PoprL啟動(dòng)子對(duì)丁香假單胞菌DC3000合成冠菌素的影響

何彥, 姜峰, 于莎, 于春欣, 譚偉明, 李召虎, 張杰, 段留生*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 植物生理生化國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 教育部植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑工程研究中心， 北京 100193； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院， 北京 100193；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所， 植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100193)

冠菌素(coronatine，COR)是由丁香假單胞菌等幾個(gè)致病變種產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，是一種具有生物活性的天然化合物[1]。COR化學(xué)結(jié)構(gòu)由冠菌酸(coronafacic acid, CFA)和冠烷酸(coronamic acid, CMA)兩部分組成[2]。在丁香假單胞菌DC3000中，生物合成CMA和CFA是獨(dú)立的：CMA的生物合成來源于L-異亮氨酸，由CmaA的非核糖體肽合成酶腺苷酸結(jié)構(gòu)域激活；CFA由環(huán)戊酮化合物合成，隨后由CFA操縱子基因進(jìn)行修飾；冠狀連接酶cfl是CFA操縱子內(nèi)九個(gè)開放閱讀框之一，它以酰胺鍵連接CFA和CMA，形成COR[3-4]。研究表明，COR廣泛參與植物的生理和生化過程，包括乙烯釋放、花青素產(chǎn)生、生長(zhǎng)素合成和生物堿積累[5-8]。低濃度COR可以增強(qiáng)植物的抗逆性，包括棉花耐鹽性[9]、大豆和花椰菜抗旱性[10-11]、小麥熱逆性[12]和黃瓜耐冷性[13]。由于能夠調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)、發(fā)育和對(duì)脅迫的反應(yīng)，COR及其衍生物被認(rèn)為是農(nóng)業(yè)化學(xué)應(yīng)用中有潛力的目標(biāo)化合物，包括開發(fā)新型除草劑[14-15]。

啟動(dòng)子在基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)調(diào)控中具有極其重要的作用，是核酸序列分子上RNA聚合酶和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子等識(shí)別并結(jié)合從而形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的區(qū)域。目前，常見的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄模式為3種：組成型表達(dá)啟動(dòng)子、組織/器官特異性表達(dá)啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型表達(dá)啟動(dòng)子[16]。組成型啟動(dòng)子在不同的培養(yǎng)條件下強(qiáng)弱穩(wěn)定；誘導(dǎo)型啟動(dòng)子則在特定的培養(yǎng)條件下啟動(dòng)基因表達(dá)[17]。在代謝工程中，常常需要表達(dá)外源基因或者調(diào)控內(nèi)源基因表達(dá)來影響代謝產(chǎn)物的合成，因此啟動(dòng)子的選擇對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控至關(guān)重要，它能夠影響基因的轉(zhuǎn)錄水平，影響人工合成途徑或本源途徑中各基因間的協(xié)調(diào)性，繼而影響菌株的代謝功能和產(chǎn)物[18]。

研究表明，利用高效表達(dá)型啟動(dòng)子可以提高微生物中代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。王欣然[19]在鏈霉菌中利用高效啟動(dòng)子5063p與格爾登素PKS啟動(dòng)子置換，對(duì)PKS基因進(jìn)行定向過表達(dá)，發(fā)酵代謝產(chǎn)物格爾登素的產(chǎn)量提高了39%。在菌株M.echinosporaz中啟動(dòng)子PermE*通過同源重組替換，表達(dá)具有催化慶大霉素合成功能的基因kanJ和kanK，代謝產(chǎn)物慶大霉素的產(chǎn)量由85 μg·mL-1提高到了342 μg·mL-1[20]。在釀酒酵母中，通過啟動(dòng)子改造等方法，得到了不同程度產(chǎn)D-乳酸的工程菌株，最高產(chǎn)量達(dá)到了5.8 g·L-1[21]。在冠菌素異源表達(dá)菌株P(guān)seudomonasputidaKT2440中，采用依賴于σ70的組成型啟動(dòng)子PrpsH替換原始啟動(dòng)子可使冠菌素合成的前體物質(zhì)冠菌酸(CFA)產(chǎn)量提高10倍[22]。cfl基因在DC3000中的轉(zhuǎn)錄活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于PG4180，相對(duì)應(yīng)的冠菌素產(chǎn)量在PG4180中更高，在PG4180中冠菌素產(chǎn)量是DC3000冠菌素產(chǎn)量的25～40倍。此外，cfl的轉(zhuǎn)錄水平也受溫度的影響，在18 ℃時(shí)的轉(zhuǎn)錄活性高于28 ℃時(shí)的轉(zhuǎn)錄活性。這些結(jié)果表明，cfl基因啟動(dòng)子的活性會(huì)影響冠菌素的生物合成[23-24]。

啟動(dòng)子PoprL來自于惡臭假單胞菌肽聚糖相關(guān)脂蛋白(peptidoglycan-associated lipoprotein)編碼基因oprL，研究表明，oprL基因啟動(dòng)子-35區(qū)和-10區(qū)很保守，與σ70識(shí)別的啟動(dòng)子具有很高的相似性，用該啟動(dòng)子在大腸桿菌中表達(dá)β-半乳糖苷酶，表達(dá)效率很高[25]。為了提高丁香假單胞菌DC3000冠菌素產(chǎn)量，改善高溫發(fā)酵培養(yǎng)條件對(duì)菌株冠菌素產(chǎn)量的制約影響，本研究將高效表達(dá)組成型啟動(dòng)子PoprL同源重組到丁香假單胞菌DC3000冠菌素合成基因cfl中，研究啟動(dòng)子PoprL對(duì)冠菌素生物合成產(chǎn)量和發(fā)酵培養(yǎng)條件的影響，所得研究結(jié)果不僅為冠菌素高產(chǎn)工程菌的構(gòu)建和發(fā)酵條件的優(yōu)化提供新的思路和參考，而且也為冠菌素的工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用提供更多的選擇和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒 研究中出發(fā)菌株為丁香假單胞菌番茄致病變種Pseudomonassyingaepv.tomatoDC3000，該菌株為產(chǎn)COR野生型菌株，具有Amp和Rif抗性；菌株P(guān)seudomonasputidaAB92019，含PoprL啟動(dòng)子野生型菌株，具有Cb抗性；質(zhì)粒pUCP24/recTE，含有recTE基因重組質(zhì)粒載體，具有Gen抗性；質(zhì)粒pKD4，含卡那抗性基因載體，均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2培養(yǎng)基 菌株培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 10.0 g，用蒸餾水溶解后定容至1.0 L，并調(diào)節(jié)pH 7.2左右。

種子液培養(yǎng)基為MG培養(yǎng)基：甘露醇10.0 g，L-谷氨酸鈉2.0 g，KH2PO40.5 g， NaCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，用蒸餾水溶解后定容至1.0 L，調(diào)節(jié)pH至7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：NH4Cl 1.0 g、K2HPO43.6 g、KH2PO44.1 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、KNO30.3 g，用890 mL蒸餾水溶解后調(diào)節(jié)pH至6.8，121 ℃滅菌30 min，接種前加入單獨(dú)滅菌的2 mmol·L-1FeCl310 mL，過濾除菌的20%(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))葡萄糖溶液100 mL。

菌株轉(zhuǎn)化子的篩選和重組菌株的培養(yǎng)所使用抗生素的終濃度為：卡那霉素(Kanamycin, Kan)50 μg·mL-1；慶大霉素(Gentamicin, Gen)10 μg·mL-1。

固體培養(yǎng)基的配制為在上述培養(yǎng)基中加入1.5%(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))的瓊脂粉。

擬南芥種子培養(yǎng)基：1/2 MS培養(yǎng)基、0.8%(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))瓊脂粉、1%(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))蔗糖，pH 5.8～6.0，滅菌備用。

1.1.3主要試劑 PCR所用試劑、DNA Marker均購自大連TaKaRa公司，PCR引物由上海生工生物工程公司合成，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)和質(zhì)粒提取試劑盒均購自天根生化科技有限公司(北京)。RNA提取試劑盒和RT-qPCR試劑盒均購于康為世紀(jì)公司。冠菌素標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma 試劑公司(美國(guó))，色譜甲醇購自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司，石油醚、乙酸乙酯均購于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1啟動(dòng)子重組菌株的構(gòu)建 挑取菌株P(guān)seudomonasputidaAB92019和PstDC3000單菌落于LB培養(yǎng)基，28 ℃，180 r·min-1搖床培養(yǎng)12 h以上，利用天根細(xì)菌基因組試劑盒提取PseudomonasputidaAB92019和丁香假單胞菌PstDC3000 總DNA。利用同源重組方法[26]構(gòu)建重組菌株，以葉婷[27]報(bào)道的PoprL啟動(dòng)子引物序列，并結(jié)合NCBI上PstDC3000基因組序列信息設(shè)計(jì)SOE-PCR融合基因引物(表1)。以PseudomonasputidaAB92019基因組DNA為模板，引物CO1/CO2擴(kuò)增PoprL啟動(dòng)子片段，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，56 ℃ 退火45 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)?；厥?62 bp目的片段；以pKD4質(zhì)粒為模板，引物CO3/CO4擴(kuò)增卡那抗性基因，反應(yīng)程序中PCR退火溫度57 ℃ 45 s，延伸時(shí)間1 min，30個(gè)循環(huán)，回收795 bp目的片段。采用SOE-PCR方法進(jìn)行PoprL啟動(dòng)子片段與卡那基因融合，PCR擴(kuò)增分為兩步：第一步將上述回收的兩個(gè)目的片段既為模板又為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，退火溫度58 ℃ 3 min，延伸時(shí)間90 s，13個(gè)循環(huán)；再以此次PCR產(chǎn)物為模板，引物CO1/CO4進(jìn)行第二步PCR擴(kuò)增，退火溫度58℃ 45 s，延伸時(shí)間90 s，30個(gè)循環(huán)，回收得到1 157 bp融合片段。按照上述同樣的方法進(jìn)行cfl基因啟動(dòng)子上游同源臂片段532 bp(引物CO5/CO6)和cfl基因啟動(dòng)子下游同源臂片段532 bp(引物CO7/CO8)擴(kuò)增與融合，最終回收得到 2 221 bp融合目的片段。將質(zhì)粒pUCP24/recTE電擊轉(zhuǎn)化到PstDC3000感受態(tài)中。轉(zhuǎn)化條件：脈沖場(chǎng)強(qiáng)V為12.5 kV·cm-1, 電容C為25 μF，阻抗R為200 Ω，脈沖時(shí)間G為4 ms。Gen抗性篩選轉(zhuǎn)化子得到含有pUCP24/recTE重組質(zhì)粒的PstDC3000菌株，再將回收得到的2 221 bp融合目的片段電擊轉(zhuǎn)化到含有pUCP24/recTE重組質(zhì)粒的DC3000菌株中，Kan抗性篩選轉(zhuǎn)化子，PCR擴(kuò)增鑒定，擎科公司測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.2冠菌素的提取和檢測(cè) 出發(fā)菌株P(guān)stDC3000與重組菌株MG固體培養(yǎng)基平板劃線，培養(yǎng)箱28 ℃培養(yǎng)。挑選出發(fā)菌株P(guān)stDC3000與重組菌株單菌落至MG液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至種子液OD600達(dá)到1.0，將種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為2%(體積分?jǐn)?shù))，分別于18和28 ℃，180 r·min-1搖床培養(yǎng)10 d取樣。取1.5 mL發(fā)酵液于2 mL離心管中，調(diào)節(jié)pH 至2.5～2.9，8 000 r·min-1離心10 min，取上清1.0 mL于新離心管中，加入1.0 mL石油醚，震蕩20 s 后，靜置2 min，移除上層有機(jī)相后加入1.0 mL乙酸乙酯，震蕩萃取20 s后靜置2 min，將乙酸乙酯相轉(zhuǎn)移至新離心管中，重復(fù)萃取3次，自然風(fēng)干或氮?dú)獯蹈珊笕苡?.0 mL 甲醇即為待測(cè)樣品，用于冠菌素含量檢測(cè)[28]。冠菌素含量采用高效液相色譜法測(cè)定，高效液相色譜流動(dòng)相由甲醇和水(含0.5%的乙酸)按6.5∶3.5比例配成，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，流動(dòng)速度為1 mL·min-1，進(jìn)樣量為20 μL，樣品保留時(shí)間為30 min，并通過與冠菌素標(biāo)準(zhǔn)品峰面積比較確定冠菌素的含量。

1.2.3致病性檢測(cè) 選取同一生長(zhǎng)時(shí)期的擬南芥野生型Col-0分別接種PstDC3000和基因重組菌(菌液OD600≈0.01)，22 ℃、16 h光照培養(yǎng)，19 ℃、8 h 黑暗培養(yǎng)。使用1 mL去針頭的注射器從擬南芥葉片背面分別注入PstDC3000和基因重組菌菌液，同時(shí)將注射等量MgCl2溶液的擬南芥葉片作為對(duì)照，72 h后觀察發(fā)病情況。

1.2.4RNA提取和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)PstDC3000和基因重組菌分別接入發(fā)酵培養(yǎng)基，分別于18 和28 ℃，180 r·min-1搖床培養(yǎng)24和 48 h后收集菌體，按照康為世紀(jì) RNA pure Bacteria Kit說明書提取RNA，用Takara公司試劑 DNaseⅠ消化處理，并按照Takara PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit說明書進(jìn)行cDNA合成，用SYBR Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)，所用引物見表1。反應(yīng)體系為15 μL：SYBR?Premix ExTaqTM II(2×)7.5 μL，PCR Forward Primer(10 μmol·L-1)0.3 μL，PCR Reverse Primer(10 μmol·L-1)0.3 μL，ROX Reference Dye II(50×)0.3 μL，稀釋10 倍的cDNA 模板1.5 μL，ddH2O 5.1 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40 個(gè)循環(huán)； 95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s；95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s。

2 結(jié)果與分析

2.1 啟動(dòng)子基因重組菌株的獲得

以PseudomonasputidaAB92019總DNA為模板，用引物CO1和CO2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大小為362 bp的 PoprL啟動(dòng)子片段?；诨蛲粗亟M原理對(duì)cfl基因啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行替換，篩選到具有卡那霉素抗性的突變菌株，利用cfl基因啟動(dòng)子上、下游同源臂兩端位置引物CO5和CO8，對(duì)突變菌株目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為2 221 bp，將目的條帶回收測(cè)序，基因序列正確，說明成功構(gòu)建了含有PoprL啟動(dòng)子的重組菌株，命名為CO。

2.2 基因重組菌株生長(zhǎng)及其冠菌素產(chǎn)量情況

將基因重組菌株CO和出發(fā)菌株P(guān)stDC3000進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，對(duì)18 和28 ℃培養(yǎng)過程中菌株生物量(OD600)、發(fā)酵液pH以及發(fā)酵10 d后冠菌素產(chǎn)量進(jìn)行檢測(cè)。由菌株的生長(zhǎng)曲線(圖1)可以看出，在發(fā)酵培養(yǎng)1～2 d時(shí)，重組菌株CO的生長(zhǎng)速度在28 ℃培養(yǎng)條件下明顯高于出發(fā)菌株，能較快達(dá)到穩(wěn)定期，在18 ℃培養(yǎng)條件下與出發(fā)菌株相比沒有明顯差異，表明PoprL啟動(dòng)子在28 ℃培養(yǎng)條件下有促進(jìn)PstDC3000菌體生長(zhǎng)的作用。

圖1 重組菌株CO和出發(fā)菌株DC3000的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of recombination strain CO and original strain DC3000

從發(fā)酵液pH(圖2)來看，重組菌株CO與出發(fā)菌株相比，在18 ℃培養(yǎng)條件下差異明顯，出發(fā)菌株發(fā)酵液pH出現(xiàn)下降時(shí)間較早，而CO菌株發(fā)酵液pH下降緩慢且持續(xù)下降，在28 ℃培養(yǎng)條件下二者基本無差別。

圖2 重組菌株CO和出發(fā)菌株DC3000培養(yǎng)中pH變化情況Fig.2 Culture pH change of recombination strain CO and original strain DC3000

采用HPLC檢測(cè)發(fā)酵液中的冠菌素含量(圖3)，在18 ℃培養(yǎng)條件下，重組菌株CO冠菌素產(chǎn)量為15.21 mg·L-1，是出發(fā)菌株的1.8倍；在28 ℃培養(yǎng)條件下，重組菌株CO冠菌素產(chǎn)量為14.81 mg·L-1，是出發(fā)菌株冠菌素產(chǎn)量的4.1倍，由此可以看出，PoprL啟動(dòng)子能夠促進(jìn)丁香假單胞菌中冠菌素的生物合成表達(dá)。此外，在兩個(gè)不同培養(yǎng)溫度下，出發(fā)菌株冠菌素產(chǎn)量差異明顯，在18 ℃發(fā)酵條件下的冠菌素產(chǎn)量是28 ℃發(fā)酵條件下的2.4倍，表明出發(fā)菌株在高溫發(fā)酵條件下，冠菌素產(chǎn)量受到了明顯的抑制；而啟動(dòng)子PoprL重組菌株CO在兩個(gè)溫度發(fā)酵培養(yǎng)條件下產(chǎn)量沒有明顯差異。從而表明啟動(dòng)子PoprL能夠改善高溫對(duì)冠菌素產(chǎn)量的抑制作用。

圖3 重組菌株CO和出發(fā)菌株DC3000冠菌素產(chǎn)量Fig.3 Coronatine yield of recombination strain CO and original strain DC3000

2.3 基因重組菌株CO冠菌素合成調(diào)控相關(guān)基因qRT-PCR的檢測(cè)

將重組菌株和出發(fā)菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，于接種24 h和48 h時(shí)取樣，采用qRT-PCR檢測(cè)了菌株冠菌素合成過程中連接酶基因cfl、冠菌酸合成酶基因cfa1、冠烷酸合成酶基因cmaA和調(diào)控相關(guān)基因編碼合成組氨酸激酶基因corS、RNA聚合酶σ54因子rpoN、RNA聚合酶σ因子hrpL的相對(duì)表達(dá)量，以出發(fā)菌株DC3000表達(dá)量為參照。從圖4中可以看到，冠菌素合成基因cfl和基因cfa1表達(dá)量在24 h變化較小，在培養(yǎng)48 h時(shí)出現(xiàn)了明顯的上調(diào)，并且cfl在28 ℃發(fā)酵條件下表達(dá)量上調(diào)程度高于18 ℃，而cmaA基因表達(dá)量在重組菌組CO中受到了抑制，在檢測(cè)樣品中表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào)；冠菌素調(diào)控基因corS表達(dá)量在檢測(cè)樣品中都有上調(diào)現(xiàn)象，rpoN表達(dá)量在28 ℃時(shí)有明顯上調(diào)，hrpL表達(dá)量在28 ℃、48 h上調(diào)。這些結(jié)果表明啟動(dòng)子PoprL對(duì)基因cfl和cfa1有明顯的增強(qiáng)表達(dá)作用，對(duì)冠菌素合成調(diào)控基因表達(dá)促進(jìn)作用相對(duì)較小，在基因水平上驗(yàn)證了啟動(dòng)子PoprL對(duì)冠菌素生物合成的促進(jìn)作用。

2.4 重組菌株COR致病性檢測(cè)

COR處理的葉片組織中觀察到的主要癥狀是強(qiáng)烈的廣泛性黃化，這種現(xiàn)象可以在多種植物上誘導(dǎo)產(chǎn)生[29]。為了鑒定啟動(dòng)子重組菌株中COR生理活性，對(duì)菌株CO致病性進(jìn)行檢測(cè)。將出發(fā)菌株和啟動(dòng)子重組菌株CO分別注射接種擬南芥野生型Col-0，72 h后觀察兩株菌株的致病性，結(jié)果(圖5)表明，注射 MgCl2對(duì)照的葉片并沒有出現(xiàn)萎黃現(xiàn)象；在接種野生型PstDC3000的擬南芥葉片中出現(xiàn)了明顯的萎黃現(xiàn)象；接種啟動(dòng)子重組菌株CO的葉片中也出現(xiàn)了明顯的萎黃現(xiàn)象。這些結(jié)果進(jìn)一步表明，在出發(fā)菌株啟動(dòng)子替換之后，PoprL啟動(dòng)子能夠成功啟動(dòng)冠菌素生物合成基因的表達(dá)。

圖4 重組菌株CO冠菌素合成調(diào)控相關(guān)基因qRT-PCR檢測(cè)Fig.4 qRT-PCR detection of coronatine synthesis and regulator genes in recombination strain CO

3 討論

目前，COR主要以微生物菌株發(fā)酵的方式獲得，在Pseudomonassyringaepv.glycinea4180發(fā)酵生產(chǎn)中，COR產(chǎn)量最佳溫度為18 ℃，而菌株培養(yǎng)最佳溫度為28 ℃;在低溫下進(jìn)行菌株冠菌素生產(chǎn)，會(huì)導(dǎo)致其發(fā)酵周期較長(zhǎng)，且消耗大量的能源，極大地加大了工業(yè)生產(chǎn)成本，因此溫度在一定程度上制約了COR發(fā)酵生產(chǎn)效率，從而限制了冠菌素的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用[30-31]。焦睿等[32]通過Tn5隨機(jī)誘變方法從874個(gè)突變株中篩選到2株28 ℃下產(chǎn)冠菌素菌株MFB132和MFB141，與出發(fā)菌株相比產(chǎn)量分別提高了19和21倍，但是插入位點(diǎn)和作用機(jī)制不明，推測(cè)其插入位點(diǎn)為溫度調(diào)控冠菌素生物合成的相關(guān)基因。Tn5隨機(jī)誘變由于插入位點(diǎn)不確定性，大大增加了菌株篩選工作量，且篩選效率相對(duì)較低。本研究通過定向的對(duì)啟動(dòng)子基因進(jìn)行重組改造，作用位點(diǎn)明確，所用方法便于篩選，并可以利用現(xiàn)有菌株資源構(gòu)建高產(chǎn)菌株以及開展機(jī)制研究。此外,COR生物合成中冠狀連接酶基因cfl的轉(zhuǎn)錄受溫度影響，在18 ℃的轉(zhuǎn)錄活性高于28 ℃。分析cfl基因啟動(dòng)子序列以及體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)COR合成前體CMA中cmaA基因和COR合成調(diào)控基因corS同樣受到溫度調(diào)控，且這些基因的啟動(dòng)子中存在受溫度調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄激活因子corR蛋白結(jié)合位點(diǎn)[24]。這些結(jié)果說明，溫度對(duì)啟動(dòng)子活性的調(diào)控作用影響了菌株中COR的生物合成表達(dá)，并且影響了COR最適產(chǎn)量溫度。因此，要想獲得高溫型產(chǎn)冠菌素菌株，應(yīng)從COR生物合成中受溫度調(diào)控的基因和啟動(dòng)子及其轉(zhuǎn)錄活性因子等方面開展工作。

A：Col-0注射MgCl2，CK；B：Col-0注射出發(fā)菌株DC3000；C：Col-0注射重組菌株COA: Col-0 injected with MgCl2, CK; B: Col-0 injected with DC3000; C: Col-0injected with CO圖5 出發(fā)菌株DC3000和基因重組菌株CO致病性檢測(cè)Fig.5 Symptom on Arabidopsis wild-type col-0 inoculated with DC3000 and CO

用PoprL啟動(dòng)子來表達(dá)惡臭假單胞菌 YMB001中g(shù)fp基因，分別于16、20、24、28和37 ℃下培養(yǎng)，對(duì)GFP表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)溫度對(duì)PoprL啟動(dòng)子活性基本沒有影響[27]。本研究表明,PoprL啟動(dòng)子重組菌株在18和28 ℃發(fā)酵培養(yǎng)條件下都能提高冠菌素的產(chǎn)量，對(duì)冠菌素生物合成表達(dá)具有促進(jìn)作用，并且啟動(dòng)子重組菌株28 ℃發(fā)酵條件下COR產(chǎn)量與18 ℃產(chǎn)量接近，表明溫度對(duì)其影響較小，而且在重組菌株中COR合成基因cfl和cfa1表達(dá)量明顯上調(diào)。因此，可以推測(cè)PoprL啟動(dòng)子中可能不存在受溫度調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性因子蛋白結(jié)合位點(diǎn)，而可能存在其他一些能夠調(diào)控COR合成的蛋白結(jié)合位點(diǎn)，這些需要我們進(jìn)一步進(jìn)行研究驗(yàn)證。

冠菌素是一種具有開發(fā)前景的新型植物調(diào)節(jié)劑，在常溫下利用丁香假單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)冠菌素的報(bào)道很少。本研究通過啟動(dòng)子同源重組替換，成功構(gòu)建了啟動(dòng)子重組菌株CO，在18 ℃發(fā)酵培養(yǎng)條件下，冠菌素產(chǎn)量是出發(fā)菌株1.8倍，達(dá)到了15.21 mg·L-1，在28 ℃培養(yǎng)條件下，冠菌素產(chǎn)量是出發(fā)菌株4.1倍，達(dá)到了14.81 mg·L-1，有效地改變了高溫下冠菌素產(chǎn)量低的現(xiàn)象。本研究工作不足之處在于重組菌株的產(chǎn)量還不足以用于規(guī)?；a(chǎn)應(yīng)用，還需進(jìn)一步深化改造來提高冠菌素產(chǎn)量，因此, 本研究中得到的重組菌株可為進(jìn)一步構(gòu)建冠菌素高溫高產(chǎn)菌株提供理論基礎(chǔ)，為開展冠菌素生物合成調(diào)控機(jī)理研究，為設(shè)計(jì)更有效的COR生物合成工程菌株和發(fā)酵生產(chǎn)工藝開辟新的思路和可能性。