醬香型酒糟發(fā)酵前后品質(zhì)和揮發(fā)性成分初步分析

黃 武，王曉丹，邱樹毅，曹文濤，周鴻翔，羅小葉，班世棟*

（貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025）

醬香型白酒生產(chǎn)過程中會(huì)產(chǎn)生大量酒糟，其主要是由高粱、小麥和稻殼等廢棄固形物組成。酒糟中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分[1]，常用于制備動(dòng)物飼料[2-3]和肥料[4-5]。微生物發(fā)酵處理是用于改善酒糟品質(zhì)生產(chǎn)飼料和有機(jī)肥的有效手段，在發(fā)酵過程中，微生物可以產(chǎn)生一些復(fù)雜的酶系，從而改善酒糟的品質(zhì)，其主要有單菌種發(fā)酵[6]和復(fù)合菌種發(fā)酵[7]技術(shù)。目前報(bào)道的關(guān)于醬香型酒糟的研究主要是在動(dòng)物飼料、食用菌栽培和功能性微生物篩選分離等方面的應(yīng)用。鄭應(yīng)家等[8]在荷斯坦奶牛日糧中添加發(fā)酵后的醬香型酒糟，結(jié)果表明此舉可以提高飼料的利用率，提升奶牛的產(chǎn)奶量，延長(zhǎng)泌乳周期。陸承云等[9]研究了醬香型酒糟栽培姬松茸的效果，結(jié)果表明醬香型酒糟可以用于姬松茸的栽培，但應(yīng)控制酒糟的添加量。白成松等[10-11]從醬香型酒糟中篩選到了對(duì)酒糟纖維素有一定降解效果的高溫放線菌和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），在酒糟綜合利用方面具有一定的潛力。關(guān)于醬香型酒糟來源的功能性微生物改善醬香型酒糟品質(zhì)和揮發(fā)性成分影響的報(bào)道較少。

庫(kù)德里阿茲威（氏）畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）（FBKL2.0008）和白耙齒菌（Irpex lacteus）（FBKL3.0021）是從醬香型酒糟和大曲中篩選分離出的兩株產(chǎn)香菌，其對(duì)酒糟微環(huán)境的耐受能力有明顯優(yōu)勢(shì)，并且能夠產(chǎn)生多種纖維素酶，在酒糟纖維素降解方面具有一定的潛力。本試驗(yàn)利用兩株優(yōu)良菌種對(duì)廢棄酒糟進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵處理，通過測(cè)定酒糟的微生物指標(biāo)、理化指標(biāo)和揮發(fā)性成分，探究?jī)芍陜?yōu)良菌種對(duì)酒糟品質(zhì)的改善效果和揮發(fā)性成分的影響，以期為后期醬香型酒糟發(fā)酵工藝優(yōu)化處理提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試劑

酒糟取自茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香型白酒酒廠粹沙酒糟；庫(kù)德里阿茲威（氏）畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）（FBKL2.0008）和白耙齒菌（Irpex lacteus）（FBKL3.0021）為實(shí)驗(yàn)室從醬香型酒糟和醬香大曲中分離的產(chǎn)香功能菌，均由貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；植物金屬硫蛋白酶聯(lián)免疫分析試劑盒：上海源葉生物科技有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1000 mL、pH自然。以不加瓊脂的培養(yǎng)基制成PDA液體培養(yǎng)基。

麩皮培養(yǎng)基：15 g麩皮裝于50 mL搖瓶中，加入15 mL蒸餾水，攪拌均勻后于121 ℃下滅菌20 min。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo CR3i多功能冷凍離心機(jī)：美國(guó)賽默飛世爾科技公司；HP 7890/5975C氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀：美國(guó)安捷倫公司；2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex固相微萃取頭：美國(guó)Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母種子液

將畢赤酵母（FBKL2.0008）接種到PDA斜面上30 ℃活化兩次，再接種到100 mL PDA液體培養(yǎng)基中，在30 ℃條件下培養(yǎng)1 d制成酵母種子液，用于酒糟發(fā)酵。

1.3.2 白耙齒菌擴(kuò)大培養(yǎng)

將白耙齒菌（FBKL3.0021）接種到PDA斜面上30 ℃活化兩次，再接種到PDA斜面中，30 ℃生長(zhǎng)7 d，加入5 mL生理鹽水，用接種環(huán)刮下培養(yǎng)基上菌絲，混勻，取1 mL接種到麩皮培養(yǎng)基中，攪拌均勻，在30 ℃條件下培養(yǎng)3 d，制成擴(kuò)大培養(yǎng)基。

1.3.3 醬香型酒糟微生物指標(biāo)測(cè)定

對(duì)粹沙酒糟的細(xì)菌、霉菌和酵母數(shù)量分別計(jì)數(shù)，細(xì)菌用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基計(jì)數(shù)，酵母和霉菌用PDA培養(yǎng)基計(jì)數(shù)。

1.3.4 醬香型酒糟部分理化指標(biāo)的測(cè)定

酒糟中水分、淀粉和還原糖含量測(cè)定參考T/CBJ 004—2018《固態(tài)發(fā)酵酒醅通用分析方法》；粗纖維的含量參考GB/T 6434—2006《飼料中粗纖維測(cè)定方法》中的過濾法測(cè)定[13]；粗蛋白的測(cè)定參考GB/T 6432—2018《飼料中粗蛋白的測(cè)定凱氏定氮法》中的凱氏定氮法[14]；粗脂肪含量的測(cè)定參考GB/T 6433—2006《飼料中粗脂肪的測(cè)定》[15]；粗灰分含量的測(cè)定參考GB/T 6438—2007《飼料中粗灰分的測(cè)定》[16]；多糖含量測(cè)定參考董鈺明等[17]的方法。無氮浸出物計(jì)算公式如下：

無氮浸出物（%）=100%-（水分%+粗蛋白%+粗脂肪%+粗纖維%+粗灰分%）

1.3.5 醬香型酒糟金屬硫蛋白含量的測(cè)定

金屬硫蛋白的提?。喝⊙心ゾ圃? g，加入10 mL 0.1 mol pH8.6的Tris-HCl緩沖液，用電動(dòng)玻璃勻漿器在冰浴條件下充分?jǐn)嚢?，勻漿液放于4 ℃，浸提5～8 h后于4 ℃、12 000 r/min離心15 min；收集上清液，并于100 ℃水浴加熱5 min，然后4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄沉淀，上清液中加入3倍體積無水乙醇于-20 ℃過夜；取沉淀，加入2 mL 0.01 mol/L Tris-HCI緩沖液室溫溶解4 h，然后于4 ℃、12 000 r/min離心20 min收集上清，此即為金屬硫蛋白粗提取液。根據(jù)植物金屬硫蛋白酶聯(lián)免疫分析試劑盒操作說明測(cè)定樣品中金屬硫蛋白含量。以上理化指標(biāo)均平行測(cè)定3次，結(jié)果取平均值。

1.3.6 醬香型酒糟揮發(fā)性成分測(cè)定

取酒糟樣品約5 g，置于20 mL固相微萃取儀采樣瓶中，插入裝有2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex固相微萃取頭的手動(dòng)進(jìn)樣器，在50 ℃左右頂空萃取30 min取出，快速移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進(jìn)樣口（溫度250℃）中，熱解析3 min進(jìn)樣。

色譜柱為ZB-5MSI 5%Phenyl-95%DiMethylpolysiloxane（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細(xì)管柱，柱溫40 ℃（保留2 min），以4 ℃/min升溫至280 ℃，保持2 min；汽化室溫度250 ℃；載氣為高純氦氣（He）（99.999%）；柱前壓7.62 psi，載氣流量1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣；溶劑延遲時(shí)間：1.5 min；離子源為電子電離源（electron ionization，EI）；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；發(fā)射電流34.6 μA；倍增器電壓1 428 V；接口溫度280 ℃；質(zhì)量范圍20～450 amu。

對(duì)總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對(duì)美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）2005和Wiley275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，確定了揮發(fā)性化學(xué)成分，用峰面積歸一化法測(cè)定了各化學(xué)成分的相對(duì)含量。

1.3.7 菌株發(fā)酵

酵母發(fā)酵：在前期預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇錐形瓶薄膜封口方式進(jìn)行發(fā)酵。稱取100 g酒糟，調(diào)節(jié)pH5～6，接種酵母10%（V/V），發(fā)酵時(shí)間為7 d，發(fā)酵溫度為28 ℃。

白耙齒菌發(fā)酵：在前期預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇錐形瓶薄膜封口方式進(jìn)行發(fā)酵。稱取20 g酒糟（在60 ℃下烘干10 h），加20 mL蒸餾水，調(diào)節(jié)pH5～6，按體積分?jǐn)?shù)10%接種白耙齒菌擴(kuò)大培養(yǎng)基，發(fā)酵時(shí)間為7 d，發(fā)酵溫度為30 ℃。

發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定酒糟的微生物指標(biāo)、理化指標(biāo)和揮發(fā)性成分。

2 結(jié)果與分析

2.1 醬香型酒糟微生物指標(biāo)計(jì)數(shù)結(jié)果

酒糟發(fā)酵前后微生物計(jì)數(shù)結(jié)果見表1。由表1可知，原酒糟中主要的微生物為細(xì)菌屬，未檢測(cè)出酵母和霉菌，經(jīng)酵母和白耙齒菌發(fā)酵后，各項(xiàng)微生物指標(biāo)的數(shù)量均顯著增加。其中，酵母組中共檢測(cè)出細(xì)菌1.68×107CFU/g和酵母6.00×107CFU/g；白耙齒菌組共檢測(cè)出細(xì)菌、酵母和霉菌三種微生物，其數(shù)量分別為2.10×106CFU/g、7.90×105CFU/g和3.00×103CFU/g。

表1 酒糟發(fā)酵前后微生物計(jì)數(shù)結(jié)果Table 1 Microbe count results of distiller's grains before and after fermentation

由微生物指標(biāo)計(jì)數(shù)結(jié)果可知原酒糟中微生物種類較為單一，其原因可能是因?yàn)獒u香型酒糟中pH值較低[18]，微生物如霉菌等無法在這種極端pH值環(huán)境中生長(zhǎng)；其次，本試驗(yàn)所用的畢赤酵母和白耙齒菌均能利用醬香型酒糟進(jìn)行生長(zhǎng)和代謝，且白耙齒菌對(duì)酒糟的利用程度優(yōu)于酵母。

2.2 醬香型酒糟部分理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

由圖1可知，原酒糟中水分含量達(dá)65.19 g/100 g，發(fā)酵后，其水分含量的變化較小，其中，酵母組的水分含量為62.93 g/100 g，白耙齒菌組的水分含量為59.43 g/100 g。

圖1 醬香型酒糟部分理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果Fig.1 Determination results of part physicochemical indexes of sauce-flavor distiller's grains

原酒糟中粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、粗灰分、無氮浸出物和淀粉的含量分別為8.42 g/100 g、2.90 g/100 g、4.18 g/100 g、3.24 g/100 g、16.07 g/100 g和13.67 g/100 g。經(jīng)酵母菌發(fā)酵后，酒糟中粗脂肪、粗纖維、粗灰分和淀粉含量均有所下降，其中淀粉含量為9.19 g/100 g，下降了32.77%，粗脂肪、粗纖維和粗灰分下降幅度較小，分別為2.68 g/100 g、3.95 g/100 g和2.78 g/100 g；而酒糟中粗蛋白和無氮浸出物的含量有所上升，分別為8.7 g/100 g和18.96 g/100 g。白耙齒菌組酒糟成分的變化程度最大，酒糟中粗脂肪、粗纖維、粗灰分和淀粉含量下降明顯，分別為0.61 g/100 g、2.76 g/100 g、2.08 g/100 g和5.17 g/100 g，與原酒糟相比，白耙齒菌組酒糟的粗脂肪和淀粉含量分別下降78.97%和62.18%；粗蛋白和無氮浸出物的含量分別上升了10.69%和60.55%，達(dá)到9.32 g/100 g和25.8 g/100 g。

原酒糟中多糖、還原糖和金屬硫蛋白的含量分別為520.00mg/100g、200.00mg/100g和5.80mg/100g，白耙齒菌組酒糟的多糖、還原糖含量均比原酒糟低，分別為86.41mg/100 g、62.50 mg/100 g，金屬硫蛋白含量變化不大，為5.90 mg/100 g而酵母組中多糖含量為630.00 mg/100 g，上升21.15%，但還原糖含量卻下降至140.00 mg/100 g，金屬硫蛋白含量上升至6.80 mg/100 g。

在醬香型白酒生產(chǎn)過程中，控制原料的適宜參數(shù)，如水分、粗蛋白和淀粉含量等是生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵點(diǎn)之一。本試驗(yàn)所用的粹沙酒糟與茅臺(tái)酒糟[19]相比，除水分含量和無氮浸出物含量稍高，其余理化指標(biāo)均低于茅臺(tái)酒糟，其原因可能是發(fā)酵原料種類、配比和生產(chǎn)工藝的不同，造成固態(tài)發(fā)酵白酒酒糟的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)種類和含量的差異[1]。金屬硫蛋白是微生物與動(dòng)植物產(chǎn)生的金屬結(jié)合蛋白[20]，其在保健品和化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用前景廣泛，因此在研究開發(fā)酒糟丟糟產(chǎn)品用于生產(chǎn)保健品時(shí)，企業(yè)要求將此項(xiàng)指標(biāo)考慮在內(nèi)。本試驗(yàn)中酵母組的金屬硫蛋白含量有所上升，其原因可能是酵母組中細(xì)菌和酵母的生物量遠(yuǎn)高于其余兩組，而在本試驗(yàn)中金屬硫蛋白主要來源于微生物，因此推測(cè)金屬硫蛋白含量的升高可能與酵母組中的生物量有關(guān)，但確切的原因還需進(jìn)一步研究。綜上所述，試驗(yàn)中所用畢赤酵母和白耙齒菌均能夠改善酒糟的品質(zhì)，但兩者之間也存在差異，這與游玲等[21]的研究結(jié)果一致。白耙齒菌對(duì)酒糟品質(zhì)的改善效果優(yōu)于畢赤酵母，但金屬硫蛋白含量低于畢赤酵母組，因此，在后續(xù)醬香型酒糟產(chǎn)品開發(fā)時(shí)可以考慮將兩者結(jié)合，進(jìn)行混菌發(fā)酵。

2.3 醬香型酒糟揮發(fā)性成分含量測(cè)定結(jié)果

由表2可知，原酒糟中共檢出54種揮發(fā)性成分，其中酯類29種、醛類8種、醇類6種、酸類3種、酚類和酮類各1種、烷類和其他類各2種；構(gòu)成原酒糟中揮發(fā)性成分的物質(zhì)主要是酯類（47.3%）、醇類（27.7%）和酸類（13.4%）。酵母組中揮發(fā)性成分共檢出44種，其中酯類28種、醛類7種、醇類6種、酚類、酸類和其他類各1種；構(gòu)成其揮發(fā)性成分主體物質(zhì)是酯類（57.9%）和醇類（30.9%）。白耙齒菌組共檢出37種揮發(fā)性成分，其中烯類23種、醛類6種、醇類3種、酮類2種、酯類和酚類各1種；其揮發(fā)性成分主體物質(zhì)是烯類（48.7%）、其他類（22.1%）和酮類（13.1%）。

表2 酒糟發(fā)酵前后揮發(fā)性成分相對(duì)含量Table 2 Relative contents of volatile components in distiller's grains before and after fermentation%

續(xù)表

續(xù)表

發(fā)酵后的酒糟中揮發(fā)性成分的種類和含量各不相同，其中原酒糟中揮發(fā)性成分最多，酵母組次之，白耙齒菌組中最少。并且各試驗(yàn)組中揮發(fā)性成分主體物質(zhì)也存在一定差異，原酒糟和酵母組中揮發(fā)性成分主體物質(zhì)均含有酯類和醇類，在檢出的酯類物質(zhì)中，乙酯類含量和種類最多，可能與酵母種類和酶活相關(guān)[22]，這與王軒等[23]的結(jié)果一致。而白耙齒菌組的揮發(fā)性成分主體為烯類，這與楊建遠(yuǎn)等[24]的結(jié)果不一致，后者揮發(fā)性主體物質(zhì)為酯類（42.41%），但兩者都具有濃郁的香氣，這可能是因?yàn)閮烧咚迷喜煌隆０装引X菌組的揮發(fā)性成分雖然比酵母組少，但其揮發(fā)性成分主要為烯類物質(zhì)，其中含量較大的有（-）-馬兜鈴烯（10.64%）、α-愈創(chuàng)木烯（9.38%）和（+）-苜蓿烯（8.17%）等，萜烯類物質(zhì)普遍具有較強(qiáng)的抗菌活性、止痛能力和抗氧化活性等功能[25]，說明白耙齒菌發(fā)酵后的酒糟更具應(yīng)用價(jià)值，更適合用于醬香型酒糟產(chǎn)品的開發(fā)。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，白耙齒菌組微生物的種類和數(shù)量最多，共檢測(cè)出細(xì)菌、酵母和霉菌三種微生物，酵母組次之，但未檢出霉菌，原酒糟中最少，只檢出細(xì)菌；白耙齒菌和酵母均能利用酒糟的營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行生長(zhǎng)和代謝，且前者對(duì)于酒糟的利用程度優(yōu)于后者，兩株菌均能在一定程度上改善酒糟的品質(zhì)；原酒糟、酵母組和白耙齒菌組分別檢測(cè)出54種、44種和37種揮發(fā)性成分，且相對(duì)含量逐漸減少，原酒糟和酵母組的主要揮發(fā)性成分是酯類和醇類，而白耙齒菌組的揮發(fā)性成分主要是烯類?；诰圃闫焚|(zhì)改善效果和揮發(fā)性成分測(cè)定結(jié)果，建議在后續(xù)醬香型酒糟發(fā)酵處理時(shí)，采用兩者結(jié)合進(jìn)行混菌發(fā)酵。本研究為后續(xù)發(fā)酵工藝優(yōu)化處理提供了數(shù)據(jù)支撐。