一株纖維素酶真菌的篩選鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

羅奉奉，付 躍，黃秀艷，黃文彬，陳慧珍，覃擁靈，3*

（1.河池學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 河池 546300；2.微生物及植物資源開發(fā)利用廣西高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 河池 546300；3.河池學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用研究中心，廣西 河池 546300）

地球上每年纖維素的產(chǎn)量約為2 000億t，如果不加以利用，不但會(huì)造成資源浪費(fèi)，還會(huì)污染環(huán)境。纖維素的處理與利用是解決糧食短缺、能源危機(jī)、環(huán)境污染和生態(tài)平衡等問題的有效途徑[1-3]。纖維素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難以分解，是制約其應(yīng)用的主要原因[4]，因此如何高效的利用纖維素成為研究熱點(diǎn)[5]。目前通常采用酸堿化處理等化學(xué)方法和汽爆及蒸汽加熱等物理手段降解纖維素，不僅成本高，而且對(duì)環(huán)境不友好[6-8]。纖維素酶能將纖維素水解成容易利用的單糖或寡糖，可作為動(dòng)物飼料使用，也可作為發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的原料，對(duì)解決能源問題具有重要意義。除此之外，纖維素酶廣泛應(yīng)用于造紙、紡織、食品等領(lǐng)域[9-10]。纖維素酶是一類多種酶相互協(xié)同作用的酶系，主要包括葡聚糖內(nèi)切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶，在這三類酶的協(xié)同作用下能夠?qū)⒗w維素降解為葡萄糖，葡聚糖內(nèi)切酶作用于纖維素的非結(jié)晶區(qū)，將纖維素切割成聚合度不同的短鏈纖維素；葡聚糖外切酶從短鏈纖維素的非還原端開始水解β-1,4糖苷鍵，釋放纖維二糖；最后在β-葡萄糖苷酶的作用下將纖維二糖水解為葡萄糖[11-12]。

高產(chǎn)纖維素酶菌株少，因此篩選高產(chǎn)纖維素酶產(chǎn)生菌成為研究熱點(diǎn)。微生物蘊(yùn)含豐富的纖維素酶資源，研究表明，能夠分泌纖維素酶的微生物主要為真菌，包括木霉屬（Trichoderma），青霉屬（Penicillium），曲霉屬（Aspergillus）和根霉屬（Rhizopus）等[10]，雖然真菌比細(xì)菌生長(zhǎng)周期長(zhǎng)[13]，且易污染，但其酶系較全。因此，本研究以原始森林土壤樣品為材料，經(jīng)初篩、復(fù)篩，成功篩選到一株高產(chǎn)纖維素酶產(chǎn)生真菌，并進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，且通過單因素和正交試驗(yàn)確定最佳產(chǎn)酶條件，為木質(zhì)纖維素的高效利用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

土壤樣品：采集自廣西環(huán)江縣原始森林腐爛木材下的土壤；甘蔗渣：南寧糖業(yè)股份有限公司東江糖廠。

1.1.2 化學(xué)試劑

羧甲基纖維素鈉（carboxymethyl cellulose-Na，CMC-Na）（分析純）：山東西亞化學(xué)股份有限公司；剛果紅（分析純）：中國(guó)遠(yuǎn)航試劑廠；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）（分析純）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒、DNA Marker：天根生化科技（北京）有限公司；四水酒石酸鉀鈉（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；whatman一號(hào)濾紙：天津歐杰科技有限公司；微晶纖維素（分析純）、水楊苷（分析純）：成都格列普生物科技有限公司；瓊脂粉（生化試劑）：北京索萊寶生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：削皮馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂15 g/L，水1 000 mL，pH自然。115 ℃滅菌30 min。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨0.5 g/L，酵母膏4.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，瓊脂10 g/L，水1 000 mL。121 ℃滅菌20 min。

篩選培養(yǎng)基：CMC-Na 2 g/L，（NH4）2SO42 g/L，K2HPO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NaCl 0.5 g/L，水1 000 mL，瓊脂15 g，pH自然。121 ℃滅菌20 min。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：按質(zhì)量分?jǐn)?shù)配制40 g，蔗渣15%，麩皮10%，Mandels營(yíng)養(yǎng)鹽液75%。115 ℃滅菌30 min。

Mandels營(yíng)養(yǎng)鹽液：（NH4）2SO41.4 g/L，KH2PO42 g/L，CaCl20.3 g/L，MgSO4·7H2O 3 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 5 mg/L，MnSO41.6 mg/L，CoCl22.0 mg/L，ZnCl21.7 mg/L，蒸餾水1 000 mL。115 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

AYP124電子天平：日本島津公司；SW-CJ-1F潔凈工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；J-E冷凍離心機(jī)：美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；HWS-24電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DW-86L388A海爾醫(yī)用低溫保存箱：青島海爾特種電器有限公司；BCD-322WRM2MPCA冰箱：廣東海信冰箱營(yíng)銷有限公司；EasyCycler梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國(guó)AnalytikJena公司；DYCP-31DN電泳儀：北京六一生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 初篩

將采集的土樣用研缽研細(xì)，準(zhǔn)確稱量10 g土樣于裝有90 mL無菌水的250 mL三角瓶中，置于28 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)30 min，梯度稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，取10-3、10-4、10-5、10-6梯度各100 μL涂布于以羧甲基纖維素鈉為唯一碳源的篩選平板上，置于30 ℃的生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)7 d。用接種環(huán)挑取菌落在PDA平板上劃線，于28 ℃的生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3 d，每個(gè)梯度做3個(gè)平行。用無菌牙簽挑取單菌落接種于新的篩選平板上，于28 ℃生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3 d。待長(zhǎng)出菌落后用0.2%的剛果紅溶液染色30 min，再用1 mol/L NaCl溶液脫色15 min，測(cè)定水解圈直徑與菌落的直徑，并計(jì)算其比值（H值）。從中選取H值較大的菌株進(jìn)行復(fù)篩[14]。

將初篩得到的菌種劃線分離至PDA平板上，倒置于30℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)4 d。菌種成熟后接種于PDA斜面中，同樣條件下培養(yǎng)4 d，待菌株成熟后于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹15]。

1.3.2 復(fù)篩

取PDA斜面，用10 mL生理鹽水將菌體洗下，取1 mL菌懸液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于30 ℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，每天早晚各翻動(dòng)一次，每株菌做3個(gè)平行。發(fā)酵完成后向三角瓶中加入200 mL無菌水，40 ℃恒溫水浴1 h，4層紗布過濾，將濾液在6 000 r/min，4 ℃的條件下離心10 min，上清液即為粗酶液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 分析檢測(cè)

根據(jù)文獻(xiàn)[16-17]測(cè)定粗酶液葡聚糖內(nèi)切酶酶活、β-葡萄糖苷酶酶活和濾紙酶活。

葡聚糖內(nèi)切酶酶活測(cè)定：采用0.02 mol/L的pH4.8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制1%CMC-Na為底物，測(cè)定內(nèi)切葡聚糖酶活力。將1 mL 1%CMC-Na置于50 ℃的水浴鍋中預(yù)熱5min，加入0.5mL適當(dāng)濃度酶液，50 ℃保溫反應(yīng)30 min；待反應(yīng)結(jié)束后，立即加入3 mL的DNS試劑，補(bǔ)足去離子水定容10 mL體積，沸水浴5 min，用自來水冷卻至室溫，測(cè)定波長(zhǎng)540 nm條件下的吸光度值，依據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算反應(yīng)產(chǎn)生的葡萄糖濃度確認(rèn)酶活。酶活定義：在上述條件下，1 mL粗酶液每分鐘水解產(chǎn)生1 μmol還原糖所需要的酶量為1個(gè)酶活力單位（U/mL）。

β-葡萄糖苷酶酶活測(cè)定：采用0.02 mol/L的pH4.8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制1%水楊苷溶液為底物，0.5 mL適當(dāng)濃度的酶液和1%水楊苷溶液1 mL底物混勻，50 ℃反應(yīng)30 min，添加3 mL DNS試劑終止反應(yīng)，沸水浴6 min 然后冷水浴，測(cè)定波長(zhǎng)540 nm處的吸光度值。酶活定義：在上述條件下，1 mL粗酶液每分鐘水解產(chǎn)生1 μmol還原糖所需要的酶量為1個(gè)酶活力單位（U/mL）。

濾紙酶酶活測(cè)定：將1條whatman一號(hào)濾紙條[1cm×6cm；（50±1）mg]折疊放入試管底部，加1 mL pH 4.8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液和0.5mL適當(dāng)濃度的酶液混勻，30 ℃反應(yīng)60 min；對(duì)照管為沸水浴6 min滅活的粗酶液。然后用DNS法測(cè)定還原糖的生成量，比對(duì)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算反應(yīng)產(chǎn)生的葡萄糖濃度確認(rèn)酶活。酶活定義：在上述條件下，1 mL粗酶液每分鐘水解產(chǎn)生1 μmol還原糖所需要的酶量為1個(gè)酶活力單位（U/mL）。

還原糖含量測(cè)定采用DNS法[18-19]。

1.3.4 菌株分子生物學(xué)鑒定

菌株選用通用引物ITS1（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）、ITS4（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）PCR擴(kuò)增ITS序列。PCR擴(kuò)增體系：Template1μL，引物各1μL，2×TaqPCR Mix 12.5 μL，雙蒸水（ddH2O）9.5 μL。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸90 s，進(jìn)行30次循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，PCR產(chǎn)物8 ℃保溫60 min。用濃度為0.8%的瓊脂糖凝膠驗(yàn)證PCR產(chǎn)物，將驗(yàn)證成功的產(chǎn)物送華大基因公司測(cè)序。利用Cluster W軟件將測(cè)序拼接后的序列與GenBank中的相似序列進(jìn)行多種比對(duì)，再通過MEGA7.0軟件中基于Kimura-2的鄰接（neighborjoining，NJ）法（bootstrap=1000次）構(gòu)建具有產(chǎn)纖維素酶活的菌株以及相關(guān)相似菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹[20-21]。

1.3.5 混合碳源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

選取蔗渣、玉米桿、米糠、花生殼共4種碳源[22]各5 g，各加入3 g麩皮作為氮源，各加入30 mL 營(yíng)養(yǎng)鹽液，121 ℃滅菌30 min，接種107個(gè)孢子，每組做3個(gè)平行，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵3 d后提取粗酶液，采用酶標(biāo)儀在540 nm處測(cè)吸光度值，計(jì)算酶活力。按照蔗渣∶麩皮=1∶4的比例，設(shè)計(jì)四組：1.5%蔗渣+6.0%麩皮（0.5 g蔗渣+2.0 g麩皮），3.0%蔗渣+12.0%麩皮（1.0 g蔗渣+4.0 g麩皮），4.0%蔗渣+16.0%麩皮（1.5 g蔗渣+6.0 g麩皮），5.0%蔗渣+20.0%麩皮（2.0 g蔗渣+8.0 g麩皮），6.0%蔗渣+24.0%麩皮（2.5 g蔗渣+10.0 g麩皮），各加入30 mL營(yíng)養(yǎng)鹽液。121 ℃滅菌30 min，接種1 mL種子液，每組做3個(gè)平行，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵3 d。3 d后提取粗酶液，在波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定吸光度值，計(jì)算酶活力。

1.3.6 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

在優(yōu)化好的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上考察發(fā)酵溫度（24 ℃、27 ℃、30 ℃、33 ℃、36 ℃）、初始pH（3、4、5、6、7、8、9）、接種量（1.5%、3.0%、4.5%、6.0%、7.5%）、Mandels營(yíng)養(yǎng)鹽液添加量（80%、83%、86%、89%、91%）和發(fā)酵時(shí)間（24 h、36 h、48 h、60 h、72 h）對(duì)纖維素酶（葡聚糖內(nèi)切酶、β-葡萄糖苷酶和濾紙酶酶）酶活的影響[22-23]。一般情況下，濾紙酶活能夠表現(xiàn)纖維素酶的綜合酶活力，因此在單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，以濾紙酶活（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)[24]，分別選取發(fā)酵溫度（A）、初始pH（B）、接種量（C）和發(fā)酵時(shí)間（D）為考察因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化菌株產(chǎn)酶條件。正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 產(chǎn)纖維素酶條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for cellulase-producing conditions optimization

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用3次試驗(yàn)的重復(fù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分析采用Microsoft Excel 2016、正交設(shè)計(jì)助手V3.1進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種初篩

鑒定平板上長(zhǎng)出菌落后，經(jīng)剛果紅染色液染色，氯化鈉溶液脫色后產(chǎn)生明顯透明圈，水解效果圖見圖1。

圖1 纖維素酶產(chǎn)生菌水解效果Fig.1 Hydrolysis circle of cellulase-producing strain

篩選平板以羧甲基纖維素鈉為唯一碳源，羧甲基纖維素鈉能夠被剛果紅染成紅色，由于該菌株能夠分泌纖維素酶，故將周圍的羧甲基纖維素鈉分解，不能著色，產(chǎn)生水解圈，水解圈直徑與菌落直徑比值越大說明酶產(chǎn)量越高，因此可以根據(jù)透明圈直徑與菌落直徑的比值定性判定高產(chǎn)菌株，部分高產(chǎn)菌株經(jīng)剛果紅染色、氯化鈉脫色后產(chǎn)生的透明圈直徑與菌落直徑比值見表2。

表2 部分篩選菌株的H值Table 2 H value of some screened strains

續(xù)表

由表2可知，經(jīng)過羧甲基纖維素平板初篩，剛果紅染色后，酶產(chǎn)量較高的為菌株HJC-46、HJC-79、HJC-106，其透明圈直徑與菌落直徑比值分別為4.92、4.23和4.30。因此，選擇這3株菌做進(jìn)一步復(fù)篩。

2.2 菌種復(fù)篩

將初篩結(jié)果比較好的3株菌進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶復(fù)篩，結(jié)果見圖2。由圖2可知，葡聚糖內(nèi)切酶酶活從高到低依次為菌株HJC79＞HJC106＞HJC46；β-葡萄糖苷酶酶活從高到低依次為菌株HJC79＞HJC46＞HJC106；濾紙酶活從高到低依次為菌株HJC79＞HJC106＞HJC46。濾紙酶活代表綜合酶活力，從發(fā)酵結(jié)果來看，3株菌中菌株HJC-79結(jié)果最好，其葡聚糖內(nèi)切酶酶活力、β-葡萄糖苷酶酶活力和濾紙酶活分別為0.986 U/mL、1.092 U/mL、0.563 U/mL。因此，選擇菌株HJC-79進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖2 篩選菌株發(fā)酵產(chǎn)酶結(jié)果Fig.2 Results of enzyme production of screened strains

2.3 菌種鑒定

2.3.1 菌落形態(tài)

將菌株HJC-79接種于PDA平板上，于30 ℃的生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3 d，菌落形態(tài)見圖3。

圖3 菌株HJC-79菌落（a）和細(xì)胞（b）形態(tài)Fig.3 Colony (a) and cell (b) morphology of strain HJC-79

由圖3可知，菌株HJC-79從篩選板中選出接種于PDA培養(yǎng)基上，待長(zhǎng)出菌落后觀察，該菌落呈灰白色和圓形，邊緣不齊整，呈齒狀，表面光滑，不透明，而細(xì)菌的背部呈淡黃色；顯微鏡觀察菌絲光滑，分支狀，分生孢子頭為放射狀，頂囊呈半橢圓形或半圓形；分生孢子為球形或近球形。初步鑒定為曲霉屬（Aspergillussp.）。

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定

采用MEGA7.0軟件中NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖4。由圖4可知，菌株HJC-179與雜色曲霉菌MF22539聚于一支，經(jīng)測(cè)序?qū)闔JC-79的ITS序列進(jìn)行比對(duì)分析，從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中選取部分相似序列，發(fā)現(xiàn)菌株HJC-79 ITS序列與之相似性最高，高達(dá)100%。因此，鑒定菌株HJC-179為雜色曲霉（Aspergillus versicolor）。

圖4 菌株HJC-79基于ITS基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain HJC-79 based on ITS gene sequences

2.4 培養(yǎng)基組分對(duì)菌株HJC-79發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

碳源能誘導(dǎo)纖維素酶合成。玉米桿、蔗渣、花生殼、米糠作為唯一碳源，不同碳源對(duì)纖維素酶酶活的影響見圖5。

圖5 不同碳源對(duì)纖維素酶酶活的影響Fig.5 Effect of different carbon sources on cellulase activity

由圖5可知，蔗渣為唯一碳源時(shí)，葡聚糖內(nèi)切酶、濾紙酶活及β-葡萄糖苷酶3種酶活力相對(duì)較高，分別是1.234 U/mL、1.282 U/mL、0.663 U/mL，因此確定最佳碳源為蔗渣。

碳氮比是有機(jī)物中碳總含量與氮總含量的比值，對(duì)微生物生長(zhǎng)有十分重要的作用。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)碳氮比=1∶4的比例，固體培養(yǎng)基總質(zhì)量對(duì)酶活的影響見圖6。

圖6 固體培養(yǎng)基總質(zhì)量對(duì)纖維素酶酶活的影響Fig.6 Effect of total mass of solid medium on cellulase activity

由圖6可知，在蔗渣∶麩皮=1∶4條件下，3.0%蔗渣+12.0%麩皮（1 g蔗渣+4 g麩皮）發(fā)酵生產(chǎn)的3種纖維素酶的酶活力都是最高的，分別為1.39 U/mL、1.456 U/mL、0.782 U/mL。因此，確定3.0%蔗渣+12.0%麩皮作為基本發(fā)酵培養(yǎng)基的碳氮源。

2.5 發(fā)酵條件對(duì)菌株HJC-79發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

2.5.1 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

溫度對(duì)微生物的生長(zhǎng)繁殖和新陳代謝都有著至關(guān)重要的影響，發(fā)酵溫度太低或者太高都會(huì)使微生物生長(zhǎng)受到不同程度的抑制。本實(shí)驗(yàn)考察不同發(fā)酵溫度（24 ℃、27 ℃、30 ℃、33 ℃、36 ℃）對(duì)纖維素酶酶活的影響，結(jié)果見圖7。

圖7 不同發(fā)酵溫度對(duì)纖維素酶酶活的影響Fig.7 Effect of different fermentation temperature on cellulase activity

由圖7可知，隨著發(fā)酵溫度在24～33 ℃范圍內(nèi)的升高，纖維素酶酶活力逐漸升高；當(dāng)發(fā)酵溫度為33 ℃時(shí)，葡聚糖內(nèi)切酶酶活、β-葡萄糖苷酶酶活和濾紙酶活最高，分別為1.523 U/mL、1.456 U/mL、0.828 U/mL；當(dāng)發(fā)酵溫度＞33 ℃之后，纖維素酶活呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。因此，最適發(fā)酵溫度為33 ℃。

2.5.2 初始pH值對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

pH對(duì)微生物吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和新陳代謝過程中酶的活性存在不容忽視的影響，所以適中的pH值對(duì)菌種發(fā)酵起促進(jìn)作用。初始pH值對(duì)酶活的影響見圖8。

圖8 不同初始pH值對(duì)纖維素酶酶活的影響Fig.8 Effect of different initial pH value on cellulase activity

由圖8可知，初始pH值在3～4范圍內(nèi)，纖維素酶酶活力隨著初始pH升高而升高；當(dāng)初始pH值為4時(shí)，葡聚糖內(nèi)切酶酶活、β-葡萄糖苷酶酶活和濾紙酶活最高，分別為1.608 U/mL、1.496 U/mL、0.886 U/mL；初始pH值＞4以后纖維素酶酶活呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，最適初始pH值為4。

2.5.3 接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

在一定的發(fā)酵體系內(nèi)，接種量大小受限于代謝、生長(zhǎng)和繁殖速度，接種量過小導(dǎo)致發(fā)酵周期延長(zhǎng)等，過大則導(dǎo)致發(fā)酵體系溶氧不足、菌體容易衰老等。適當(dāng)?shù)慕臃N量能使菌種更好地發(fā)酵產(chǎn)酶。接種量對(duì)酶活的影響見圖9。

圖9 不同接種量對(duì)纖維素酶酶活的影響Fig.9 Effect of different inoculum on cellulase activity

由圖9可知，接種量為1.5%～6.0%時(shí)，纖維素酶酶活力隨著接種量升高而升高；當(dāng)接種量達(dá)到6.0%時(shí)，葡聚糖內(nèi)切酶酶活、β-葡萄糖苷酶酶活和濾紙酶活最高，分別為1.712 U/mL、1.584 U/mL、0.954 U/mL；當(dāng)接種量＞6.0%之后，纖維素酶酶活逐步下降。因此，最適接種量為6.0%。

2.5.4 營(yíng)養(yǎng)鹽液添加量對(duì)纖維素酶活的影響

營(yíng)養(yǎng)鹽液可以給微生物的生長(zhǎng)代謝提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，某些離子可以促進(jìn)微生物發(fā)酵。營(yíng)養(yǎng)鹽液對(duì)纖維素酶酶活的影響見圖10。

圖10 不同營(yíng)養(yǎng)鹽液添加量對(duì)纖維素酶酶活的影響Fig.10 Effect of different nutrient salt solution addition on cellulase activity

由圖10可知，營(yíng)養(yǎng)鹽液添加量在80%～89%范圍內(nèi)，纖維素酶酶活力逐漸升高；當(dāng)營(yíng)養(yǎng)鹽液添加量為89%時(shí)，葡聚糖內(nèi)切酶酶活、β-葡萄糖苷酶酶活和濾紙酶活最高，分別為1.823 U/mL、1.654 U/mL、1.023 U/mL；當(dāng)營(yíng)養(yǎng)鹽液添加量＞89%之后，纖維素酶酶活逐步下降。因此，最適營(yíng)養(yǎng)鹽液添加量為89%。

2.5.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

微生物在發(fā)酵前期，酶慢慢積累，到了發(fā)酵后期，菌體可利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)變少，菌株發(fā)生了衰老，發(fā)酵時(shí)間對(duì)酶的產(chǎn)生有重大的影響。發(fā)酵時(shí)間對(duì)纖維素酶酶活的影響見圖11。

圖11 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)纖維素酶酶活的影響Fig.11 Effects of different fermentation time on cellulase activity

由圖11可知，隨著發(fā)酵時(shí)間在24～48 h范圍內(nèi)增加，纖維素酶酶活逐漸升高；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為48h時(shí)，葡聚糖內(nèi)切酶酶活、β-葡萄糖苷酶酶活和濾紙酶活最高，分別為1.986 U/mL、1.782 U/mL、1.224 U/mL；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間＞48 h之后，纖維素酶酶活逐步下降。因此，最佳發(fā)酵時(shí)間為48 h。

2.6 正交試驗(yàn)優(yōu)化產(chǎn)酶條件

選取采用正交設(shè)計(jì)助手V3.0進(jìn)行試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)，按照方案進(jìn)行試驗(yàn)，每組做3個(gè)平行。正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 產(chǎn)酶條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for cellulase-producing conditions optimization

由表3可知，最優(yōu)產(chǎn)酶條件組合為A2B2C3D2，即發(fā)酵溫度為33 ℃，初始pH值為4，接種量為9.0%，發(fā)酵時(shí)間為48 h。在此優(yōu)化條件下，葡聚糖內(nèi)切酶、β-葡萄糖苷酶和濾紙酶活分別為2.224 U/mL、1.926 U/mL、1.534 U/mL。

3 結(jié)論

研究從環(huán)江原始森林篩選出一株纖維素酶高產(chǎn)真菌HJC-79，經(jīng)菌落形態(tài)觀察、ITS序列分析鑒定其為雜色曲霉（Aspergillus versicolor）。利用單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)菌株HJC-79的培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，確定其最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為蔗渣、麩皮和營(yíng)養(yǎng)鹽液，最適添加量分別為2%、9%和89%；最佳產(chǎn)酶條件為發(fā)酵溫度33 ℃，初始pH值4，接種量9.0%，發(fā)酵時(shí)間48h。在此優(yōu)化條件下，葡聚糖內(nèi)切酶、β-葡萄糖苷酶和濾紙酶活分別為2.224 U/mL、1.926 U/mL、1.534 U/mL，相比優(yōu)化前分別提高了125.55%、76.37%和172.47%。