下調(diào)LncRNA LINC00857對胰腺癌PANC-1細胞增殖、遷移及凋亡的影響

張波，任龍飛，胡進靜，白仲添，周文策,

0 引言

胰腺癌（pancreatic cancer,PC）是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率逐年上升，5年生存率僅9%[1-2]，其高死亡率與早期癥狀不典型且易轉(zhuǎn)移有關(guān)，大多數(shù)患者確診時即在晚期，缺乏有效的治療手段。因此，尋找PC早診的生物標志物及治療靶點是近年研究的熱點。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）長度超過200個核苷酸，最初被認為是“垃圾序列”，沒有特定的生物學功能，但越來越多的研究證實lncRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。LINC00857是新近研究中發(fā)現(xiàn)的與多種腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡和預后相關(guān)的lncRNA[4-10]，但在PC中鮮有研究。我們通過GEPIA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，LINC00857在PC組織中高表達，其表達水平越高，PC患者預后越差[11]。然而LINC00857影響PC進展的機制尚不清楚。本研究擬檢測LINC00857在胰腺細胞系中的表達水平，并通過慢病毒轉(zhuǎn)染下調(diào)LINC00857的表達，探討LINC00857對胰腺癌PANC-1細胞增殖、遷移和凋亡的影響及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

胰腺癌細胞株AsPC-1、PANC-1和胰腺正常上皮細胞HPNE購自上海中科院，胰腺癌細胞株CFPAC-1由甘肅省生物治療與再生醫(yī)學重點實驗室提供。胰蛋白酶和DMEM培養(yǎng)基（Gibco，美國）；胎牛血清和RPMI 1640培養(yǎng)基（BioInd，以色列）；TRIzol（Invitrogen，美國）；引物GAPDH和LINC00857（寶日生物，中國）；反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增試劑盒（TaKaRa，日本）；PVDF膜、ECL發(fā)光液（Millipore，美國）；LV-LINC00857-RNAi慢病毒（上海吉凱生物，中國）；E-cadherin和N-cadherin抗體（Abcam，美國）；Vimentin（賽維爾，中國）；鼠抗人GAPDH（Proteintech，美國）；羊抗兔、鼠二抗（SAB，美國）；細胞周期試劑盒（索萊寶，中國）；細胞凋亡試劑盒（江蘇碧云天，中國）；CCK-8試劑（日本同仁，日本）；Transwell小室（Corning，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) AsPC-1細胞使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，PANC-1、CFPAC-1和HPNE細胞使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于恒溫培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中培養(yǎng)。

1.2.2 慢病毒的設(shè)計和細胞轉(zhuǎn)染 本實驗中使用的LINC00857 shRNA慢病毒由上海吉凱基因公司構(gòu)建，載體為GV112，元件順序為hU6-MCSCMV-puromycin，其中LINC00857-sh1序列為5'-CCGGCTCCTAGAATACCACGTTTATCTCGA GATAAACGTGGTATTCTAGGAGTTTTTG-3'，LINC00857-sh2序列為5'-CCGGAAGGTGGAGAA GAGTACCCAACTCGAGTTGGGTACTCTTCTCC ACCTTTTTTTG-3'，空載體序列為5'-TTCTCCGA ACGTGTCACGT-3'。根據(jù)慢病毒轉(zhuǎn)染指南，六孔板中細胞匯合度在30%～40%時進行感染，MOI值為10。共計分為4組：Normal control組為未處理的正常對照組，Negative control組為轉(zhuǎn)染空白載體的陰性對照組，LINC00857-sh1和LINC00857-sh2為實驗組。轉(zhuǎn)染16 h后換液，3天后用嘌呤霉素（2 μg/ml）篩選，隔天換液，篩選9天獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。

1.2.3 RNA提取和qPCR法實驗 待細胞融合度達80%～90%時，TRIzol提取細胞的RNA，檢測濃度和純度，隨即將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將cDNA原液5倍稀釋后按10 μl反應體系進行PCR擴增。引物序列如下，LINC00857：F:5'-CCCCTGCTTCATTGTTTCCC-3'，R:5'-AGCTTGTCCTTCTTGGGTACT-3'；GAPDH：F:5'-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3'，R:5'-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3'。擴增參數(shù)：95℃ 30 s，1個循環(huán)；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，1個循環(huán)。運用2-ΔΔCt計算檢測結(jié)果。

1.2.4 CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染后PANC-1細胞增殖 消化處于對數(shù)生長期的細胞，取每孔100 μl細胞懸液（含2 000個細胞）接種于96孔板，每組重復5次，細胞貼壁后棄掉原液，CCK-8溶液和無血清的DMEM按1:10配置，每孔加100 μl配置液，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，酶標儀測450 nm波長處的吸光度（OD）值，每天檢測1次，隔天換液，連續(xù)測5天。采用GraphPad軟件繪制增殖曲線。

1.2.5 Transwell和劃痕實驗檢測轉(zhuǎn)染后PANC-1細胞的遷移能力 將對數(shù)生長期的細胞饑餓處理24 h，隨即胰酶消化，取200 μl細胞無血清懸液（含6×l04個細胞）接種于Transwell上室，600 μl（含30%胎牛血清）完全培養(yǎng)基加入下室，孵箱中培養(yǎng)48 h，隨即用4%多聚甲醛固定、結(jié)晶紫避光染色，放置在浸沒PBS的24孔板中，倒置顯微鏡（200倍）下多視野拍照。

六孔板中細胞融合度在90%左右時，在超凈臺中用10 μl槍頭垂直劃痕。輕柔洗去漂浮細胞，加入2 ml DMEM（不含血清），0 h和24 h于倒置顯微鏡（100倍）下拍照。利用Image J軟件測細胞遷移前后的面積。劃痕愈合率=（0 h劃痕面積-24 h劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%。

1.2.6 流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染后PANC-1細胞的細胞周期和凋亡 待細胞匯合度達70%～80%時，收集消化的各組細胞，取1 ml含1×106個細胞的細胞懸液，離心后預冷PBS洗兩遍，逐滴加入70%預冷的無水乙醇重懸細胞，隨后置于4℃冰箱過夜，清洗后重懸于100 μl RNase A溶液，加400 μl碘化丙啶（PI）固定，上流式細胞儀檢測細胞DNA含量。取胰酶（不含EDTA）消化的5～10萬個細胞重懸于195 μl Annexin V-FITC結(jié)合液中，加入5 μl Annexin V-FITC、10 μl PI，4℃避光靜置20 min，加入300 μl結(jié)合液，上流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。使用ModFit軟件分析細胞周期，F(xiàn)lowJo軟件分析細胞凋亡情況。

1.2.7 Western blot實驗檢測轉(zhuǎn)染后PANC-1細胞EMT相關(guān)蛋白的表達 提取細胞總蛋白，BCA法測蛋白濃度，加入適量5×SDS蛋白上樣緩沖液和強RIPA將待測蛋白樣品定量至合適濃度，的100℃沸水中煮10 min使蛋白質(zhì)變性。每孔加50 μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳（80 V 30 min，120 V 1.5 h，恒壓）、濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜（200 mA，2～3 h,恒流），5%BSA封閉1 h，TBST洗PVDF膜3次，每次10 min，按分子量拆剪條帶，放置于一抗（稀釋比Vimentin 1:500，GAPDH、E-cadherin和N-cadherin均為1:1 000）中，4℃冰箱保存過夜；TBST清洗后在二抗（稀釋比1:2000）中孵育1 h，ECL化學發(fā)光A、B液按1:1配置，曝光儀下顯影并拍照。采用Image J軟件核算蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS22.0和GraphPad Prism 7.00統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，定量資料用（x±s）表示，數(shù)據(jù)均進行正態(tài)分布檢驗，每個實驗至少重復3次，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LINC00857在胰腺細胞系中的表達及其在PANC-1細胞中的敲低情況

LINC00857 在三種胰腺癌細胞系中的表達顯著高于胰腺正常上皮細胞HPNE，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），其中以PANC-1細胞本底表達最高，故選擇PANC-1細胞進行后續(xù)實驗，見圖1A。對照組間LINC00857表達水平未見明顯差異（P=0.5946），與對照組相比，實驗組中LINC00857的表達水平均顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.0001），見圖1B。

圖1 LINC00857在胰腺細胞系中的表達情況（A）及其敲低效率的驗證（B）Figure 1 Expression levels of LINC00857 in pancreatic cell lines(A) and verification of its knockdown efficiency(B)

2.2 CCK-8法檢測細胞增殖結(jié)果

與Normal control組相比，Negative control組細胞OD值減?。?4 hP=0.115，余P<0.05）；與對照組相比，實驗組細胞OD值均明顯減?。ň鵓<0.0001）；實驗組間OD值僅在48 h差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；表明下調(diào)LINC00857可抑制PANC-1細胞的增殖能力，見圖2。

圖2 LINC00857敲低對PANC-1細胞增殖能力的影響Figure 2 Effect of LINC00857 knockdown on proliferation of PANC-1 cells

2.3 Transwell和劃痕實驗檢測細胞遷移結(jié)果

與對照組相比，實驗組穿過的細胞數(shù)目均明顯減少（P<0.0001），實驗組和對照組間各自組間差異無統(tǒng)計學意義（P=0.7835和P=0.7279），見圖3A、3C。劃痕實驗也同樣證實了敲低LINC00857可以顯著抑制PANC-1細胞的遷移能力，見圖3B、3D。與Normal control組（78.54±40.25)%和Negative control組（78.06±1.263）%的劃痕愈合率相比，LINC00857-sh1組（44.92±2.14）%和LINC00857-sh2組（42.75±1.425）%的劃痕愈合率均顯著下降（P<0.0001），實驗組和對照組間各自組間差異無統(tǒng)計學意義（P=0.9990和P=0.9226）。

2.4 流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡的結(jié)果

細胞周期結(jié)果顯示，與Negative control組G0/G1期細胞的百分比（55.4±1.045）%相比，LINC00857-sh1組（64.91±1.185）%和LINC00857-sh2組（69.77±0.775）%顯著上升（P=0.0058和P=0.0012），差異有統(tǒng)計學意義；實驗組和對照組各自組間差異無統(tǒng)計學意義（P=0.9743和P=0.0599）。與Negative control組S期細胞的百分比（22.15±1.51）%相比，LINC00857-sh1組（14.24±0.02）%和LINC00857-sh2組（9.9±0.38）%明顯減少（P=0.0493和P=0.0109），差異有統(tǒng)計學意義；實驗組和對照組各自組間差異無統(tǒng)計學意義（P=0.6489和P=0.254），見圖4A、4C。說明敲低LINC00857后PANC-1細胞被阻滯在G1期。

細胞凋亡結(jié)果所示，與Negative control組凋亡（早期凋亡+晚期凋亡）比例（26.84±0.97）%相比，LINC00857-sh1組（41.45±0.55）%和LINC00857-sh2組（50.3±2.6）%明顯增加（P=0.0178和P=0.0031），實驗組和對照組各自組間差異無統(tǒng)計學意義（P=0.8005和P=0.0914），見圖4B、4D。說明敲低LINC00857后PANC-1細胞凋亡增加。

2.5 Western blot檢測上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達的結(jié)果

圖3 Transwell（A、C）和劃痕實驗（B、D）檢測LINC00857敲低對PANC-1細胞遷移能力的影響Figure 3 Effect of LINC00857 knockdown on migration of PANC-1 cells detected by Transwell(A,B) and wound-healing assay(B,D)

圖4 LINC00857敲低對PANC-1細胞周期（A、C）和凋亡（B、D）的影響Figure 4 Effect of LINC00857 knockdown on cell cycle(A,C) and apoptosis of PANC-1 cells(B,D)

對照組間EMT相關(guān)蛋白表達未見明顯異常（均P>0.05）；與Negative control組相比，實驗組EMT相關(guān)的蛋白E-cadherin表達顯著升高（P=0.0152和P=0.0196），N-cadherin表達顯著下調(diào)（P=0.0001和P=0.0016），Vimentin表達顯著降低（P=0.0208和P=0.0170），差異有統(tǒng)計學意義，見圖5。

圖5 LINC00857敲低對PANC-1細胞EMT相關(guān)蛋白表達的影響Figure 5 Effect of LINC00857 knockdown on expression of EMT-related proteins in PANC-1 cells

3 討論

近些年研究發(fā)現(xiàn)LncRNA與PC的惡性行為及治療密切相關(guān)。如LncRNA DGCR5可誘導胰腺癌細胞凋亡，抑制細胞增殖[12]；Wang等[13]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA H19不僅參與維持胰腺癌細胞干性，還與胰腺癌細胞的侵襲、遷移、EMT和化療耐藥性密切相關(guān)。納米顆粒介導的致癌LncRNA DANCR已被證明有助于三陰性乳腺癌的治療[14]。LINC00857是一種新發(fā)現(xiàn)的LncRNA，位于人類染色體10q22.3的正鏈上，不能編碼蛋白質(zhì)[4]。LINC00857在肺癌[4-5]、胃癌[6-7]、膀胱癌[8]、肝癌[9]、食管癌[10]等癌組織或細胞中高表達，通過不同機制促進腫瘤的惡性進展。已有研究[15]通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)LINC00857在PC組織中高表達，與PC預后呈負相關(guān)，提示LINC00857可能作為促癌基因參與PC的惡性進展。然而，LINC00857在胰腺癌細胞中的表達和作用機制尚無報道。

本研究發(fā)現(xiàn)，LINC00857在胰腺癌細胞系中高表達。下調(diào)LINC00857后，細胞增殖能力明顯減弱，說明LINC00857在PC中是一種促癌因素。細胞周期和凋亡實驗發(fā)現(xiàn)實驗組較對照組細胞凋亡率明顯增加，G0/G1期比例增加，S期比例下降，細胞被阻滯在G1期。Wang等[4]和Pang等[7]研究發(fā)現(xiàn)，LINC00857下調(diào)后，細胞周期信號通路失活，細胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）、細胞周期蛋白D1（cyclin D1）、細胞周期蛋白E1（cyclin E1）表達減少，細胞被阻滯在G1期，細胞增殖受到抑制；LINC00857表達缺失后肺癌和食管癌細胞凋亡比例增加，細胞增殖被抑制[5,10]。由此可見，G1期阻滯或誘導凋亡可能是LINC00857下調(diào)抑制腫瘤生長的機制。本研究Transwell和劃痕實驗同時證實，下調(diào)LINC00857可抑制PANC-1細胞的遷移能力；為了探究其原由，我們檢測了EMT相關(guān)蛋白的表達，與對照組相比，實驗組的E-cadherin表達明顯上升，N-cadherin和Vimentin表達顯著下降，EMT過程被抑制。這與Xia等[9]在肝癌中的研究一致。腫瘤早期轉(zhuǎn)移與細胞的EMT過程緊密相關(guān)，EMT可加速腫瘤的侵襲和遷移[16]，這種癌細胞的表型轉(zhuǎn)換是胰腺癌細胞惡性生長所必需的[17]。LncRNA SNHG12可通過EMT增加胰腺癌細胞的惡性行為[18]。因此，EMT可能是實驗組和對照組遷移能力差異的原因。

綜上所述，LINC00857在胰腺癌細胞系中高表達，下調(diào)LINC00857可抑制胰腺癌細胞的增殖和遷移能力，促進細胞的凋亡，其機制可能與G1期阻滯和EMT信號通路有關(guān)。LINC00857對PC的發(fā)生發(fā)展起促進作用，可能成為PC治療的新靶點，但 LINC00857在PC中的具體作用機制仍需進一步探究。