紫花含笑花被呈色過(guò)程中色素含量與超微結(jié)構(gòu)的變化特征

余秋岫，金曉玲，羅 峰，劉彩賢*

(1 中南林業(yè)科技大學(xué) 風(fēng)景園林學(xué)院，長(zhǎng)沙 410004；2 廣州市綠化公司，廣州 510000)

花色創(chuàng)新是花卉育種的重要內(nèi)容，研究色彩形成的原因?qū)τ谛滦陀^花品種的選育具有重要意義[1]。花色是復(fù)雜的表型性狀，花瓣色素種類及其含量是影響月季[2]、部分忍冬屬[1]植物呈色的主要原因。除受色素類型與比例影響外，還有細(xì)胞液pH值、光照、溫度等多種因素的影響[3-4]，其中花瓣表皮細(xì)胞形態(tài)是影響花色變化的重要因素之一[5]。Zhang等[6]提出錐形細(xì)胞將光線聚焦到內(nèi)部花色素上，從而增強(qiáng)花瓣顏色的強(qiáng)度[7]；不同花色菊花徒手切片結(jié)果表明，圓錐形上表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)入射光進(jìn)入細(xì)胞比例比扁平形增加[8]。另外，對(duì)萬(wàn)壽菊舌狀花超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，葉綠體向有色體的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變可導(dǎo)致花色呈橘黃色變化[9]。

紫花含笑 (Micheliacrassipes) 是木蘭科 (Magnoliaceae) 含笑屬 (Michelia) 常綠小喬木或灌木，花色紫紅，是含笑屬中為數(shù)不多紫色系植物，近年來(lái)常用作雜交親本進(jìn)行木蘭科植物花色改良[10-11]。目前，對(duì)紫花含笑的研究主要集中在孢粉學(xué)[12]、生物學(xué)特性[13]、雜交新品種選育[11,14]、無(wú)性繁殖方式[15-16]以及花葉提取物開(kāi)發(fā)[17]等方面，據(jù)觀察其花被在蕾期完成由綠轉(zhuǎn)紫的著色過(guò)程，現(xiàn)蕾時(shí)為綠色而在花蕾期花冠呈紫色，但紫花含笑花被顏色形成的機(jī)理尚不明確，花被的形態(tài)結(jié)構(gòu)及其對(duì)呈色影響也無(wú)報(bào)道。本研究采用光鏡和電鏡方法觀察比較不同顏色花被顯微及超微結(jié)構(gòu)，結(jié)合花色表型分析花被呈色過(guò)程中花色素和細(xì)胞結(jié)構(gòu)差異，為探討紫花含笑的花色呈色機(jī)制提供依據(jù)，也為木蘭科植物花色育種及功能利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料采自湖南省林業(yè)廳木蘭科資源圃的健康紫花含笑植株。根據(jù)花期發(fā)育過(guò)程中花被顏色的變化進(jìn)程，分為綠被期和紫被期2個(gè)階段。分別取綠色和紫色花被片作為石蠟切片、掃描電鏡、透射電鏡及色素含量分析試驗(yàn)材料(圖1)。取樣時(shí)去除花被基部與頂部位置，取花被2/3的部分。

1.2 觀測(cè)指標(biāo)及方法

1.2.1 花色表型測(cè)定參照張楊青慧等[3]的方法，用CM-700d型號(hào)色差儀(Konica minolta，Japan)對(duì)紫花含笑花被上表皮進(jìn)行測(cè)量，獲得花色明度(L*值)、色相a*和b*值，彩度C*值和色相角度h根據(jù)公式計(jì)算[18]，5次生物學(xué)重復(fù)。其中，C*=(a*2+b*2)1/2,h=arctan(b*/a*)

1.2.2 花被色素含量類黃酮含量分析采用Flavonoid Kit比色試劑盒法(南京建成生物工程研究所)；花青素含量提取采用1%鹽酸溶液水解法[19]；葉綠素及類胡蘿卜素含量測(cè)定參照于娜[20]乙醇浸提法。所有指標(biāo)含量測(cè)定均設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)均設(shè)3次技術(shù)重復(fù)。

1.2.3 花被表皮色素分布觀察參照程怡等[21]方法，尖頭鑷子撕下花被2/3處上表皮，于EVOS XL Core細(xì)胞成像系統(tǒng)40倍鏡下拍照觀察。

1.2.4 花被石蠟切片樣品制備及觀測(cè)以綠色和紫色花被為試材，取花被2/3處置于FAA固定液中，采用常規(guī)石蠟切片法制片[9,22]觀測(cè)。利用數(shù)字切片掃描系統(tǒng)Motic VM1(廈門麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)觀察、拍照，用Digimizer 4.5.1軟件測(cè)定花被表皮形態(tài)，包括上表皮長(zhǎng)度、寬度及其長(zhǎng)寬比。

1.2.5 花被掃描電鏡樣品制備及觀測(cè)參照肖文芳[5]的方法。從紫花含笑植株上采集新鮮花朵，用蒸餾水漂洗干凈；截取大小為5 mm×5 mm樣品，置于戊二醛固定液中；用磷酸緩沖液對(duì)樣品進(jìn)行沖洗，共3次，每次10 min；用30%～100%乙醇梯度脫水處理；用醋酸異戊酯替換掉細(xì)胞中的乙醇，2次，每次15 min；使用真空冷卻干燥器進(jìn)行干燥處理； 樣品粘附在鋁制托盤，用離子濺射鍍膜儀(IB-5 型)在樣品表面鍍1層金屬膜；使用JSM-6390 LV 掃描電鏡(Hitachi，Japan)對(duì)樣品進(jìn)行觀察及拍照記錄。

圖1 紫花含笑花被變色前后上表面Fig.1 The upper surface of different color perianths in Michelia crassipes

1.2.6 花被透射電鏡樣品制備及觀測(cè)取花被2/3部分，剪成小細(xì)條，迅速放入2%戊二醛固定液中，抽真空防止材料上浮，4 ℃保存；4 ℃，1%四氧化鋨(OsO4)固定3 h；30%～100%乙醇梯度脫水處理；環(huán)氧樹(shù)脂812包埋劑包埋樣品；超薄切片機(jī)切片，分別置于乙酸雙氧鈾[UO2(CH3COO)2·2H2O]、檸檬酸鉛(C6H5O7Pb)中染色；于透射電鏡下觀察(H-7650，Hitachi，Japan)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Origin 2017繪制圖表和SPSS 2.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)以及逐步回歸分析，指標(biāo)的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)系數(shù)評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫花含笑花色變化過(guò)程中花被表型參數(shù)和色素含量變化特征及其相關(guān)性

2.1.1 花色表型參數(shù)如圖2，A所示，不同顏色花被L*、a*、b*差異明顯。其中，隨著花被顏色由綠轉(zhuǎn)紫，其明度L*值大幅降低；色相a*值上升表示由綠到紅的變化，花被顏色向紅色相偏移，色相b*值大幅降低說(shuō)明顏色由黃轉(zhuǎn)藍(lán)的變化趨勢(shì)；彩度C*值大幅降低，色相角h則上升。

2.1.2 色素含量圖2，B顯示，在紫花含笑花被呈色過(guò)程中，花被類黃酮、花青素和類胡蘿卜素含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，葉綠素則呈下降趨勢(shì)。其中，在花色由綠轉(zhuǎn)紫變化過(guò)程中，花被類黃酮含量上升了1.2倍，花青素含量上升了3.25倍，類胡蘿卜素含量上升了11.3倍，而葉綠素含量下降了1.05倍；但與其他色素含量相比，花被類胡蘿卜素總含量上升幅度最大，含量卻最低。同時(shí)，比較紫花含笑花被呈色變化過(guò)程中花青素與其他各色素含量比值，發(fā)現(xiàn)花被花青素/類黃酮略微有所增大，花被花青素/葉綠素明顯增大，增加了7.69倍，而花被花青素/類胡蘿卜素卻顯著降低了65.48%；但就比值大小而言，不同顏色花被均以花青素/類胡蘿卜素最大，花青素/葉綠素次之，花青素/類黃酮最小(圖2，C)。

2.1.3 花色表型與色素含量的關(guān)系從簡(jiǎn)單相關(guān)分析結(jié)果(表1)可知，花被片明度L*值與a*值呈極顯著負(fù)相關(guān)，同時(shí)與花青素、類黃酮、類胡蘿卜素及花青素/類黃酮、花青素/葉綠素的比值也呈負(fù)相關(guān)，而與b*值、葉綠素含量及花青素/類胡蘿卜素呈正相關(guān)；a*值與b*值、葉綠素含量及花青素/類胡蘿卜素呈負(fù)相關(guān)，與花青素、類黃酮和類胡蘿卜素含量及花青素/類黃酮、花青素/葉綠素呈正相關(guān)；b*值與葉綠素含量和花青素/類胡蘿卜素呈正相關(guān)，與花青素、類黃酮、類胡蘿卜素含量、花青素/類黃酮和花青素/葉綠素呈負(fù)相關(guān)。可見(jiàn)，在紫花含笑花被花色由綠轉(zhuǎn)紫的過(guò)程中，花被表面明度L*降低，花色紫紅變化程度主要與花青素、類黃酮、類胡蘿卜素等色素含量以及花青素/類黃酮、花青素/葉綠素呈顯著正相關(guān)，而與葉綠素含量和花青素/類胡蘿卜素呈顯著負(fù)相關(guān)；各色素間相互影響，相互制約，共同影響花被呈色。

圖2 紫花含笑不同顏色時(shí)期花被表型參數(shù)和色素含量、比值比較Fig.2 Comparison of phenotypic parameters, pigment content and ratio of perianth in different color periods of Michelia crassipes

表1 各指標(biāo)間簡(jiǎn)單相關(guān)性分析

同時(shí)，簡(jiǎn)單相關(guān)分析中與花被呈色表現(xiàn)出極顯著相關(guān)因素較多，進(jìn)一步對(duì)各色素含量變化進(jìn)行逐步回歸分析，擬從不同花色素中找到花色(a*、b*)影響最顯著的因子。在5%的顯著水平下，逐個(gè)淘汰不顯著自變量，選出偏回歸系數(shù)達(dá)到顯著或極顯著水平的因子，進(jìn)入花色的回歸方程(表2)。如表2所示，花被色度a*值的逐步回歸方程中，僅保留了花青素1個(gè)因子，且二者呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，其余因子全部被剔除；花被色度b*值的逐步回歸方程中，也只保留了花青素1個(gè)因子，但二者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。這一結(jié)果表明，花青素對(duì)紫花含笑花冠呈紫色有顯著作用。

綜合以上分析，花被中各色素組分的相對(duì)含量變化共同影響紫花含笑呈色，其中花青素含量上升以及類胡蘿卜素、類黃酮等含量增加輔助增色可能是紫花含笑花被顯紫色的主要原因，同時(shí)還伴隨著葉綠素的降解。

2.2 紫花含笑花被上表皮色素分布特征

通過(guò)40倍光鏡觀察紫花含笑花被上表皮徒手切片(圖3)發(fā)現(xiàn)，綠色花被中主要是葉綠素分布，未觀察到花青素的存在(圖3，A)；而紫色花被中，花青素出現(xiàn)，并大面積分布于上表皮中，葉綠素含量降低(圖3，B)。因此，花青素的出現(xiàn)可能是紫花含笑花冠著紫色的主要原因。

2.3 紫花含笑花被表皮細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)

2.3.1 基本形態(tài)特點(diǎn)對(duì)不同顏色花被的上表皮細(xì)胞長(zhǎng)度、寬度及長(zhǎng)寬比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)不同花色花被的細(xì)胞形態(tài)存在差異。其中，綠色花被上表皮細(xì)胞近似為正方形，細(xì)胞排列緊密、間隙小，表面平整(圖3，C)，細(xì)胞面積較小，長(zhǎng)寬比為1.497(表3)；紫色花被上表皮多為橢圓形，單個(gè)細(xì)胞的裸露面大于細(xì)胞間接觸面，表面呈弧形，細(xì)胞面積較大，長(zhǎng)寬比為1.855(圖3，D；表3)。

表3 紫花含笑不同顏色花被上表皮細(xì)胞解剖形態(tài)比較

2.3.2 不同顏色花被片上表皮細(xì)胞形態(tài)比較肖文芳等[5]將蝴蝶蘭花瓣表皮細(xì)胞形態(tài)分為扁平型、穹頂型、長(zhǎng)穹頂型和乳突型。本試驗(yàn)掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，紫花含笑綠色花被上表皮細(xì)胞形態(tài)完整，均為扁平型(圖4，A)，細(xì)胞基本飽滿，細(xì)胞間隙處有輕微皺縮；細(xì)胞排列緊密，基本處于同一個(gè)平面，無(wú)空隙，具氣孔器(圖4，B)。紫花含笑紫色花被除氣孔器外(圖4，C)，上表皮細(xì)胞垂周壁上覆蓋不規(guī)則的褶皺條紋，條紋間有空隙；細(xì)胞凸起為穹頂型，細(xì)胞排列緊湊但不處于同一個(gè)平面，單個(gè)細(xì)胞呈弧形凸起(圖4，D)?；ū簧媳砥そY(jié)構(gòu)觀察結(jié)果表明，花被呈紫色過(guò)程中，表皮細(xì)胞由扁平型向圓錐凸起變化，單個(gè)細(xì)胞長(zhǎng)寬比增大，細(xì)胞垂周壁出現(xiàn)褶皺，表皮結(jié)構(gòu)形態(tài)上向增加光照吸收面積變化。

A、C.綠色花被；B,D.紫色花被;ue.上表皮; le.下表皮圖3 紫花含笑不同顏色花被上表皮色素分布及細(xì)胞形態(tài)變化A,C. Green tepal; B,D. Purple tepal; ue. Upper epidermis; le. Lower epidermisFig.3 The pigment distribution and transverse sections of upper epidermal cells in different color perianth of Michelia crassipes

A.綠色花被上表皮；B.綠色花被表皮細(xì)節(jié)圖；C.紫色花被上表皮；D.紫色花被表皮細(xì)節(jié)圖圖4 紫花含笑變色前后花被表皮結(jié)構(gòu)變化A. The upper surface of green tepal; B. The details of upper surface of green tepal; C. The upper surface of purple tepal; D. The details of upper surface of purple tepalFig.4 Electron microscopic images of the upper surface of different color perianth in Michelia crassipes

A～C. 綠色花被:A. 花被超顯微結(jié)構(gòu);B. 細(xì)胞結(jié)構(gòu);C.葉綠體結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)圖;D～F. 紫色花被:D. 花被超顯微結(jié)構(gòu);E. 細(xì)胞結(jié)構(gòu)圖;F.有色體結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)圖;Chl.葉綠體;g.基粒;O.黑色嗜鋨滴;V.液泡;M.線粒體;N.細(xì)胞核;IS.細(xì)胞間隙;P.質(zhì)體;S.淀粉粒圖5 紫花含笑兩種顏色花被超顯微結(jié)構(gòu)比較A-C. Green tepal: A. Ultrastructure of petals of green tepal; B. Cellular structure diagram; C. The details of chloroplasts; D-F. Purple tepal: D. Ultrastructure of petals of purple tepal; E. Cellular structure diagram; F. The details of chromoplasts; Chl. Chloroplast; G. Granum; O. Osmiophilic droplet; V. Vacuole; M. Mitochondrion; N. Nucleus; IS. Intercellular space; P. Plasmid; S. Starch grainsFig.5 Ultrastructure of perianth with different colors in Michelia crassipes

2.3.3 不同顏色花被細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)差異從兩種顏色花被表皮結(jié)構(gòu)觀察可知，不同顏色花被表皮結(jié)構(gòu)有所差異，現(xiàn)進(jìn)一步對(duì)花被細(xì)胞進(jìn)行超顯微觀察。結(jié)果顯示：紫花含笑綠色花被細(xì)胞有豐富的細(xì)胞器，尤以葉綠體和線粒體居多，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞質(zhì)充盈，細(xì)胞間隙較寬；液泡體積小而分散，在細(xì)胞中與其他細(xì)胞器體積約各占1/3～1/2(圖5，A、B)；葉綠體體積較大，呈長(zhǎng)橢圓形，內(nèi)部基粒片層結(jié)構(gòu)清晰(圖5，C)；花被細(xì)胞中存在大量黑色嗜鋨滴，多為圓形且體積較大(圖5，A～C)。

紫花含笑紫色花被細(xì)胞間隙相比綠色花被窄，細(xì)胞間結(jié)構(gòu)相對(duì)飽滿；出現(xiàn)葉綠體轉(zhuǎn)化為有色體的超顯微結(jié)構(gòu)，但有色體結(jié)構(gòu)細(xì)胞器數(shù)量不多，中央大液泡占據(jù)花被細(xì)胞體積最大(圖5，D)，多數(shù)細(xì)胞中央大液泡體積幾乎占據(jù)整個(gè)細(xì)胞，將細(xì)胞器擠壓向細(xì)胞邊緣凝聚；偶有細(xì)胞淀粉粒及質(zhì)體球占據(jù)細(xì)胞中央(圖5，E)；存在巨大的淀粉?，F(xiàn)象，淀粉粒近似為圓形或多邊形，質(zhì)體球體積較大(圖5，F(xiàn))。該結(jié)果表明，隨著花被顯紫色，液泡體積增大與葉綠體向有色體轉(zhuǎn)化是主要的細(xì)胞器變化。

3 討 論

色素組成及其含量的時(shí)空組合是決定花色形成的重要因素[1,4,18]，本研究中通過(guò)相關(guān)分析以及逐步回歸方程發(fā)現(xiàn)，紫花含笑花被顯紫色可能是花青素含量顯著上升，伴隨著葉綠素的降解，以及類黃酮和類胡蘿卜素含量增加起輔助增色作用所致，結(jié)果與Liu[23]研究一致。花青素含量變化也是影響蒙農(nóng)紅豆草[24]、麗格海棠[25]等植物花瓣呈色的主要色素。黃酮或黃酮醇等類黃酮物質(zhì)本無(wú)色，有顯著的輔助色素效應(yīng)，即與花青苷結(jié)合呈現(xiàn)增色效應(yīng)及紅移[1,26-27]，類胡蘿卜素與花青素復(fù)合也產(chǎn)生不同色調(diào)的紅色[8]。本研究中紫花含笑花青素、類黃酮和類胡蘿卜素含量變化及花青素/葉綠素與紅度a*值呈顯著正相關(guān)，與明度L*值、b*值顯著負(fù)相關(guān)，這與王藝光等[28]發(fā)現(xiàn)類胡蘿卜素的積累改變桂花花瓣的紅度a*值結(jié)果一致，也與花青素含量積累降低花瓣明度和黃色程度，有利于睡蓮花色紅色化原因相似[29]。

花瓣錐形表皮細(xì)胞形態(tài)能夠影響其光捕獲能力和光的反射比[30]。菊花[8]和萬(wàn)壽菊[9]細(xì)胞表型對(duì)花色變化的影響研究表明，圓錐形結(jié)構(gòu)相比扁平狀結(jié)構(gòu)入射光進(jìn)入花瓣表皮細(xì)胞的比例增加而花色加深。本研究中，紫花含笑花被呈色前后上表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)差異性變化與前人結(jié)果一致，即綠色花被表皮細(xì)胞扁平規(guī)整，而紫色花被上表皮細(xì)胞呈橢圓形凸起，表皮細(xì)胞長(zhǎng)寬比變化與色素含量均呈顯著相關(guān)；而且細(xì)胞垂周壁覆蓋褶皺條紋，說(shuō)明花瓣表皮細(xì)胞表面積增大，可能有利于入射光的吸收。

植物花色與花瓣細(xì)胞中質(zhì)體的結(jié)構(gòu)具有密切關(guān)系，煙草花蜜腺綠色轉(zhuǎn)橙過(guò)程中出現(xiàn)葉綠體向有色體轉(zhuǎn)化，并伴隨著一定程度的液泡增大[31]；矢車菊盛花期花瓣液泡明顯增大并且存在有色質(zhì)體[32]，葉綠體、淀粉體轉(zhuǎn)化為積累類胡蘿卜素的有色體細(xì)胞器結(jié)構(gòu)，是花、果實(shí)顏色黃轉(zhuǎn)橙的主要原因之一[9,33-34]。本研究中，紫花含笑花被超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞液泡體積增大及有色質(zhì)體的轉(zhuǎn)化是其花被呈紫色的主要細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化。紫花含笑花冠轉(zhuǎn)紫色過(guò)程中液泡體積占比從1/3直達(dá)2/3以上，更甚者幾乎占據(jù)整個(gè)細(xì)胞，出現(xiàn)了葉綠體結(jié)構(gòu)向淀粉粒以及有色體轉(zhuǎn)化，但數(shù)量不多，與紫被期葉綠素降解、類胡蘿卜素含量有明顯增加但含量較少結(jié)果一致?？紤]到花青素苷在細(xì)胞質(zhì)中合成，在液泡中積累[26]，因此推測(cè)紫花含笑由綠轉(zhuǎn)紫過(guò)程中，隨著花青素的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)，最終積累在液泡中從而導(dǎo)致液泡體積的增大。另外，在綠色花被細(xì)胞內(nèi)存在大量黑色嗜鋨滴，即油細(xì)胞等脂類物質(zhì)被鋨酸固定為嗜鋨滴，許多含鋨酸物質(zhì)的質(zhì)體是精油的合成場(chǎng)所[35-36]，因此推測(cè)綠被期是花香物質(zhì)合成的重要時(shí)期。

綜上所述，紫花含笑花被呈色過(guò)程中，花青素的積累伴隨著類胡蘿卜素及類黃酮等色素含量增加輔助增色可能是其花被呈紫色的主要原因，細(xì)胞結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)為液泡體積增大，葉綠體向有色體轉(zhuǎn)化?；ū怀噬嵌嘁蛩刈饔玫慕Y(jié)果，為更好地詮釋其花被呈色的成因，尚需從植物體內(nèi)色素代謝調(diào)控及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控開(kāi)展深入研究，此結(jié)果為今后木蘭科花色呈色機(jī)制研究提供細(xì)胞學(xué)依據(jù)。