酸、甜菜堿、甘露醇、海藻糖等合成途徑關鍵酶基因轉入棉花，證明這些小分子物質在棉花耐旱、耐鹽堿中具有重要作用[25-27]。轉膽堿脫氫酶基因 (betA) 棉花中甘氨酸甜菜堿積累使得植株的光合作用提高，相對含水量增加，滲透調節(jié)能力增強，膜脂過氧化降低，離子滲透率降低，進而增強棉花的抗旱能力[28]。過表達基因GhAN1可通過增強超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性及脯氨酸和可溶性糖的含量來提高棉花的抗旱耐鹽能力[29]。因此，滲透調節(jié)也是棉花耐旱、耐鹽堿的重要機制之一。

2.2.3抗氧化脅迫 植物在正常新陳代謝活動中和逆境環(huán)境條件下均會產生活性氧，在正常條件下，活性氧可以激活轉錄因子，促進細胞分裂和分化。當干旱和鹽脅迫出現(xiàn)時，植物體內便會產生和積累大量的活性氧，進而破壞很多生物學過程[30]。植物在長期進化中形成了能清除氧化活性的酶系和抗氧化物質來抵抗氧化脅迫[31]。抗氧化酶類有超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(peroxidase, POD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)、谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase, GR)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GPX)、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbic peroxidase, APX)。非酶類抗氧化物質有維生素、輔酶Q、還原型谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)等。研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化酶和非酶類抗氧化物質在活性氧清除過程中協(xié)同工作[32]。起初，抗氧化防衛(wèi)系統(tǒng)研究集中在酶促活性方面，為了解釋不同環(huán)境脅迫誘導的氧化脅迫響應的抗氧化保護機制，研究者對SOD、POD、APX及CAT 等酶進行大量研究?？寡趸富蚬δ艿难芯繛橹参锟寡趸佬l(wèi)系統(tǒng)的研究開啟了思路。棉花中18個SOD基因在不同非生物脅迫下的表達模式研究顯示，SOD 基因家族在活性氧清除中具有重要作用[33]。過表達基因GhSOD1和GhCAT可增強棉花的耐鹽能力[34]。

2.3 棉花耐旱、耐鹽堿分子機制研究進展

關于棉花耐旱、耐鹽堿分子機制研究，主要通過抗逆相關的基因克隆和功能解析來實現(xiàn)。耐旱、耐鹽堿是由多基因控制的數(shù)量性狀，其生理、生化過程是基因相互作用、共同調節(jié)的結果，涉及多條信號傳導途徑。

2.3.1ABA信號途徑 干旱脅迫主要引起滲透脅迫，而鹽脅迫則同時對細胞造成滲透脅迫和離子毒害。因此，干旱脅迫和鹽脅迫有各自獨立和一些共同的信號轉導機制。干旱和鹽脅迫的一個重要特征是滲透脅迫信號能夠引起植物激素脫落酸 (abscisic acid, ABA) 的累積，進而引起植物的適應性反應[35]。與其他植物一樣，棉花對ABA信號的感知和信號轉導有ABA依賴和ABA非依賴兩條途徑介導[36]。ABA依賴信號途徑在各種脅迫條件，尤其是在滲透脅迫下應答基因的表達中起關鍵作用。ABA受體是ABA信號轉導的重要元件。正常條件下，ABA水平很低，蔗糖非酵解相關蛋白激酶2 (SnRK2) 的活性被蛋白磷酸酶2C(PP2C) 抑制。當植物遭受干旱、鹽堿等脅迫刺激時，ABA與受體PYL結合并激活PP2C，形成ABA-PYL-PP2C三元復合體，使得SnRK2s從PP2Cs的結合中釋放出來[37]。釋放的SnRK2s通過自身磷酸化激活，并磷酸化下游的鉀離子通道蛋白和ABF/bZIP等轉錄因子使它們被激活，從而調節(jié)脅迫誘導基因的表達、氣孔的開閉和離子轉運等[38]。

近年來，棉花中也進行了ABA受體蛋白PYL、蛋白激酶SnRKs和蛋白磷酸酶PP2C基因的相關研究。Chen等[39]在陸地棉中鑒定了27個ABA受體蛋白PYL，研究結果顯示，棉花PYL基因可能參與干旱/滲透脅迫響應；陳云[40]通過轉錄組分析，在棉花中分離鑒定了一個PP2C家族基因GhDRPP1(CotAD_18479)，該基因受干旱脅迫誘導表達，進一步研究結果表明，GhDRPP1蛋白可能通過參與脫落酸及赤霉素信號通路等多種激素信號轉導途徑，影響氣孔關閉、光合作用等，從而在棉花干旱脅迫應答中起負調控作用；Liu 等[41]在陸地棉基因組中鑒定獲得了20個SnRK2基因，一些基因對干旱、高鹽及ABA處理在轉錄水平上響應；Bello等[42]在陸地棉中克隆了1個蔗糖非酵解型蛋白激酶SnRK2基因，超表達該基因的擬南芥植株表現(xiàn)出了耐旱性和耐鹽性。

2.3.2MAPK信號途徑 在植物長期進化過程中，形成了適應環(huán)境脅迫的一系列分子調控網絡，如，脅迫識別、信號傳導及脅迫相關基因的表達等。MAPK(mitogen-activated protein kinase)信號級聯(lián)途徑將細胞外信號刺激轉導至細胞內，從而引起相應的生理生化反應，在適應過程中起重要的樞紐作用。一個MAPK盒至少包含MAPKKK、MAPKK和MAPK三種蛋白激酶，它們之間通過磷酸化順序激活[43]。大量研究表明，MAPK級聯(lián)信號途徑廣泛參與干旱、高鹽等多種非生物脅迫信號途徑。近年來，研究者在棉花中也克隆鑒定了一些耐旱耐鹽堿MAPK途徑基因。Li 等[44]利用同源克隆的方法在陸地棉中克隆了2個MAPK基因，GhMPK6a和GhMPK20，其上游激活基因為GhMKK4，且轉基因煙草對高鹽和干旱的敏感性增強。GhMPK2轉基因植株的耐鹽性獲得提高，主要表現(xiàn)在滲透調節(jié)物質脯氨酸含量升高[45]?；騁hMP3K40的過表達植株的種子萌發(fā)時期對鹽和干旱的耐受性提高，轉基因植株中抗逆相關基因DREB、AREB、Osmotin和抗氧化系統(tǒng)被激活，表明該基因正調控防衛(wèi)反應，但是通過負調控生長和發(fā)育來降低對生物和非生物脅迫的耐受性，且該基因與GhMPKK4、GhMPK4和WRKY10互作[46]。Wang等[47]通過轉錄組、過表達以及RNAi基因GhMKK3研究干旱脅迫下棉花MAPK信號途徑的具體調控機制，結果表明，GhPIP1和GhMPK7是GhMKK3的下游作用基因，在煙草中過表達GhMKK3能促進根生長和ABA誘導的氣孔關閉，耐旱性獲得提高，而沉默該基因之后，植株對干旱更加敏感。蛋白激酶基因GhCIPK6被鹽、干旱和ABA處理誘導，過表達該基因的擬南芥植株耐旱性、耐鹽性增強[48]。

2.3.3轉錄因子 植物中參與耐旱、耐鹽堿的轉錄因子主要有AP2/ERF、WRKY、MYB、bZIP、NAC、鋅指蛋白等類型，這些轉錄因子已在棉花中證明具有抗旱耐鹽堿功能。過表達bZIP類轉錄因子GhABF2能夠提高轉基因棉花植株的耐旱、耐鹽堿能力[49]。GhWRKY17參與ABA信號途徑、干旱和高鹽反應[50]，GhWRKY41受干旱和鹽脅迫誘導[51]。植物中的MYB蛋白多數(shù)屬于R2R3-MYB亞家族，在控制植物發(fā)育、生物和非生物脅迫應答等過程中發(fā)揮著重要作用。Chen等[52]通過病毒誘導的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)和過量表達轉基因煙草研究R2R3-MYB轉錄因子基因GbMYB5在抗旱脅迫中的功能及其相應機制，闡明MYB轉錄組因子在植物抗旱脅迫中的作用及其調控機制。李付廣團隊根據(jù)水分脅迫下的轉錄組數(shù)據(jù)和實時定量PCR從亞洲棉中獲得了2個能提高棉花抗旱和耐鹽能力的 R2R3-MYB 轉錄因子基因GaMYB62L和GaMYB85，過表達GaMYB62L和GaMYB85的擬南芥株系種子在鹽脅迫和滲透脅迫條件下均表現(xiàn)出較高的種子萌發(fā)率；且過表達這 2 個基因都可以增強植株對干旱和鹽脅迫的耐受性[53-54]。

雖然己有較多分子生物學方面的報道，但是仍然無法全面闡述棉花耐旱、耐鹽分子機理，因此，深入研究棉花耐旱耐鹽響應機理與其他植物的耐旱、耐鹽特性之間的共性，有助于利用分子生物學的方法提高棉花的耐旱、耐鹽性。同時，近年來，隨著棉花基因組的測序完成以及高通量測序技術的發(fā)展，將為棉花耐旱、耐鹽分子機理和功能基因研究提供極大便利。

3 轉基因耐旱、耐鹽堿棉花

我國科學家在耐旱、耐鹽堿改良等抗逆性狀轉基因棉花研究方面取得了很大進展，鑒定克隆獲得了大批優(yōu)良的耐旱、耐鹽基因；篩選出了能夠運用于大規(guī)模農桿菌介導轉化的棉花受體材料，并建立了大規(guī)模農桿菌介導棉花遺傳轉化體系；對基因槍轟擊、花粉管通道介導、莖尖或芽尖轉化、農桿菌液浸染和納米載體花粉介導等不同轉化技術進行了探索。通過各種轉化途徑將優(yōu)異耐旱、耐鹽基因導入棉花中，獲得了耐旱、耐堿性提高的棉花材料(表1)，為深入研究棉花耐旱、耐鹽堿分子機制奠定了基礎，同時也為棉花耐旱、耐鹽堿育種提供了新的種質材料。從表1可知，用于遺傳轉化獲得耐旱、耐鹽棉花材料的基因主要來自其他一些耐旱、耐鹽性較強的物種，而棉花自身的耐旱、耐鹽基因轉化案例相對比較少。耐旱、耐鹽堿基因主要有轉錄因子、滲透保護和滲透調節(jié)蛋白、氧化脅迫及水分脅迫相關蛋白、參與離子區(qū)域化的Na+/H+逆向轉運蛋白等。研究者主要以當?shù)刂髟云贩N為受體材料，通過農桿菌介導轉化法和花粉管通道介導轉化法，獲得不同基因的耐旱耐鹽材料，這些材料可以作為后續(xù)遺傳育種材料。

4 展望

隨著生物技術的發(fā)展，研究者從分子水平上分析生物與環(huán)境之間的關系，挖掘優(yōu)異基因，利用基因工程手段結合傳統(tǒng)育種方法，培育出了大量性狀和性能改善的農作物新品種。與傳統(tǒng)育種方式相比，通過基因工程手段引入外源基因來改變植物性狀，從而使獲得棉花新品種的方法更加便捷。我國科學家在棉花抗蟲、抗除草劑、抗旱耐鹽堿、抗病以及纖維品質改良等性狀分子改良方面取得重大成果，尤其是轉基因抗蟲、抗除草劑棉花新品種的獲得和大規(guī)模應用。然而，基因工程技術受目前研究水平的限制，基因插入的隨機性、多拷貝性、表達的不穩(wěn)定性，以及對受體材料基因型的依賴性，使得轉基因植物的效果和期望值之間存在一定差距。雖然在棉花耐旱耐鹽堿等非生物脅迫研究方面取得了很大進步，但是仍存在很多亟待解決的問題。

一是對棉花耐旱耐鹽堿等非生物逆境脅迫的分子機制研究還不夠透徹。由于植物的耐鹽、耐旱等非生物脅迫是由多基因控制的數(shù)量性狀，其生理生化過程是基因相互作用、共同調節(jié)的結果。盡管已從棉花或其他抗逆性較強的生物資源中分離鑒定了許多抗逆相關基因，但真正具有應用價值的基因還很少。且棉花抗旱耐鹽堿基因工程研究多集中在單個基因功能研究方面，對改變棉花體內抗逆信號傳導途徑及所涉及的代謝網絡缺乏系統(tǒng)性研究，因此，很難全面揭示棉花的抗逆分子機理。棉花基因組測序已經完成,通過整合比較轉錄組學、定量蛋白質組學、表型組學及全基因選擇育種技術，分析鑒定抗旱耐鹽堿SNP標記、抗旱耐鹽堿關鍵基因及其調控途徑，全面解析棉花抗旱耐鹽堿的分子機制。同時，利用多基因聚合手段，實現(xiàn)基因抗性的疊加。

二是外源基因在轉基因棉花中能否表達，以及在其后代材料中是否能夠穩(wěn)定遺傳是轉基因棉花抗逆研究的關鍵。目前，研究獲得的轉基因棉花主要是通過花粉管通道法和農桿菌介導轉化法獲得的。這兩種轉基因技術尚無法實現(xiàn)外源基因定點、定量插入棉花受體材料基因組中，且外源基因向子代傳遞的過程中容易產生基因丟失、沉默、重組及擴增等現(xiàn)象，導致外源基因的表達不穩(wěn)定，轉基因植株的抗性水平與預期存在一定差距。

三是對棉花種質資源的抗旱、耐鹽堿缺乏系統(tǒng)地鑒定與評價。目前，棉花抗旱耐、鹽堿種質資源鑒定以實驗室、旱棚和鹽池為主，而對實際田間生產環(huán)境下的選標準及精準鑒定方面缺乏系統(tǒng)性研究。因此，需要廣大研究人員廣泛收集、整理抗旱耐鹽堿棉花種質資源，在不同生態(tài)植棉區(qū)進行全生育期精準鑒定，制定棉花抗旱耐鹽堿進準鑒定技術指標和體系。同時，整合多組學技術、全基因組選擇技術，分離鑒定抗旱耐鹽堿關鍵基因。利用回交轉育、分子標記輔助育種及分子聚合育種手段創(chuàng)制適合不通過生態(tài)區(qū)域的抗旱耐鹽堿棉花材料，為棉花抗旱耐鹽堿改良育種提供優(yōu)異種質資源。