根域限制對葡萄根中IAA含量及其代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

徐 巖，糾松濤，王繼源，王 磊，許文平，張才喜，趙麗萍，王世平

(上海交通大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240)

根系作為植物重要的營養(yǎng)器官，負(fù)責(zé)從土壤中吸收水分和礦質(zhì)元素，并合成氨基酸、激素等物質(zhì)[1]。20世紀(jì)90年代初期，研究人員從盆栽實(shí)踐中獲得啟發(fā)，開始探索限制植物根系的栽培方式，即根域限制栽培(root restriction cultivation)。根域限制栽培是利用物理或生態(tài)方式將植物的根系控制在一定的容積內(nèi)，通過控制根系生長來調(diào)節(jié)地上部的營養(yǎng)生長和生殖生長平衡的一種非傳統(tǒng)栽培方式[2]。先前研究表明，根域限制栽培下葡萄的根系構(gòu)型發(fā)生顯著變化[3]，葡萄果實(shí)品質(zhì)也得到顯著提升[4-5]。

內(nèi)源激素作為重要的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，尤其是對根系發(fā)生的影響。其中，吲哚-3-乙酸(IAA)是生長素(auxin)的主要活性成分，參與植物根系發(fā)育的諸多方面，其中包括調(diào)控主根生長、根毛的發(fā)育、側(cè)根原基的形成以及不定根的生長[6-8]。植物根系的生長受到根系組織中IAA濃度的影響，適當(dāng)?shù)腎AA濃度有助于根系的生長，但過高或過低的濃度均不利于根系的生長[9]。生長素在地上部生命活動(dòng)旺盛的部位合成，如莖尖、幼葉、胚芽鞘等器官，合成的生長素會(huì)暫時(shí)儲(chǔ)存在“庫”器官或者直接通過極性運(yùn)輸?shù)礁獾茸饔貌课籟10]，該過程涉及生長素的合成、極性運(yùn)輸?shù)冗^程。

植物體內(nèi)的生長素主要以色氨酸為前體，在氨基轉(zhuǎn)移酶(tryptophan aminotransferase, TAA)的作用下生成吲哚-3-丙酮酸(indole-3-pyruvate, IPA)，IPA又在黃素單加氧酶(flavin monooxygenases, YUC)的作用下形成IAA[11-12]。生長素的極性運(yùn)輸主要由向胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)腁UXIN蛋白和向胞外運(yùn)輸?shù)腜IN蛋白來實(shí)現(xiàn)[13-14]。在植物根中有2種不同的極性運(yùn)輸方式，即向基性和向頂性運(yùn)輸，主要通過AUX/LAX、PIN和ABCB/MDR/PGP等運(yùn)輸載體來完成[15]。通過AUX和PIN等運(yùn)輸載體的協(xié)同作用，IAA在根中形成濃度梯度，這是IAA對植物根系發(fā)育調(diào)控的關(guān)鍵。生長素的信號傳遞需要與受體結(jié)合來完成，目前發(fā)現(xiàn)的生長素受體有生長素結(jié)合蛋白1(auxin binding protein 1, ABP1)和運(yùn)輸抑制劑響應(yīng)蛋白1(transport inhibitor response 1, TIR1)[16-17]。此外，根系的生長不僅需要根尖分生區(qū)細(xì)胞不斷分裂增殖，還需要根伸長區(qū)細(xì)胞的伸長。CycA1、cycD3、cdc2、cycB1均屬于細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，在有絲分裂過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[18-19]。LRP1(lateral root primordia 1)在不定根及側(cè)根原基中特異表達(dá)，是一個(gè)調(diào)控根系伸長的轉(zhuǎn)錄因子，具有較強(qiáng)的組織特異性。SWP1(struwwelpeter 1)能夠結(jié)合到LRP1基因啟動(dòng)子序列，對其表達(dá)起抑制作用。

近年來，根域限制栽培技術(shù)在葡萄生產(chǎn)過程中得到了廣泛應(yīng)用，關(guān)于根域限制栽培影響葡萄根系發(fā)育和果實(shí)品質(zhì)的研究也日漸深入[20-21]，但是根域限制是如何調(diào)控葡萄根中生長素代謝、根發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)水平來影響內(nèi)源IAA的合成和分配，進(jìn)而影響其根系構(gòu)型的還不清晰。因此，本研究以一年生‘玫瑰香’葡萄為試驗(yàn)材料，對根域限制和傳統(tǒng)栽培下的葡萄根系中生長素的含量、生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因(VvTAA1、VvTAR2、VvYUC2、VvYUC4、VvYUC6、VvYUC8、VvABP1、VvTIR1、VvAUX1、VvLAX1、VvLAX2、VvLAX3、VvPIN1、VvPIN4、VvABCB1和VvABCB19)、細(xì)胞周期相關(guān)基因(VvcycA1、VvcycB1、VvcycD3和Vvcdc2)和根系伸長相關(guān)基因(VvLRP1和VvSWP1)表達(dá)豐度進(jìn)行檢測，以期闡明根域限制栽培影響葡萄根系構(gòu)型變化的內(nèi)在機(jī)制，從而進(jìn)一步完善根域限制栽培理論。

1 材料和方法

1.1 材料及處理

本研究以300株一年生‘玫瑰香’葡萄扦插苗為試驗(yàn)材料，定植于上海交通大學(xué)果樹研究室玻璃溫室(31°11′N，121°29′E)內(nèi)。其中，150株采取根域限制栽培(簡稱限根組)，定植在直徑30 cm、高40 cm的限根器中，限根器的四周分布著透水孔，下部用塑料托盤與地面隔開；將土壤、有機(jī)肥、河沙按照1∶1∶1混合作為栽培基質(zhì)。其余150株采取傳統(tǒng)地栽方式(非根域限制栽培，簡稱對照組)，將溫室中的土壤深翻20 cm后，在其上堆積相同成分的栽培基質(zhì)，形成厚度為40 cm、寬300 cm的栽培床。對照組初始栽培株行距為60 cm ×60 cm，為保證不同植株間根系發(fā)育有足夠的空間，我們采取間伐的策略進(jìn)行樣品采集。2種栽培模式下地上部管理方式一致，均保持單蔓生長，每周對副梢進(jìn)行一次修剪，所有試驗(yàn)材料均配置統(tǒng)一的滴灌設(shè)備。肥水管理參照婁玉穗等[5]的方法進(jìn)行。

1.2 樣品采集

實(shí)驗(yàn)材料定植于2019年3月29日，經(jīng)過10 d的緩苗，分別于定植后10、25、40、55、70、85、100、115、130、145、160和205 d采集限根組和對照組植株的根系樣品，限根組和對照組分別記為RR和nR。由于定植后10和25 d新生白根數(shù)量少，分別選取18株樹進(jìn)行取樣，6株為一個(gè)重復(fù)，共設(shè)置3組重復(fù)；隨后白根數(shù)量增加，每個(gè)取樣點(diǎn)分別選取6株樹，2株為一個(gè)重復(fù)，設(shè)置3組重復(fù)。為保證根系完整性，采用流水沖洗根部周圍土壤，挖取植株時(shí)，以葡萄的主干為中心，以冠幅為參考標(biāo)準(zhǔn)確定根部挖取范圍；限根組葡萄根系采樣時(shí)，用流水將限根器內(nèi)的土壤淋濕，后將限根器拆開，同樣用流水將土壤沖散，取出葡萄全根系。清洗干凈取出的葡萄全根系，用吸水紙吸干，將葡萄根系均勻攤開、置于黑色背景布上拍照。同時(shí)取下幼嫩的白根，迅速用液氮處理，并保存于-80 ℃超低溫冰箱中備用。

1.3 生長素含量測定

葡萄根中生長素(IAA)含量利用固相萃取反相高效液相色譜熒光檢測法，參照Xin等[22]和符繼紅等[23]的方法。色譜柱采用Waters sunfire C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-10 mmol/L乙酸鈉(20∶80，V/V，乙酸調(diào)節(jié)至pH 3.5)。在流速1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，柱溫20 ℃，樣品溫度10 ℃，熒光激發(fā)和發(fā)射波長分別為275和345 nm條件下，分離測定IAA含量。

1.4 根系細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察

選取限根組和對照組中定植70 d的葡萄根系進(jìn)行細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察。觀察的根系樣品包括老根從距離根莖連接處2 cm處橫剖、幼根從距離根尖2 cm處橫剖、幼根根尖縱剖和毛細(xì)根橫剖。石蠟切片的制作過程參照安吉翠[24]的方法。制片完成后使用Olympus BX61顯微鏡進(jìn)行觀察攝影。

1.5 基因表達(dá)分析

1.5.1 總RNA提取總RNA的提取使用Tiangen公司的RNA plant plus Reagent植物總RNA提取試劑盒，按照說明書步驟操作。

1.5.2 引物設(shè)計(jì)利用Primer 5軟件進(jìn)行特異性引物設(shè)計(jì)，要求上游引物和下游引物的Tm值相差在1 ℃以內(nèi)，GC含量保持在40%～60%；引物長度保持在17～25個(gè)堿基對(base pair，bp)；引物合成后，稀釋成100 μmol/L的母液，-20 ℃保存?zhèn)溆茫脮r(shí)可稀釋成10 μmol/L的工作液使用。引物序列見表1，委托上海睿勉生物進(jìn)行引物合成。

1.5.3 cDNA的合成和熒光定量PCR以總RNA為模板，參照TaKaRa的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，使用1.5.2中合成的引物序列，參考TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒的使用步驟，利用Bio-Rad iQ5(Hercules, CA, USA)熒光定量PCR儀檢測目的基因的表達(dá)水平。優(yōu)化后的反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性60 s；95 ℃變性 5 s，60 ℃退火 15 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 20 s。試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。參考Jiu等[25-26]的方法，以葡萄KyActin1基因作為內(nèi)參基因，各基因的定量水平采用2-ΔΔCt方法計(jì)算。

1.6 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2010和SAS 9.2軟件(SAS Institute, Cary, North Carolina)對獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)及最小顯著性差異法(LSD法)檢驗(yàn)(P<0.01)，使用Origin 9軟件制圖。

表1 用于熒光定量PCR 的 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 根域限制對葡萄根系構(gòu)型和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響

首先，與對照組相比，限根組葡萄根系構(gòu)型發(fā)生顯著變化，主要表現(xiàn)在根域限制后根尖處出現(xiàn)大量集群根、不定根持續(xù)發(fā)生、根系出現(xiàn)螺旋卷曲(圖1,A)。其次，根域限制栽培后，由于葡萄的根系構(gòu)型發(fā)生了極顯著的改變，與之密切相關(guān)的根系細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞大小也會(huì)相應(yīng)發(fā)生改變(圖1,B)。其中，葡萄老根的細(xì)胞在根域限制處理后大部分呈圓形或橢圓，相比較而言，對照組老根的細(xì)胞大部分呈長方形，細(xì)胞排列更緊密(圖1，B、a)；葡萄具有吸收能力的毛細(xì)根結(jié)構(gòu)在根域限制后也出現(xiàn)了顯著的變化，具體表現(xiàn)在表皮細(xì)胞分布更均勻，中柱鞘和皮層細(xì)胞更大，內(nèi)皮層細(xì)胞更厚(圖1，B、b)；葡萄幼根根尖的根冠區(qū)對根尖主要起到保護(hù)作用，根域限制處理后，其根冠區(qū)明顯更厚(圖1，B、c)；而且根域限制栽培下幼根細(xì)胞排列更疏松，細(xì)胞更長、更大(圖1，B、d)。

2.2 根域限制對葡萄根中IAA含量的影響

為進(jìn)一步解析根域限制影響葡萄根系構(gòu)型的機(jī)理，本研究采用液質(zhì)聯(lián)用法(HPLC-MS/MS)分析了根域限制對一年生‘玫瑰香’葡萄幼嫩根系中IAA含量的影響(圖2)。其中，在定植后40、100、145和205 d，限根組葡萄幼根中IAA含量極顯著低于對照組(P<0.01)，尤其在定植后205 d時(shí)，對照組根系中IAA含量高達(dá)255.2 ng/g，約是對照組的19.0倍。整體來看，限根組葡萄根系中IAA含量在4個(gè)采樣時(shí)期呈現(xiàn)先降低后上升的趨勢，而在對照組中IAA的含量呈現(xiàn)先升高后降低然后又快速上升的趨勢。由此可見，根域限制處理不僅對葡萄根中IAA的含量產(chǎn)生影響，還使得IAA含量在不同時(shí)期發(fā)生顯著動(dòng)態(tài)變化。

不同大寫字母表示相同時(shí)期nR和RR之間在0.01 水平差異顯著(P<0.01)；下同圖2 根域限制條件下“玫瑰香”葡萄的根系IAA含量的變化Different capital letters indicate significant differences between nR and RR on the same growth days at the 0.01 level (P<0.01); the same for the following figuresFig.2 The root IAA content of grapevine (Vitis vinifera L. cv. Muscat Hamburg) under root restriction treatment

2.3 根域限制對葡萄細(xì)胞周期和根伸長相關(guān)基因表達(dá)的影響

通過形態(tài)學(xué)觀察和解剖結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，根域限制抑制葡萄不定根的伸長、致使不定根的根尖簇生大量集群根，根尖膨大且伴有明顯的增生。因此，本研究對幾個(gè)與細(xì)胞周期調(diào)控和根伸長相關(guān)的基因進(jìn)行了qRT-PCR分析。結(jié)果(圖3)顯示，在大多數(shù)取樣時(shí)期，根域限制處理對葡萄細(xì)胞周期調(diào)控和根伸長相關(guān)基因的表達(dá)水平產(chǎn)生了顯著的影響。首先，根域限制對細(xì)胞周期調(diào)控基因VvcycA1、VvcycB1、Vvcdc2、Vvcycd3表達(dá)量的影響存在相似性，大部分時(shí)間都顯著高于同期對照(圖3，Ⅰ～Ⅳ)。其中，限根組VvcycA1基因表達(dá)量除在定植后10 d顯著低于對照，在定植40和55 d與對照相近外，其余時(shí)間與對照組相比均顯著上調(diào)表達(dá)；而根域限制顯著誘導(dǎo)VvcycB1基因在定植后70、85、100、130和205 d時(shí)比對照組上調(diào)表達(dá)，在定植10、140和160 d時(shí)下調(diào)表達(dá)；限根組Vvcdc2基因的表達(dá)量除定植后25和55 d顯著低于對照組外，其余10個(gè)采樣時(shí)期均顯著高于對照組；同樣，限根組Vvcycd3的表達(dá)量在定植后160 d比對照組顯著下調(diào)，在定植10、25和145 d與對照組相近，其余取樣時(shí)期均顯著高于對照組。由此可知，根域限制可能通過誘導(dǎo)VvcycA1、VvcycB1、Vvcycd3和Vvcdc2基因的上調(diào)表達(dá)來加快細(xì)胞分裂的進(jìn)程。其次，根域限制也顯著影響根伸長相關(guān)的基因VvLRP1和VvSWP1的表達(dá)(圖3，Ⅴ、Ⅵ)。其中，與對照組相比，根域限制在定植后的7個(gè)采樣時(shí)期均顯著抑制VvLRP1的表達(dá)水平，而在定植后的9個(gè)采樣時(shí)期顯著促進(jìn)VvSWP1的表達(dá)水平，說明這兩個(gè)基因在根域限制誘導(dǎo)下發(fā)揮相互拮抗的作用。然而，根域限制處理后VvLRP1基因上調(diào)表達(dá)的5個(gè)時(shí)期，VvSWP1基因同樣上調(diào)表達(dá)，又說明在有些時(shí)期二者發(fā)揮著協(xié)同的作用。由此可以看出，根域限制處理后，VvLRP1和VvSWP1在根系不同發(fā)育階段發(fā)揮的作用存在較大差異。

2.4 根域限制對葡萄生長素代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.4.1 生長素合成相關(guān)基因表達(dá)前人研究表明，IPA途徑對擬南芥中的生長素生物合成至關(guān)重要，并且YUC家族是該途徑中的限速步驟[27]。本研究結(jié)果顯示，葡萄根中IAA合成相關(guān)基因VvTAA1、VvTAR2、VvYUC2、VvYUC4、VvYUC6和VvYUC8的表達(dá)在根域限制條件下受到了不同程度的影響(圖4)。其中，根域限制葡萄根系VvTAA1基因在定植10～40 d下調(diào)表達(dá)，從定植55 d開始受到顯著誘導(dǎo)并上調(diào)表達(dá)，其在定植后115 d時(shí)表現(xiàn)尤為明顯，限根組表達(dá)量約是對照的26.2倍；隨后除定植160 d顯著下調(diào)表達(dá)外，其余時(shí)期仍表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)(圖4，Ⅰ)。與VvTAA1基因表現(xiàn)相反，VvTAR2基因表達(dá)量在采樣前期受根域限制的上調(diào)誘導(dǎo)更為明顯，尤其在定植55 d時(shí)表現(xiàn)最為突出，限根組表達(dá)量約是對照的31.2倍；之后，短暫顯著下調(diào)表達(dá)(定植70 d)，再持續(xù)上調(diào)表達(dá)(定植85～130 d)；隨之，在定植145～205 d顯著下調(diào)表達(dá)(圖4，Ⅱ)。同時(shí)，與對照組相比，葡萄根系VvYUC2和VvYUC4基因的表達(dá)水平在根域限制誘導(dǎo)下多數(shù)時(shí)期均上調(diào)，而VvYUC6和VvYUC8基因多數(shù)時(shí)期表達(dá)量均下調(diào)(圖4，Ⅲ～Ⅵ)。整體來看，在定植后100、145和205 d時(shí)，葡萄根系中VvYUC6的表達(dá)量與IAA含量變化一致，而在定植后40、145和205 d時(shí)，根中VvYUC8的表達(dá)量與IAA含量變化一致，說明這兩個(gè)基因可能在葡萄根域限制調(diào)控根系IAA合成中發(fā)揮著重要的作用。

圖3 根域限制條件下葡萄幼根中細(xì)胞周期和根伸長基因表達(dá)的變化Fig.3 Changes in expression levels of cell cycle and root growth regulatory genes of grapevine (Vitis vinifera L. cv. Muscat Hamburg) roots under root restriction treatment

圖4 根域限制條件下葡萄根系IAA合成相關(guān)基因表達(dá)的變化Fig.4 Changes in expression levels of IAA biosynthesis genes of grapevine (Vitis vinifera L. cv. Muscat Hamburg) under root restriction treatment

圖5 根域限制條件下葡萄根系IAA受體基因表達(dá)的變化Fig.5 Changes in expression levels of IAA receptor genes of grapevine (Vitis vinifera L. cv. Muscat Hamburg) roots under root restriction treatment

2.4.2 生長素受體基因表達(dá)生長素與受體結(jié)合后才能實(shí)現(xiàn)信號的順利傳遞，從而發(fā)揮調(diào)控作用[16]。目前已經(jīng)明確的IAA受體蛋白有ABP1和TIR1[17,28-29]。qPCR分析結(jié)果也顯示，根域限制下葡萄根系生長素受體基因VvABP1和VvTIR1的表達(dá)量均發(fā)生了顯著變化(圖5)。其中，根域限制處理根系VvABP1基因的表達(dá)水平在定植后25、85、100和205 d時(shí)均顯著高于對照組，而在定植后10、55、70、115、130和160 d時(shí)均顯著低于相應(yīng)對照組，尤其在定植后160 d時(shí)約是對照組的1/14(圖5，Ⅰ)；同時(shí)，根域限制處理在定植后70、100、130和205 d時(shí)均顯著誘導(dǎo)根系中VvTIR1基因的上調(diào)表達(dá)，特別在定植后130 d時(shí)表達(dá)豐度最高，根域限制的誘導(dǎo)效果最為顯著；而對照組根系中VvTIR1基因在定植后160 d時(shí)表達(dá)豐度最高(圖5，Ⅱ)。整體來看，葡萄根系VvABP1和VvTIR1基因在整個(gè)采樣時(shí)期的表達(dá)變化趨勢較為一致。

圖6 根域限制條件下葡萄根系中IAA運(yùn)輸相關(guān)基因表達(dá)的變化Fig.6 Changes in expression levels of IAA transport-related genes of grapevine (Vitis vinifera L. cv. Muscat Hamburg) roots under root restriction treatment

2.4.3 生長素運(yùn)輸相關(guān)基因表達(dá)生長素主要依賴細(xì)胞膜上的載體蛋白實(shí)現(xiàn)向細(xì)胞內(nèi)外的運(yùn)輸，AUX/LAX家族是IAA向細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)妮d體蛋白[30]，而ABCB/PGP/MDR家族和PIN蛋白家族是IAA向細(xì)胞外運(yùn)輸?shù)妮d體[31]。圖6顯示，葡萄根系VvAUX1等8個(gè)生長素運(yùn)輸相關(guān)基因在根域限制后的表達(dá)模式存在一定的相似性，它們在定植后70、85和130 d時(shí)均受到顯著誘導(dǎo)而上調(diào)表達(dá)，這與上述根域限制下根系大量發(fā)生的時(shí)期相吻合，而它們在定植后145和160 d時(shí)的表達(dá)豐度與其他時(shí)期相比處于較低的水平。其中，在定植后70 d，根域限制誘導(dǎo)VvAUX1(圖6，Ⅰ)和VvLAX2(圖6，Ⅲ)上調(diào)表達(dá)效果最為顯著；根域限制誘導(dǎo)VvLAX1(圖6，Ⅱ)和VvLAX3(圖6，Ⅳ)的表達(dá)量均在定植后130 d達(dá)到峰值，分別為同期對照組的2.7和5.1倍；根系VvPIN1和VvPIN4的表達(dá)模式較為相似，它們在限根組定植后55～130 d以及205 d時(shí)的表達(dá)水平均顯著高于對照組，并以定植后85 d和130 d時(shí)受到根域限制的誘導(dǎo)作用最為顯著，且兩基因均在定植后85 d時(shí)增長幅度最大，此時(shí)限根組分別為對照組的15.1和23.7倍(圖6，Ⅴ、Ⅵ)；在定植后70 d、85 d、100 d、130 d和205 d，根域限制組中VvABCB1的表達(dá)量顯著高于對照組，而在其他時(shí)期均低于對照組(圖6，Ⅶ)；在定植后25、55、85、100、115、130和205 d時(shí)，根域限制組中VvABCB19的表達(dá)量均顯著高于對照組，而在其他時(shí)期與對照組相比沒有顯著性差異(圖6，Ⅷ)。整體來看，在多數(shù)時(shí)期，根域限制處理均能顯著誘導(dǎo)生長素運(yùn)輸相關(guān)基因的表達(dá)水平，也表明根域限制加快了葡萄根中生長素的運(yùn)輸過程。

3 討 論

3.1 根域限制對葡萄根系細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞周期和根系伸長的影響

與傳統(tǒng)地栽組相比，葡萄根系構(gòu)型在根域限制后發(fā)生極顯著變化，主要表現(xiàn)在根尖處出現(xiàn)大量集群根、不定根持續(xù)發(fā)生、根系出現(xiàn)螺旋卷曲，其表型改變與根系細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞大小的改變密切相關(guān)。根域限制處理后，根系細(xì)胞排列更加疏松，說明細(xì)胞需要不斷脫落更新，這與根域限制后根系更新加快的表型吻合。其次，可能由于限根器對根尖存在壓力脅迫，導(dǎo)致幼根根尖的根冠區(qū)更厚，從而實(shí)現(xiàn)對根尖的保護(hù)。另外，由于根系被局限在一定的容積內(nèi)，導(dǎo)致吸收根更多、更粗壯，吸收根的內(nèi)皮層細(xì)胞則更厚，中柱鞘和皮層細(xì)胞都更大。

根系的伸長得益于根尖分生區(qū)細(xì)胞的分裂和伸長區(qū)細(xì)胞的延伸。本研究篩選了細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因VvcycA1、VvcycB1、VvcycD3和Vvcdc2以及根系伸長相關(guān)的基因VvLRP1和VvSWP1進(jìn)行表達(dá)分析。在8月中旬到11月初，葡萄細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因VvcycA1、VvcycB1、VvcycD3和Vvcdc2的表達(dá)量受到根域限制誘導(dǎo)呈現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)，這也與該時(shí)期根系快速更新的變化相一致。然而，在4月初到5月中下旬，根域限制組和對照組中上述基因的表達(dá)量幾乎沒有顯著差異，可能是由于在根域限制處理的前期，限根器對根系伸長生長的阻礙作用尚不明顯，使得根系中細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)未發(fā)生顯著變化。LRP1基因在不定根及側(cè)根原基中特異表達(dá)，對根系伸長和側(cè)根發(fā)生起到了促進(jìn)作用[32]。SWP1基因位于LRP1基因的上游，會(huì)抑制LRP1基因發(fā)揮作用。前人研究表明，敲除SWP1基因使得LRP1的表達(dá)量上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)擬南芥根系的伸長生長[32-33]。本研究結(jié)果表明，在定植后10、70、85、100和205 d，葡萄根域限制顯著誘導(dǎo)VvLRP1基因上調(diào)表達(dá)，潛在表明上述時(shí)期側(cè)根發(fā)生和根系伸長的速度快于對照組。然而，本項(xiàng)研究也發(fā)現(xiàn)，根域限制處理后，VvLRP1和VvSWP1在葡萄根系不同發(fā)育階段發(fā)揮的作用存在較大差異，二者在部分時(shí)期協(xié)同調(diào)控根系生長，而在有些時(shí)期VvSWP1的上調(diào)表達(dá)會(huì)抑制VvLRP發(fā)揮作用，這與Krichevsky等[32]的研究結(jié)果有差異。

3.2 根域限制對葡萄根系生長素代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

植物根中的IAA主要依賴于根尖自身合成和地上部幼嫩組織合成后轉(zhuǎn)運(yùn)而來。因此，要明確根域限制對根中IAA含量的影響，不僅要分析根域限制處理對IAA合成基因的影響，還要分析根域限制對IAA運(yùn)輸相關(guān)基因的影響。本研究結(jié)果表明，在定植后40、100、145和205 d時(shí)，根域限制組葡萄根中IAA的含量均顯著低于對照組。同時(shí)，6個(gè)IAA合成相關(guān)基因中僅有VvYUC6和VvYUC8的表達(dá)模式與IAA含量變化趨勢較為一致，表明這2個(gè)基因可能對于根域限制下葡萄根中IAA合成發(fā)揮著重要的作用；而其他幾個(gè)基因，諸如VvYUC2、VvTAA1等，在多數(shù)時(shí)期卻受到根域限制處理的誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，這與根域限制下根中IAA含量下降的趨勢不一致。這可能從側(cè)面反映出，根域限制可能對葡萄根中IAA的極性運(yùn)輸產(chǎn)生了更大的影響。植物根中生長素的極性運(yùn)輸包括向基性和向頂性兩個(gè)不同方向，其中多種生長素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與該過程[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，在葡萄定植后的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)，根系向基性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因VvAUX1、VvPIN1和VvPIN4的表達(dá)水平明顯上調(diào)，同時(shí)向頂性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因VvLAX1/2/3、VvABCB1和VvABCB1的表達(dá)也受到根域限制的誘導(dǎo)呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)。表明葡萄根域限制致使生長素的極性運(yùn)輸加劇，這可能是因?yàn)楦蛳拗葡赂蚩臻g有限，根系生長受限，幼嫩部位合成的生長素只有通過加快極性運(yùn)輸進(jìn)程才能使葡萄抵御這一根域逆境脅迫。因此，根域限制通過調(diào)控生長素合成和極性運(yùn)輸相關(guān)的基因表達(dá)豐度來影響根系中生長素的合成和運(yùn)輸。

綜上所述，根域限制下葡萄根系構(gòu)型、細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及內(nèi)源IAA均發(fā)生顯著變化。此外，根域限制可能通過改變了根系中生長素合成和極性運(yùn)輸相關(guān)基因的表達(dá)豐度，從而影響根系中生長素的合成和運(yùn)輸，進(jìn)而改變了葡萄的根系構(gòu)型以適應(yīng)根域限制的栽培環(huán)境。該研究有助于闡明根域限制栽培影響葡萄根系構(gòu)型變化的內(nèi)在機(jī)制，為進(jìn)一步完善根域限制栽培理論奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。