高產(chǎn)Monacolin K的青稞功能紅曲發(fā)酵工藝優(yōu)化研究

郝 靜，涂兆鑫，紀鳳娣，劉 煜，2，吳 晶，張成萍，張建玲，魏 巍*

（1.青海華實科技投資管理有限公司，青海 西寧81000；2.青海華實青稞生物科技開發(fā)有限公司，青海 西寧 810000；3.青海省青稞資源綜合利用工程技術(shù)研究中心，青海 西寧 810000；4.北京市營養(yǎng)源研究所，北京 100069）

紅曲是我國先民的一項偉大發(fā)明，在我國和世界微生物學開發(fā)與利用發(fā)展史上具有極其重要的意義，是我國傳統(tǒng)藥食同源的寶貴發(fā)明和科學文化遺產(chǎn)[1]。傳統(tǒng)功能紅曲是以大米為原料，用紅曲霉發(fā)酵而成，含有Monacolin K、紅曲色素、γ-氨基丁酸和多糖等多種重要的代謝產(chǎn)物[2-3]，其中Monacolin K是紅曲中重要的營養(yǎng)功能成分[4]，有閉環(huán)的內(nèi)酯式和開環(huán)的β-羥基酸式兩種結(jié)構(gòu)，具有降血脂、降血壓和降血糖[5-6]等功效。

青稞是我國高原特色農(nóng)作物，其蛋白質(zhì)、淀粉、纖維素和維生素等營養(yǎng)成分含量高，同時還含有酚類物質(zhì)、甾醇類物質(zhì)和膳食纖維等功能成分[7-8]。它具備紅曲霉生長的基礎(chǔ)營養(yǎng)條件，制備出的青稞紅曲發(fā)酵物具有許多功能成分，在食品領(lǐng)域有很好的應用[9]。目前國內(nèi)青稞紅曲產(chǎn)品的開發(fā)研究處于起步階段，只有少數(shù)企業(yè)及學者對青稞紅曲進行研究。胡久平等[10]通過對青稞紅曲高溫發(fā)酵溫度、低溫發(fā)酵溫度、發(fā)酵濕度的優(yōu)化，得到一條Monacolin K含量達1.94%的生產(chǎn)工藝；周禮紅等[11]研究了青稞紅曲發(fā)酵工藝對色價的影響，通過優(yōu)化青稞蒸煮時間、料水比、裝料量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、接種量、初始pH值等工藝參數(shù)，得到的青稞紅曲米色價高達1 210.84 U/g；譚有莉等[12]對青稞紅曲的性狀、顯微特征、水分、灰分、浸出物、薄層鑒別和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）定量分析等進行研究，并在此基礎(chǔ)上初步制定了青稞紅曲的質(zhì)量標準。西藏月王生物技術(shù)有限公司的青稞紅曲系列產(chǎn)品受到了廣泛的肯定和關(guān)注。

為了充分利用青稞，開發(fā)出高附加值的青稞衍生產(chǎn)品，本研究以二道脫皮青稞代替大米進行固態(tài)發(fā)酵，通過對發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化提高Monacolin K的含量，以期豐富功能紅曲的種類，拓展青稞的應用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肚里黃青稞：青海華實投資管理有限公司；叢毛紅曲（Monascus pilosus）：北京市營養(yǎng)源研究所保藏；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato detroxse agar，PDA）培養(yǎng)基、蛋白胨、酵母粉（均為生化試劑）：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；葡萄糖、硝酸鈉、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、冰醋酸、磷酸等（均為分析純）：北京化工廠；甲醇（色譜純）：美國Fisher scientific公司；洛伐他?。兌取?8%）：北京索萊寶科技有限公司。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：青稞米飯；種子培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基；液體培養(yǎng)基：葡萄糖60 g/L，蛋白胨25 g/L，硝酸鈉2 g/L，硫酸鎂1 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，乙酸調(diào)節(jié)pH值為5.0。以上培養(yǎng)基滅菌條件為121 ℃，15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-30FBS滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；FCH-1300B超凈臺：北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司；MJ-500-Ⅱ霉菌培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；Hitachi CF16RN高速冷凍離心機：日本日立公司；Vanquish-H高效液相色譜儀（配置二極管陣列檢測器）：美國Thermo Fisher公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 功能紅曲發(fā)酵工藝及操作要點

操作要點：青稞米清洗后浸泡至中間無白心，瀝水20 min至表面干燥，上屜蒸飯20 min，攤涼后添加營養(yǎng)成分，分裝三角瓶（160 g/500 mL），121 ℃滅菌15 min，冷卻后接種液體紅曲霉種子（菌落數(shù)1×107CFU/mL），降溫培養(yǎng)，高溫發(fā)酵2 d，低溫發(fā)酵21 d，培養(yǎng)過程中適時補加pH4.0乙酸水，出曲后60 ℃干燥至水分10%以下。

1.3.2 菌種培養(yǎng)及發(fā)酵方法

菌種活化及保藏：將保藏菌種劃線接種于PDA斜面上，30 ℃培養(yǎng)7～8 d，至菌絲體長滿斜面并變成紅色后，4 ℃冰箱保存。

種子培養(yǎng)：用無菌水反復沖洗叢毛紅曲菌斜面，制成孢子懸液，并稀釋至1×104CFU/mL，接種到裝液量為150 mL/500 mL PDA液體培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r/min空氣搖床中培養(yǎng)48 h。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)：青稞浸泡至無白心，瀝水20 min，蒸飯20 min，攤涼，分裝三角瓶，滅菌，接種量10%，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天扣瓶2次，適時補加乙酸水溶液。

1.3.3 菌株生長曲線測定

以試驗用菌種為研究對象，利用液體培養(yǎng)基，采用稱量菌絲干質(zhì)量的方法，繪制叢毛紅曲菌的生長曲線，確定最佳接種時間。

1.3.4 培養(yǎng)基成分優(yōu)化單因素試驗

蛋白胨添加量優(yōu)化：基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%（以干質(zhì)量計）的蛋白胨，考察不同蛋白胨添加量對Monacolin K產(chǎn)量的影響。

酵母粉添加量優(yōu)化：基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%（以干質(zhì)量計）的酵母粉，考察不同酵母粉添加量對Monacolin K產(chǎn)量的影響。

磷酸二氫鉀添加量優(yōu)化：基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%（以干質(zhì)量計）的磷酸二氫鉀，考察不同磷酸二氫鉀添加量對Monacolin K產(chǎn)量的影響。

1.3.5 發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

考察不同青稞米浸泡水初始pH值（3、4、5、6、7）、青稞蒸煮時間（10 min、20 min、30 min、40 min、50 min）、裝料量（120 g/500 mL、140 g/500 mL、160 g/500 mL、180 g/500 mL、200g/500mL）、接種量（4%、6%、8%、10%、12%，以青稞米飯質(zhì)量計）、高溫發(fā)酵溫度（28℃、30℃、32℃、34℃、36℃）、低溫發(fā)酵溫度（23℃、25℃、27℃、29℃））對MonacolinK產(chǎn)量的影響。

1.3.6 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗

根據(jù)單因素試驗所得發(fā)酵條件，選擇發(fā)酵溫度、菌種接種量和初始pH為影響因素，以Monacolin K含量為考察指標，進行L9（34）正交試驗，因素與水平編碼如表1所示。

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for fermentation conditions optimization

1.3.7 指標測定方法

（1）Monacolin K含量檢測方法

依據(jù)QB/T 2847—2007《功能性紅曲米（粉）》對青稞功能紅曲中的Monacolin K進行檢測，對檢測條件進行了適當改進。具體條件為：Agilent SB-C18（250 mm×4.6 mm×5μm）色譜柱，柱溫25 ℃；流動相為0.12%的磷酸水溶液（A）和甲醇（B），流速為1.0 mL/min，流動相梯度洗脫程序為：0～20 min，B=77%；22min，B=100%；25min，B=77%；25～30min，B=77%；檢測波長為238nm。Monacolin K含量按如下公式計算：

式中：X1為試樣中Monacolin K的含量，mg/g；h1為試樣中內(nèi)酯型洛伐他汀峰面積；h2為試樣中內(nèi)酯型洛伐他汀峰面積；c為標準洛伐他?。▋?nèi)酯）溶液質(zhì)量濃度，mg/mL；50為試樣定容體積，mL；h3為標準洛伐他?。▋?nèi)酯）溶液峰面積；m為試樣稱取量，g。

Monacolin K（以絕干計）按如下公式計算：

式中：X為試樣中Monacolin K含量（以絕干計），%；X1為試樣中Monacolin K的含量，mg/g；X2為試樣中水分的含量，%。

（2）水分含量測定

參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》。

2 結(jié)果與分析

2.1 Monacolin K測定高效液相色譜圖

圖1為青稞功能紅曲樣品中Monacolin K含量測定的高效液相色譜圖。由圖1可知，青稞紅曲中Monacolin K酸式、內(nèi)酯式完全分離，峰形良好，所得結(jié)果為兩者之和。

圖1 青稞功能紅曲樣品中Monacolin K高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of Monacolin K in functional highland barley Monascus sample

2.2 菌種生長曲線

以叢毛紅曲菌為研究對象，考察32 ℃恒溫搖床培養(yǎng)不同時間的菌絲干質(zhì)量。培養(yǎng)時間對菌絲干質(zhì)量的影響如圖2所示。

圖2 從毛紅曲霉生長曲線Fig.2 Growth curve of Monascus pilosus

由圖2可知，保藏菌種在培養(yǎng)第36～48小時菌絲迅速增加，此時霉菌酶系活躍，代謝旺盛，細胞群體的形態(tài)與生理特性最一致，微生物細胞抗不良環(huán)境的能力最強[13-14]。48～60 h為穩(wěn)定生長期，但增長速度減緩。為節(jié)約時間成本，選取最適宜接種時間為液體培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)時間過短，菌種量少、生長緩慢，培養(yǎng)時間過長，菌種衰老，不利于Monacolin K的積累。

2.3 培養(yǎng)基成分優(yōu)化單因素試驗

由圖3可知，Monacolin K產(chǎn)量隨著磷酸二氫鉀、蛋白胨、酵母粉的添加量增加均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。磷酸二氫鉀添加量為0.3%時，叢毛紅曲霉產(chǎn)生Monacolin K含量達1.32%；蛋白胨添加量為0.6%時，Monacolin K含量達1.30%；酵母粉添加量為0.3%時Monacolin K含量達1.06%。分別為各條件下最高。

圖3 不同培養(yǎng)基成分添加量對Monacolin K產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of different additions of medium components on Monacolin K yield

2.4 發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

2.4.1 不同青稞米浸泡水初始pH值對Monacolin K產(chǎn)量的影響

由圖4可知，青稞米初始pH值為5、6和7時，紅曲中Monacolin K含量較低，在pH值為4時含量最高，這是因為紅曲霉菌是喜酸型菌，最適宜生長的pH值為3～5，在pH＜3時生長緩慢，在pH≥5時，不利于色素合成。因此，初始pH值為4時最適宜。

圖4 不同初始pH值對Monacolin K產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of different initial pH on Monacolin K yield

2.4.2 不同青稞蒸煮時間對Monacolin K產(chǎn)量的影響

由圖5可知，蒸煮時間為20 min及以上時，紅曲Monacolin K的含量無明顯差異。蒸煮的主要作用是使青稞米中的淀粉糊化，便于微生物利用。隨著蒸煮時間的延長，青稞米黏度及水分含量增加，綜合考慮時間成本、能耗及試驗的可操作性，選擇20 min為最佳蒸煮時間。

圖5 不同蒸煮時間對Monacolin K產(chǎn)量影響Fig.5 Effect of different cooking time on Monacolin K yield

2.4.3 不同裝料量對Monacolin K產(chǎn)量的影響

由圖6可知，裝料量為120 g/500 mL時，所得Monacolin K的含量為1.38%，裝料量為160 g/500 mL時，含量為1.31%，裝料量為180 g/500 mL時，含量僅為1.16%。在紅曲霉發(fā)酵過程中，Monacolin K的生成受培養(yǎng)基水分含量、內(nèi)部溫度及氧氣含量影響很大[15]。培養(yǎng)基過少，不利于水分的保持，并且隨著發(fā)酵時間的延長，米粒逐漸干硬，影響叢毛曲霉正常生長[16]；培養(yǎng)基過多，不利于紅曲菌體代謝過程中所產(chǎn)生的熱量散失，同時也不利于氧氣流通，同樣會影響生長，繼而影響Monacolin K的合成，導致其含量降低。裝料量120 g/500 mL與160 g/500 mL Monacolin K的含量沒有明顯的差異，為了獲得更高的產(chǎn)量，選擇160 g/500 mL為最優(yōu)。

圖6 不同裝料量對Monacolin K產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of different loading capacity on Monacolin K yield

2.4.4 不同接種量對Monacolin K產(chǎn)量的影響

由圖7可知，在接種量＜10%時，所得紅曲中Monacolin K的含量隨著接種量的增加而逐漸增加，在10%時Monacolin K含量最高，超過10%時Monacolin K含量降低。這是因為接種量過低，菌體繁殖緩慢，接種量過高，菌體過快增殖而積累的大量代謝產(chǎn)物對發(fā)酵過程會產(chǎn)生反饋抑制作用，還會使發(fā)酵基質(zhì)的黏度增加，叢而妨礙傳質(zhì)過程，最終影響菌體生長和代謝產(chǎn)物的生成[17]。

圖7 不同接種量對Monacolin K產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of different inoculum on Monacolin K yield

2.4.5 不同發(fā)酵溫度對Monacolin K產(chǎn)量的影響

功能紅曲的發(fā)酵工藝采用變溫發(fā)酵，高溫培養(yǎng)階段是為了積累生物量[18]，低溫培養(yǎng)階段是Monacolin K的合成累積的重要時期[10]。李同樂等[14]以大米為基質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)功能紅曲米時采用30 ℃下培養(yǎng)3 d后降溫26 ℃培養(yǎng)15 d的工藝，張占軍[19]等也用了相同的工藝。本文根據(jù)叢毛紅曲霉的特性提高了高溫發(fā)酵的溫度，縮短高溫發(fā)酵時間至2 d，降低了低溫發(fā)酵溫度，延長低溫發(fā)酵時間至21 d，更有利于Monacolin K的生產(chǎn)。

由圖8可知，在不同高溫發(fā)酵溫度下青稞紅曲中Monacolin K的含量先升后降，32 ℃時Monacolin K產(chǎn)量最高，32 ℃為最適宜紅曲霉菌生長的溫度，此時生物量積累最多。在不同的低溫發(fā)酵溫度下，青稞紅曲中的Monacolin K含量先升后降，25 ℃時Monacolin K含量較高，為1.18%。在低溫培養(yǎng)條件下，紅曲霉生長緩慢且向基質(zhì)內(nèi)部生長，營養(yǎng)物質(zhì)不斷被消耗用于積累代謝產(chǎn)物。同時，紅曲霉經(jīng)變溫刺激由生長期轉(zhuǎn)為穩(wěn)定期，次級代謝產(chǎn)物開始大量生成[20]。因此確定高溫發(fā)酵和低溫發(fā)酵的溫度分別為32 ℃和25 ℃。

圖8 不同發(fā)酵溫度對Monacolin K產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of different fermentation temperature on Monacolin K yield

2.5 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗

由單因素試驗所得最優(yōu)的發(fā)酵條件，選擇發(fā)酵溫度（A）、菌種接種量（B）和初始pH值（C）為影響因素，以Monacolin K含量為考察指標進行3因素3水平的正交試驗，結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

由表2及表3可知，發(fā)酵溫度對Monacolin K含量的影響顯著（P＜0.05），對Monacolin K產(chǎn)量的影響因素的主次順序是A＞C＞B，即發(fā)酵溫度＞初始pH值＞接種量。最優(yōu)方案是A3B2C2，即最優(yōu)的發(fā)酵工藝為發(fā)酵溫度34 ℃、接種量10%和初始pH值為4.0。在此最佳條件下進行3次平行驗證試驗，獲得Monacolin K的產(chǎn)量為1.52%。

表3 正交試驗結(jié)果方差分析Table 3 Analysis of variance of orthogonal experiments

2.6 質(zhì)量指標

依據(jù)QB/T 2847—2007《功能性紅曲米（粉）》對青稞功能紅曲米的感官指標（外觀、斷面和香味）、理化指標（水分和Monacolin K含量）和衛(wèi)生指標（鉛、砷、菌落總數(shù)、霉菌和橘霉素等）進行檢測，結(jié)果見表4和表5。由表4和表5可知，青稞紅曲的質(zhì)量指標均符合規(guī)定。

表4 青稞功能紅曲米理化指標Table 4 Physical and chemical indexes of functional highland barley Monascus

表5 青稞功能紅曲米衛(wèi)生指標Table 5 Health indicators of functional highland barley Monascus

3 結(jié)論

本試驗對青稞功能紅曲發(fā)酵的工藝進行了優(yōu)化試驗，通過單因素試驗和正交試驗，獲得了高產(chǎn)Monacolin K的青稞功能紅曲生產(chǎn)工藝，確定的最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為：青稞米用初始pH值為4.0的水浸泡至無白心后蒸煮20 min，以裝料量160 g/500 mL分裝，添加0.6%蛋白胨、0.3%酵母提取物和0.3%磷酸二氫鉀，接種10%培養(yǎng)48 h的液體菌種，采用降溫發(fā)酵，32 ℃發(fā)酵2 d后降溫至25 ℃發(fā)酵21 d，適時補加pH值為4.0乙酸水溶液，可以得到Monacolin K產(chǎn)量1.52%的青稞功能紅曲米。本研究為青稞功能紅曲的大規(guī)模生產(chǎn)和Monacolin K的進一步研究提供了參考，有利于青稞相關(guān)衍生新產(chǎn)品的開發(fā)。