桑葉活性成分的抑菌作用及穩(wěn)定性研究

成少寧，董文賓，2，藺毅峰，3，王莎莎，王琴琴

（1.運(yùn)城職業(yè)技術(shù)大學(xué) 健康學(xué)院，山西 運(yùn)城 044099；2.陜西科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 西安 710021；3.運(yùn)城學(xué)院 生命科學(xué)系，山西 運(yùn)城 044000）

新鮮果蔬營(yíng)養(yǎng)豐富，開胃助食，美味可口。我國(guó)果蔬產(chǎn)量雖大，但是歷來重視采前病蟲害防治，忽視采后的貯運(yùn)及防腐，加上果蔬本身的易腐性，導(dǎo)致我國(guó)的果蔬每年的采后腐爛損耗，幾乎可以滿足2億人口的基本營(yíng)養(yǎng)需求[1]。目前的果蔬防腐保鮮方法中物理法如冷藏投資大、能耗高，化學(xué)法如化學(xué)殺菌劑環(huán)境不友好，植物源抑菌劑具有低毒、無污染、廣譜抗菌性的優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用于果蔬的防腐保鮮成為當(dāng)前科研工作研究的熱點(diǎn)[2-4]。桑葉是?？浦参锏母稍锶~，藥食兩用，相關(guān)研究表明桑葉中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，并且含有多糖、生物堿、黃酮等多種生物活性成分，具有降血糖、抗高血脂、抗氧化、抗腫瘤、抗炎和保肝護(hù)肝的生理活性[5-7]。桑葉混合提取物對(duì)細(xì)菌有抑制作用[8-9]，具有植物源殺菌劑的潛力。目前的研究大都集中于對(duì)桑葉提取物這一混合物的抑菌作用研究，具體活性成分的抑菌作用比較還鮮有報(bào)道。桑葉多糖和黃酮大多為降血糖方面的研究，但是它們的降糖機(jī)制不同，還具有降血壓、抗衰老、增強(qiáng)免疫方面的功效[10-11]。桑葉生物堿也多為其生理活性方面的研究，其具有較好的抗氧化、抗炎[12-13]、預(yù)防高血脂、高血糖[14]方面的功效。本研究采用水提醇沉法、超聲輔助提取法及醇酸混合溶液提取法分別提取桑葉的多糖、黃酮及生物堿三種活性成分，采用牛津杯法研究桑葉活性成分的抑菌活性，并對(duì)桑葉黃酮的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）和抑菌的穩(wěn)定性進(jìn)行探討，為桑葉黃酮的深度開發(fā)和防腐保鮮方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

桑葉：學(xué)校有機(jī)試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)10月份（霜后）采摘。

1.1.2 化學(xué)試劑

氫氧化鈉、碳酸鈉、氯化鈉、葡萄糖（均為分析純）：廣州白云山光華制藥股份有限公司；無水乙醇（分析純）：西隴科學(xué)有限公司；鹽酸（分析純）：洛陽市化學(xué)試劑廠；蘆丁（純度98%）：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；4-羥基哌啶醇（純度99%）：北京百靈威科技有限公司；胰蛋白胨、酵母浸膏、瓊脂粉（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）、鏈格孢（Alternaria）、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）：中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC）；大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）：本學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.1.3 培養(yǎng)基

Luria-Bertani（LB）液體培養(yǎng)基：950 mL去離子水中加入胰蛋白胨10 g，酵母浸膏5 g，氯化鈉10 g，加熱溶解后用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)該培養(yǎng)基的pH達(dá)到7.0，用去離子水定容至1 L。121 ℃滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯去皮切塊稱取200 g，加水煮爛，用4層紗布過濾，濾液中加入15 g瓊脂粉加熱溶解，再加入葡萄糖20 g，攪拌均勻后補(bǔ)足水分至1 L。115 ℃滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖肉湯（potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)基：馬鈴薯去皮切塊稱取200 g，加水煮爛，用4層紗布過濾，加入葡萄糖20 g，攪拌均勻后補(bǔ)足水分至1 L。115 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9203A電熱恒溫干燥箱、GNP-9160隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；HH-501電子恒溫水浴鍋：常州翔天實(shí)驗(yàn)儀器廠；KQ2200v超聲波處理器：江蘇昆山超聲儀器有限公司；SC-3612低速離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；SHZ-28A恒溫振蕩培養(yǎng)箱：常州諾基儀器有限公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SW-CJ-2D超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；TUV30W紫外線殺菌燈：飛利浦電器科技集團(tuán)（中國(guó)）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 桑葉粉制備

采摘新鮮桑葉片去除雜質(zhì)和梗，自來水清洗干凈，干燥箱55～60 ℃干燥24 h，研磨成粉，過60目篩備用。

1.3.2 桑葉多糖提取及含量檢測(cè)

參照文獻(xiàn)[15]的方法提取桑葉干粉中多糖，提取溫度92 ℃、提取時(shí)間3.5 h、液料比34∶1（mL∶g），提取次數(shù)2次進(jìn)行熱水浸提，合并2次浸提液離心（4 000 r/min，20 min），濾液真空濃縮（溫度60 ℃）至一定體積，加入3倍體積無水乙醇醇沉，4 ℃放置過夜，離心（4 000 r/min，20 min）得沉淀物，-20 ℃預(yù)凍，冷阱溫度-65 ℃、60 h冷凍干燥成粉[15]。

采用文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和桑葉中的多糖含量檢測(cè)，得出葡萄糖溶液質(zhì)量濃度（x）與吸光度值（y）的回歸方程為y=2.994x+0.004，相關(guān)系數(shù)R2=0.993。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算桑葉多糖含量為0.639 mg/mL，得率為12.78 mg/g。

1.3.3 桑葉黃酮提取及含量檢測(cè)

桑葉粉與體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇按照料液比1∶20（g∶mL），80 ℃水浴2 h，再放入超聲波處理器中超聲處理35 min，然后過濾將濾渣再次提取一次，4 000 r/min離心20 min，上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)定容至50 mL[16]。

采用文獻(xiàn)[16]的方法進(jìn)行蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和桑葉中的總黃酮化合物含量檢測(cè)，得出蘆丁溶液質(zhì)量濃度（x）與吸光度值（y）的回歸方程為y=0.519x+0.005，相關(guān)系數(shù)R2=0.998。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算桑葉黃酮含量為0.848 mg/mL，得率為10.18 mg/g。

1.3.4 桑葉生物堿提取及含量檢測(cè)

取桑葉干粉5 g，按料液比1∶20（g∶mL）加入體積分?jǐn)?shù)為30%乙醇-0.025 mol/L鹽酸混合溶液，以提取溫度30 ℃，提取時(shí)間10 min，提取2次。提取液在室溫條件10 000×g轉(zhuǎn)速離心5 min，濾渣以同樣條件提取、離心，合并上清液，然后按活性碳：樣品質(zhì)量比為1∶2加入活性碳，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱220 r/min混勻1 h，取出抽濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至浸膏狀[17]，檸檬酸溶解浸膏調(diào)pH值至2.5，無水碳酸鈉調(diào)pH值至10.5，產(chǎn)生生物堿沉淀，離心（4 000 r/min，30 min），棄上清液，沉淀冷凍干燥成粉[18]，用0.05 mol/L鹽酸溶解定容至25 mL。

采用文獻(xiàn)[17]的方法進(jìn)行4-羥基哌啶醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和桑葉中的生物堿含量檢測(cè)。得出4-羥基哌啶醇溶液質(zhì)量濃度（x）與吸光度值（y）的回歸方程為y=5.662x-0.004，相關(guān)系數(shù)R2=0.994。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算桑葉生物堿含量為0.004 89 mol/L，得率為2.50 mg/g。

1.3.5 菌種活化及菌懸液的制備

將菌種（鏈格孢、擴(kuò)展青霉、灰葡萄孢）從安瓿管移至相應(yīng)的PDA試管斜面，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，傳代2～3代。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌先轉(zhuǎn)入LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，再轉(zhuǎn)入LB試管斜面培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，傳代2～3次。分別刮取試面斜面上的菌種入無菌生理鹽水中，并將其稀釋成1.0×106～1.0×108CFU/mL的菌懸液備用。

1.3.6 抑菌活性檢測(cè)

采用牛津杯法[19]，用無菌涂布棒將0.1 mL上述制備好的供試菌懸液涂布至相應(yīng)的無菌平板上，每個(gè)平板放置5個(gè)直徑為8.0 mm的無菌牛津杯，分別加入桑葉多糖（質(zhì)量濃度為15.98 mg/mL）、桑葉黃酮（質(zhì)量濃度為20.35 mg/mL）、桑葉生物堿（質(zhì)量濃度為3.75 mg/mL）、無菌水（桑葉多糖溶劑）、無水乙醇（桑葉生物堿溶劑）各0.2 mL，每種菌3組平行。放入4 ℃冰箱平衡2 h，細(xì)菌放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，真菌放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。取出平板測(cè)定其抑菌圈直徑，抑菌圈直徑＞8.0 mm表示其具有抑菌活性，抑菌圈直徑越大，表示其抑菌活性越強(qiáng)。

1.3.7 最小抑菌濃度

采用試管二倍稀釋法[20]測(cè)定供試菌株的最小抑菌濃度（MIC），在5個(gè)滅菌試管中分別加入LB培養(yǎng)液3 mL，取第1管加入黃酮原液3 mL，混勻后抽取3 mL加入第2管，依此類推，直到第5管抽取3 mL廢棄，在這5管加入供試菌液0.1 mL。另設(shè)一管為L(zhǎng)B培養(yǎng)液對(duì)照組，一管為黃酮提取液對(duì)照組，細(xì)菌置37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，真菌28 ℃下培養(yǎng)48 h后以不出現(xiàn)渾濁的最高藥物稀釋倍數(shù)為該藥的最小抑菌濃度（MIC）。

1.3.8 抑菌穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)[21]

（1）熱處理對(duì)桑葉黃酮抑菌效果的影響

采用抑菌圈法，將桑葉黃酮原液分別于40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃下，加熱20 min，考察桑葉黃酮對(duì)擴(kuò)展青霉和金黃色葡萄球菌的抑菌效果。每組做三個(gè)平行。

（2）pH對(duì)桑葉黃酮抑菌效果的影響

用1 mol/L的HCl或NaOH將2 g/mL的桑葉黃酮原液pH分別調(diào)節(jié)為5、7、9、11，以未經(jīng)處理的桑葉黃酮和相對(duì)應(yīng)pH的HCl或NaOH溶液作為對(duì)照，常溫平衡30 min后分別進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，用牛津杯法測(cè)量抑菌圈的直徑，比較pH對(duì)桑葉黃酮抑菌活性的影響。每組做三個(gè)平行。

（3）紫外線對(duì)桑葉黃酮抑菌效果的影響

在30 W紫外燈下將桑葉黃酮原液分別照射10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，分別進(jìn)行恒溫培養(yǎng)后測(cè)定其對(duì)擴(kuò)展青霉和金黃色葡萄球菌的抑菌活性，觀察在不同的紫外線照射時(shí)間下桑葉黃酮的抑菌效果。每組做三個(gè)平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葉活性物質(zhì)抑菌效果

由表1可知，桑葉的三種不同活性物質(zhì)對(duì)供試菌的抑菌效果不同，其中桑葉多糖對(duì)5種供試菌的抑菌圈直徑均為8.0 mm，表明均無抑制作用；桑葉黃酮對(duì)鏈鉻孢的抑菌圈直徑為8.0 mm，表明其無抑制作用，對(duì)其余的四種菌抑菌圈直徑均＞8.0 mm，表明均有抑制作用，并且抑菌圈直徑越大抑制效果越好，所以其抑制效果順序?yàn)椋航瘘S色葡萄球菌＞大腸桿菌＞擴(kuò)展青霉＞灰葡萄孢，其對(duì)細(xì)菌的抑制作用大于真菌，細(xì)菌中其對(duì)革蘭氏陽性菌的抑制作用大于陰性菌，這可能是因?yàn)殛栃跃c陰性菌不同的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的；桑葉生物堿對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑均＞8.0 mm，并且金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑大于大腸桿菌，表明桑葉生物堿對(duì)這兩種菌都具有抑制活性，抑制效果順序?yàn)椋航瘘S色葡萄球菌＞大腸桿菌，但對(duì)灰葡萄孢、擴(kuò)展青霉、鏈鉻孢三種真菌的抑菌圈直徑均為8.0 mm，均無抑制性，這與茄非食部分生物堿提取液對(duì)細(xì)菌和霉菌均具有良好的抑菌效果[22]和苦豆子生物堿浸提物對(duì)供試細(xì)菌和霉菌都有一定的抑制作用[23]的研究結(jié)果不一致，可能是因?yàn)椴煌参锲渖飰A的活性成分不同，具體機(jī)理還有待進(jìn)一步的研究。桑葉的三種活性成分中只有桑葉黃酮的抑制作用較為廣泛，因此選擇桑葉黃酮作進(jìn)一步研究。

表1 桑葉活性成分對(duì)常見腐敗菌的抑菌效果Table 1 Antimicrobial effect of active components from mulberry leaf on common spoilage bacteria

2.2 桑葉黃酮對(duì)供試菌的最小抑菌濃度

桑葉黃酮提取物對(duì)不同供試菌的最小抑菌濃度（MIC）結(jié)果見表2。由表2可知，桑葉黃酮提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度最低，為5.09 mg/mL；大腸桿菌其次，為10.18 mg/mL；灰葡萄孢和擴(kuò)展青霉的最小抑菌濃度最高，為20.35 mg/mL。最小抑菌濃度的大小進(jìn)一步反映出桑葉黃酮對(duì)各種供試菌的抑菌效力，MIC越低，抑菌效力就越強(qiáng)，測(cè)定結(jié)果與牛津杯法測(cè)定出的抑菌效果一致。

表2 桑葉黃酮對(duì)不同供試菌的最小抑菌濃度Table 2 Minimum inhibitory concentration of flavonoids from mulberry leaf to different tested bacteria

2.3 桑葉黃酮的抑菌穩(wěn)定性

2.3.1 熱處理對(duì)桑葉黃酮抑菌穩(wěn)定性的影響

不同溫度處理下的桑葉黃酮的抑菌結(jié)果見表3。

表3 不同溫度對(duì)桑葉黃酮抑菌穩(wěn)定性的影響Table 3 Effect of different temperature on the antibacterial stability of flavonoids from mulberry leaf mm

由表3可知，隨著處理溫度在40～100 ℃范圍內(nèi)的提高，桑葉黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌、擴(kuò)展青霉的抑菌圈直徑均無顯著性差異（P＞0.05），說明桑葉黃酮抑菌效果具有良好的熱穩(wěn)定性。

2.3.2 pH對(duì)桑葉黃酮抑菌穩(wěn)定性的影響

不同pH的桑葉黃酮的抑菌結(jié)果見表4。由表4可知，pH對(duì)桑葉黃酮的抑菌效果有影響，在酸性條件下桑葉黃酮對(duì)兩種菌的抑菌效果與未處理組相比無顯著差異（P＞0.05），但是堿性條件下與未處理組相比抑菌效果都顯著降低（P＜0.05）。原因可能為酸性條件下溶液中離子可以降低活性酚類物質(zhì)上的酚羥基的電離度，從而使其疏水性增加，易于與微生物表面的蛋白質(zhì)結(jié)合，從而有助于其發(fā)揮抑菌作用[24-25]。堿性條件下抑菌活性顯著降低，可能是由于堿性環(huán)境破壞了桑葉黃酮的結(jié)構(gòu)（或活性）[21]。因此，桑葉黃酮在酸性條件（pH5～7）下有良好的抑菌穩(wěn)定性。

表4 pH對(duì)桑葉黃酮抑菌穩(wěn)定性的影響Table 4 Effect of pH on the antibacterial stability of flavonoids from mulberry leaf mm

2.3.3 紫外線對(duì)桑葉黃酮抑菌穩(wěn)定性的影響

不同的紫外線照射時(shí)間對(duì)桑葉黃酮抑菌效果的影響見表5。紫外線不同的照射時(shí)間對(duì)金黃色葡萄球菌和擴(kuò)展青霉的抑菌效果均無顯著差異（P＞0.05），說明紫外線照射不能改變桑葉黃酮中的抑菌活性成分和其活性結(jié)構(gòu)，桑葉黃酮對(duì)于紫外線具有良好的穩(wěn)定性。

表5 紫外照射時(shí)間對(duì)桑葉黃酮抑菌穩(wěn)定性的影響Table 5 Effect of ultraviolet treatment time the antibacterial stability of flavonoids from mulberry leaf mm

3 結(jié)論

桑葉的三種活性成分對(duì)供試菌種抑菌效果結(jié)果表明，多糖對(duì)細(xì)菌和霉菌均無抑制作用，生物堿僅對(duì)細(xì)菌有抑制作用，桑葉黃酮的抑菌譜最廣，對(duì)細(xì)菌和霉菌均有抑制作用。桑葉黃酮的抑菌效果為細(xì)菌大于霉菌，革蘭氏陽性菌大于革蘭氏陰性菌。其對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為5.09 mg/mL，大腸桿菌為10.18mg/mL；灰葡萄孢和擴(kuò)展青霉為20.35mg/mL。

加熱處理和紫外線照射均對(duì)桑葉黃酮的抑菌圈直徑無顯著影響（P＞0.05），但是在pH5～11范圍內(nèi)會(huì)隨著pH的增加而抑菌效果降低，酸性條件對(duì)桑葉黃酮的抑菌效果沒有顯著影響（P＞0.05），這可為桑葉黃酮在食品加工或防腐保鮮方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

本研究中發(fā)現(xiàn)桑葉生物堿在抑制金黃色葡萄球菌方面具有非常突出的效果，將在下一步的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行進(jìn)一步的研究。