安徽省茶樹(shù)細(xì)菌性梢枯病病原鑒定

張雷 汪霞 李相漢 貢長(zhǎng)怡 張立新

摘要 ：2017年-2018年在安徽省廬江、東至縣茶園種植區(qū)發(fā)現(xiàn)一種茶樹(shù)新病害——梢枯病，發(fā)病癥狀表現(xiàn)為頂芽枯死，嫩葉葉柄變褐，葉片枯萎。為明確廬江、東至縣茶樹(shù)梢枯病的病原菌，采用平板劃線法和稀釋涂布平板法分離病原，按照柯赫氏法則對(duì)病原細(xì)菌進(jìn)行致病性測(cè)定，并利用細(xì)菌的表型特征和分子生物學(xué)技術(shù)確定病原菌的分類地位。結(jié)果表明，從茶樹(shù)患病葉片和莖干分離到菌落形態(tài)一致的細(xì)菌菌株共16株，選擇6株代表性菌株進(jìn)行回接試驗(yàn)，確定獲得的細(xì)菌分離物為該病害的致病菌;通過(guò)對(duì)測(cè)試菌株的生理生化試驗(yàn)、16S rDNA 和16S23S rDNAITS的序列分析，以及基于16S rDNA、16S23S rDNAITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，將安徽省茶樹(shù)梢枯病的病原菌鑒定為燕麥?zhǔn)人峋帑渷喎NAcidovorax avenae subsp. avenae。

關(guān)鍵詞 ：茶樹(shù); 梢枯病; 鑒定; 燕麥?zhǔn)人峋?/p>

中圖分類號(hào)：

S 435.711文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019627

Identification of the pathogen Acidovorax avenae subsp. avenae causing shoot blight of Camellia sinensis

ZHANG Lei， WANG Xia， LI Xianghan， GONG Changyi， ZHANG Lixin*

（College of Plant Protection， Anhui Agricultural University， Hefei 230036， China）

Abstract ：A new shoot blight disease of tea plant was found in several tea plantations located in Lujiang and Dongzhi counties of Anhui province from 2017 to 2018. Symptoms initially appeared on the young shoot with watersoaked spots， and then the spots merged into large patches when the disease further developed. Symptoms of young leaf blight could be observed three weeks later. In order to clarify the pathogen associated with the tea shoot blight， the isolates were recovered from diseased samples and determined by using phenotypic characteristics combined with molecular identification. The results showed that 16 bacterial colonies with white color were consistently isolated from symptomatic leaves and stems， and six representative isolates were selected and confirmed to be the causal agent of this disease according to the Kochs postulates. The pathogen was further identified as Acidovorax avenae subsp. avenae based on the physiological and biochemical tests， sequence analysis of 16S rDNA and 16S23S rDNA internally transcribed spacer region， along with phylogenic analysis of 16S rDNA and 16S23S rDNAITS sequences from the tested isolates and reference strains of Acidovorax spp.

Key words ：Camellia sinensis; shoot blight; identification; Acidovorax avenae subsp. avenae

茶樹(shù)原產(chǎn)于中國(guó)，為多年生常綠木本植物，多分布于亞熱帶和熱帶地區(qū)。茶樹(shù)作為一種重要的經(jīng)濟(jì)作物被廣泛種植，且是世界上最受歡迎的飲料作物[1]。中國(guó)是最早開(kāi)始種植茶樹(shù)的國(guó)家之一，種植的茶樹(shù)品種類型多樣，跨越多個(gè)省份。安徽省兼具南北氣候特點(diǎn)，其茶園種植區(qū)是中國(guó)重要的茶區(qū)之一[2]。在茶樹(shù)生長(zhǎng)的過(guò)程中，茶樹(shù)的葉和芽會(huì)受到許多病害的影響，包括炭疽病、白星病、云紋葉枯病、芽枯病[34]。近年來(lái)，隨著茶園面積不斷擴(kuò)大、氣候環(huán)境的改變，一些新的病害逐漸增加并被發(fā)現(xiàn)[5]。2017年-2018年，在安徽省茶園種植區(qū)（廬江和東至縣）發(fā)現(xiàn)一種新病害—梢枯病，該病害發(fā)生在一年生枝條的嫩梢，病害初期在嫩葉的葉柄部位有褐色壞死斑，隨著病害的發(fā)展，壞死斑沿葉片基部向上擴(kuò)展成大的褐色壞死斑塊，同時(shí)嫩梢表現(xiàn)為頂芽枯死，這嚴(yán)重影響了茶葉的采收。該病害可發(fā)生在茶園不同茶樹(shù)品種上。本文通過(guò)病原菌分離、致病性試驗(yàn)以及病原細(xì)菌的表型特征和分子鑒定，明確了引起安徽省茶樹(shù)梢枯病的病原種類，從而為該病害的流行學(xué)監(jiān)測(cè)和綜合防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病害癥狀觀察

2017年-2018年在安徽省廬江和東至縣茶園中，采集具有茶樹(shù)梢枯病典型癥狀的患病枝條和葉片（‘福鼎大白茶‘安吉白茶‘皖茶91和‘龍井43），觀察并記錄病害癥狀。

1.2 病原菌的分離純化

選取頂梢發(fā)病茶樹(shù)枝條，剪下病健交界處的發(fā)病組織，經(jīng)0.1%升汞2 min，75%乙醇表面消毒30 s，無(wú)菌水沖洗3次后，剪碎病組織，加入無(wú)菌水制成帶菌的病組織懸浮液，靜置5～10 min。采用平板劃線法和稀釋涂布平板法[6]在NA平板上進(jìn)行細(xì)菌分離，將平板置于（28±0.5）℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)24 h，待細(xì)菌菌落長(zhǎng)出后，選取細(xì)菌單菌落進(jìn)行純化，純化后的菌株保存于試管斜面和30%甘油中備用。

1.3 致病性測(cè)定

將代表性菌株在NA培養(yǎng)基上活化48 h，用無(wú)菌水配制濃度108cfu/mL的細(xì)菌懸浮液，采用注射法接種‘福鼎大白茶品種的健康離體枝條。接種前茶樹(shù)枝條采用75%乙醇進(jìn)行表面擦拭消毒，用無(wú)菌注射器將細(xì)菌懸浮液0.5 mL從供試茶樹(shù)品種葉柄和莖干交界部位注入，重復(fù)3次，無(wú)菌水接種‘福鼎大白茶為對(duì)照。于（28±0.5）℃、相對(duì)濕度大于90%人工氣候箱中培養(yǎng)。

1.4 病原菌表型試驗(yàn)

將代表性菌株接種于NA培養(yǎng)基上，（28±0.5）℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)48 h后，觀察菌落形態(tài)、質(zhì)地、大小、透明度及表面光滑程度等培養(yǎng)性狀。同時(shí)將測(cè)試菌株接種于煙草葉片，調(diào)查煙草產(chǎn)生過(guò)敏性壞死反應(yīng)情況。菌株部分生理生化性狀測(cè)試根據(jù)Schaad等[7]的方法進(jìn)行。

1.5 病原菌分子鑒定

用細(xì)菌基因組試劑盒提取代表性菌株的基因組DNA。利用16S rDNA引物fD1/rD1、16S23S rDNAITS引物1493f/23r[89]對(duì)菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物由上海英濰捷基有限公司合成。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠電泳上檢測(cè)，將獲得的目的片段送南京擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。測(cè)序序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http：∥www.ncbi.nlm.gov）中進(jìn)行BLAST同源性序列分析;同時(shí)挑選并下載嗜酸菌屬Acidovorax內(nèi)參考菌株的16S rDNA和16S23S rDNAITS序列，分別以睪丸酮叢毛單胞菌Comamonas testosteroni和唐菖蒲伯克霍爾德氏菌Burkholderia gladioli為外群，用MEGA 7.0的鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間病害癥狀

在茶園茶樹(shù)的發(fā)病枝條上，發(fā)病部位主要位于嫩梢，癥狀表現(xiàn)為頂芽枯死，嫩葉的葉柄變褐壞死，最終嫩梢的葉片凋萎脫落（圖1）。

2.2 致病性

本試驗(yàn)選擇了6株代表性細(xì)菌分離物進(jìn)行了致病性測(cè)定。結(jié)果表明，茶樹(shù)品種‘福鼎大白茶的離體枝條經(jīng)注射接種10 d后，接種部位明顯變褐色（圖2a），隨后壞死沿葉柄向葉尖部位延伸，同時(shí)向嫩梢上部擴(kuò)展;接種21 d后嫩梢上部莖干變褐，頂部葉片枯萎（圖2c），發(fā)病癥狀與田間癥狀相同?！６Υ蟀撞杞臃N無(wú)菌水后，均未觀察到發(fā)病癥狀（圖2b～c），采用平板劃線法對(duì)發(fā)病的‘福鼎大白茶病組織進(jìn)行病原細(xì)菌的分離，經(jīng)對(duì)重新分離獲得菌株的表型和分子鑒定，確定與接種的細(xì)菌菌株一致。

2.3 病原菌的表型特征

采用平板劃線法和稀釋涂布法從茶樹(shù)發(fā)病組織中均分離到菌落形態(tài)一致的細(xì)菌菌落。細(xì)菌分離物在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h，菌落為乳白色、直徑0.5～1 mm、表面光滑。革蘭氏染色呈陰性，41℃能生長(zhǎng)，不水解淀粉，不產(chǎn)生吲哚;能利用吐溫80、檸檬酸鹽;氧化酶反應(yīng)、明膠液化等

測(cè)定結(jié)果為陰性，硝酸鹽還原測(cè)定結(jié)果均為陽(yáng)性;能利用葡萄糖、蔗糖、甘露醇作為碳源生長(zhǎng);對(duì)煙草能產(chǎn)生明顯的過(guò)敏性枯斑反應(yīng)（表1）。生理生化性狀測(cè)定結(jié)果與先前鑒定的燕麥?zhǔn)人峋帑渷喎NAcidovorax avenae subsp. avenae[1011]結(jié)果趨于一致。

2.4 病原菌分子鑒定

對(duì)選擇的6株代表性菌株進(jìn)行16S rDNA片段的 PCR擴(kuò)增，均得到長(zhǎng)度約1 410 bp的目的片段（GenBank登錄號(hào)MN480566、MN480567、MN480568、MN480563、MN480564、MN480565），測(cè)序菌株間的序列相似性為99.9%～100%。BLAST分析結(jié)果表明，6株菌株（WCY1、WCY2、WCY3、DLJ1、DLJ2和DLJ3）與A.avenae subsp. avenae G1（MH244342）和FC371（KJ210333）的序列同源性均分別為99.7%和99.8%。通過(guò)對(duì)測(cè)試菌株的16S23S rDNAITS進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，得到目的片段長(zhǎng)度約為695 bp的序列（GenBank登錄號(hào)MN490642、MN649181、MN649182、MN490641、MN649183和MN649184）。BLAST分析結(jié)果表明，6株菌株與A.avenae subsp. avenae FC143（DQ360420）的序列同源性為97.2%～97.9%。進(jìn)一步將本研究的6個(gè)測(cè)試菌株分別與嗜酸菌屬內(nèi)近緣種參考菌株的16S rDNA和16S23S rDNAITS序列進(jìn)行聚類分析。結(jié)果表明，測(cè)試菌株均與A.avenae subsp. avenae的參考菌株緊密地聚在同一分支，其自展支持率均高于70%（圖3，4）。結(jié)合表型特征試驗(yàn)以及基于16S rDNA和16S23S rDNAITS的聚類分析，確定引起茶樹(shù)梢枯病的病原菌為A.avenae subsp. avenae。

3 討論

本文通過(guò)對(duì)安徽省茶園發(fā)生的茶樹(shù)梢枯病害的病原分離和鑒定，結(jié)果表明該病害是由A.avenae subsp. avenae侵染引起，這是該病原菌所致茶樹(shù)梢枯病在安徽省內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)。A.avenae subsp. avenae是一種重要的植物病原菌，其寄主范圍廣泛，包括玉米、水稻、高粱、燕麥、甘蔗等多種植物[1114]。由該細(xì)菌引起的茶樹(shù)梢枯病目前僅在我國(guó)廣西茶區(qū)發(fā)現(xiàn)，且僅限于‘英紅4號(hào)品種[15]。 2017年在安徽省茶園病害調(diào)查發(fā)現(xiàn)，茶樹(shù)梢枯病在多個(gè)茶樹(shù)品種中均有發(fā)生，包括‘安吉白茶‘龍井43‘福鼎大白茶‘皖茶91。同時(shí)有‘白毫早‘中茶102 等27個(gè)茶樹(shù)品種未見(jiàn)該病害發(fā)生。筆者在室內(nèi)致病性測(cè)定中發(fā)現(xiàn)，分離獲得的病原細(xì)菌A.avenae subsp. avenae也可引致‘名山白毫‘舒茶早 品種發(fā)病，而對(duì)‘浙農(nóng)117‘鐵觀音‘鄂茶5號(hào)等5個(gè)茶樹(shù)品種未表現(xiàn)出明顯的致病性。這暗示了不同茶樹(shù)品種對(duì)病原細(xì)菌A.avenae subsp. avenae的抗病性可能存在顯著差異。因此，關(guān)于茶樹(shù)梢枯病在我國(guó)不同茶區(qū)以及不同茶樹(shù)品種上的發(fā)生情況有待于進(jìn)一步深入調(diào)查，從而為明確該病害的發(fā)生流行條件及采用抗病育種防治病害策略提供科學(xué)的理論依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：田 喆）