檀香小G蛋白R(shí)ac1基因的克隆與功能分析

卞 展， 劉小金，洪 舟， 張寧南，孟 森， 徐大平

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 熱帶林業(yè)研究所，國(guó)家林業(yè)和草原局熱帶林業(yè)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510520)

檀香(SantalumalbumL.)為檀香科(Santalaceae)檀香屬半寄生小喬木，主要分布于印度、印尼和澳洲等地區(qū)[1]。檀香心材含有獨(dú)特香氣，主要用于高檔家具制造。同時(shí)，從檀香心材提取出的精油是高級(jí)化妝品和醫(yī)藥行業(yè)的重要原料。檀香是檀香屬中經(jīng)濟(jì)價(jià)值最高的珍貴用材樹(shù)種[1-3]。全世界檀香的年需求量估計(jì)在1萬(wàn)噸以上，而年產(chǎn)量只能滿(mǎn)足約四分之一，市場(chǎng)供需矛盾十分突出，價(jià)格日益昂貴。然而在巨大經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動(dòng)下，過(guò)度開(kāi)發(fā)和非法貿(mào)易導(dǎo)致檀香野生自然資源破壞殆盡，瀕臨滅絕[4]。

檀香是一種半寄生植物，其葉片具有正常的光合作用能力，但其部分根系必須通過(guò)特化的寄生器官——吸器侵入鄰近植物根系上，通過(guò)木質(zhì)部融合連接，從寄主體內(nèi)攝取生長(zhǎng)所需要的水分和營(yíng)養(yǎng)[5]。選擇一種適宜的寄主植物會(huì)直接影響檀香各培育階段的成活率和生長(zhǎng)狀況，這對(duì)于檀香人工栽培來(lái)說(shuō)至關(guān)重要，而吸器的形成及能否成功侵入寄主植物是檀香人工造林成敗的關(guān)鍵。吸器是寄生植物與寄主植物建立水分和養(yǎng)分傳遞的通道，但吸器發(fā)育的誘導(dǎo)因子和發(fā)育過(guò)程十分復(fù)雜。許多特定的化學(xué)物質(zhì)如苯醌類(lèi)、香草酸、松柏醇及激素(細(xì)胞分裂素、生長(zhǎng)素)均能誘導(dǎo)寄生植物吸器的形成[4-13]。研究表明，醌還原酶QR1通過(guò)催化 2,6-二甲氧基對(duì)苯醌(DMBQ)及其衍生物產(chǎn)生活性氧(ROS，reactive oxygen species)，可以誘導(dǎo)吸器形成[6-8]。這些吸器誘導(dǎo)因子(haustorium-inducing factors，HIFs)可能通過(guò)啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)，導(dǎo)致寄生植物根中活性氧的積累進(jìn)而誘導(dǎo)吸器的形成[9-14]。但是到目前為止，寄生植物獨(dú)特的吸器發(fā)育過(guò)程仍舊缺乏系統(tǒng)研究，其分子機(jī)理十分欠缺。

植物Rac蛋白家族屬于低分子量GTP結(jié)合蛋白R(shí)OP家族，根據(jù)其C端保守基序和轉(zhuǎn)錄后修飾，分為Rac Ⅰ和Rac Ⅱ兩個(gè)亞家族[15]。兩類(lèi)Rac蛋白廣泛參與側(cè)根發(fā)育、花粉管極性生長(zhǎng)、次生細(xì)胞壁合成及細(xì)胞程序性死亡等信號(hào)途徑的調(diào)控，因此又被稱(chēng)為“分子開(kāi)關(guān)”[15-17]。Rac分子開(kāi)關(guān)的功能狀態(tài)主要取決于結(jié)合GTP或GDP的狀態(tài)：當(dāng)與GTP結(jié)合時(shí)處于激活狀態(tài)，有功能活性；當(dāng)與GDP結(jié)合時(shí)，處于失活狀態(tài)，無(wú)功能活性[17]。目前研究普遍認(rèn)為Rac蛋白是通過(guò)互作激活呼吸爆發(fā)氧化酶蛋白(Rboh)，進(jìn)而產(chǎn)生ROS信號(hào)介導(dǎo)調(diào)控各種生理途徑[15,18-19]。前期研究中發(fā)現(xiàn)檀香SaRboh蛋白受到吸器誘導(dǎo)因子DMBQ的顯著誘導(dǎo)，且SaRboh蛋白產(chǎn)生的ROS信號(hào)是檀香吸器發(fā)育所必需，但Rac蛋白是否也參與了檀香吸器的形成過(guò)程仍不清楚。

本研究以檀香為材料，對(duì)檀香SaRac1基因進(jìn)行了克隆及生物信息學(xué)分析，并對(duì)其亞細(xì)胞定位、組織表達(dá)特性、對(duì)吸器誘導(dǎo)因子響應(yīng)等進(jìn)行了分析，為探究SaRac1基因調(diào)控ROS信號(hào)并介導(dǎo)檀香吸器發(fā)育的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

供試檀香(SantalumalbumLinn.)材料為本實(shí)驗(yàn)室保存，種植于中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所(廣州，23°11′N(xiāo), 113°23′E)。取幼葉、成熟葉、老葉、莖、根、吸器6個(gè)組織樣品，每個(gè)組織3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，凍存于-80 ℃冰箱。

基因克隆所用大腸桿菌DH5α、pSuper載體為林木遺傳與育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、高保真酶、熒光定量試劑盒購(gòu)自天根公司。RNA快速提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega 公司。pEASY無(wú)縫克隆試劑盒購(gòu)自北京全式金公司。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA提取、cDNA合成與基因克隆cDNA根據(jù)植物RNA提取試劑盒(Omega，R6834-01)操作說(shuō)明書(shū)，提取檀香總RNA。瓊脂糖凝膠和紫外分光度計(jì)(Nanodrop 2000，賽默飛公司，美國(guó))檢測(cè)RNA質(zhì)量和濃度。利用天根反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)檀香基因組數(shù)據(jù)得到的SaRac1基因序列，設(shè)計(jì)上游引物(5′-ATGAGCGCATCAAGATTCA-3′)和下游引物(5′-TAGTATGGAGCAGGCCTTCTGTACCT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物純化回收后，一步法無(wú)縫連接到pSuper載體，化學(xué)轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐霉素抗性篩選后，挑取單克隆并進(jìn)行PCR鑒定及測(cè)序。

1.2.2SaRac1基因生物信息學(xué)分析SaRac1基因和蛋白序列比對(duì)通過(guò)Clustal W軟件進(jìn)行；蛋白質(zhì)理化性質(zhì)(分子量、等電點(diǎn)、親水性系數(shù))通過(guò)ProtParam 軟件(http://web.expasy.org/protparam/)在線分析[20]。蛋白亞細(xì)胞定位利用WoLF PSORT 軟件(http://www.genscript.com/wolf-psort.html)在線預(yù)測(cè)[21]。SWISS-MODEL同源建模預(yù)測(cè)其蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)[3]。系統(tǒng)進(jìn)化用MEGA 6.0軟件進(jìn)行分析繪制[3]。

1.2.3 SaRac1蛋白亞細(xì)胞定位將SaRac1無(wú)縫連接到pBWA(V)HS載體(35S：SaRac1-GFP融合表達(dá))，參照課題組之前方法制備擬南芥葉片原生質(zhì)體并瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，NLS-mKate 作為核定位marker，采用Leica TCS SP8激光共聚焦顯微鏡觀察SaRac1蛋白定位[22]。

1.2.4SaRac1基因組織表達(dá)特異性分析以檀香Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因(上游：5′-CTCATTTTGCCAGGCCGAAT-3′，下游：5′-CTCTTTACCCAGTACCGGCA-3′)，利用Primer 3.0軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物。分別提取檀香幼葉、成熟葉、老葉、莖、根、吸器6個(gè)組織RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，實(shí)時(shí)熒光定量PCR參照SYBR Green Premix Ex Taq Ⅱ Kit(天根生物)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，設(shè)計(jì)上游引物(5′-AGGGTTGTGGGATACTGCTG-3′)和下游引物(5′-AAAGCTGGCCTTGCTAATGA-3′)，反應(yīng)體系為：SYBR Premix 10 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL，dd H2O 6 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。3次生物學(xué)重復(fù)，3次技術(shù)重復(fù)。

1.2.5SaRac1基因?qū)ξ髡T導(dǎo)因子的響應(yīng)分析從中國(guó)林業(yè)科學(xué)院熱帶林業(yè)研究所苗圃中選取長(zhǎng)勢(shì)一致的檀香幼苗(高度10 cm)，采用溫室控制盆栽試驗(yàn)，將檀香移植于盆中央(泥炭土∶蛭石∶珍珠巖=3∶2∶2，v/v/v)，待檀香幼苗生長(zhǎng)相對(duì)穩(wěn)定后，每周澆霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液澆100 mL，持續(xù)4周，選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗，添加10 μmol/L 2, 6-二甲氧基對(duì)苯醌(寄生植物吸器誘導(dǎo)因子)為處理，不添加任何物質(zhì)為空白對(duì)照，10 μmol/L 的2, 6-二叔丁基苯醌(DBQ)為陰性對(duì)照。以早上8：00為處理的時(shí)間起點(diǎn)，分別在處理后0、0.5、1、2、4、8和24 h取根樣品，3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，以Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，檢測(cè)SaRac1基因?qū)Ω鱾€(gè)處理的表達(dá)響應(yīng)，同時(shí)統(tǒng)計(jì)1個(gè)月后的檀香根部吸器數(shù)量。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，并進(jìn)行3個(gè)技術(shù)重復(fù)。采用SPSS20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SaRac1基因克隆

通過(guò)設(shè)計(jì)引物，對(duì)SaRac1開(kāi)放閱讀框進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)克隆測(cè)序得到該基因大小為594 bp，編碼197個(gè)氨基酸(圖1)。利用在線分析軟件對(duì)蛋白基本理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)SaRac1蛋白分子量約21.55kD，理論等電點(diǎn)9.32，親水性系數(shù)為-0.083，為親水性蛋白, 不含跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽。通過(guò)分析，該蛋白在N端為保守的G結(jié)構(gòu)域，包括：GTP酶活性結(jié)構(gòu)域(G1、G3)、Mg2+離子結(jié)合效應(yīng)區(qū)(G2)和GTP結(jié)合位點(diǎn)(G4、G5)。其中G2、G3結(jié)構(gòu)域也稱(chēng)轉(zhuǎn)換結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Ⅱ (switch Ⅰ and Ⅱ loops)，第21位和156位為G結(jié)構(gòu)域保守的半胱氨酸殘基(圖1)。蛋白C端具有CaaL保守基序，其上游具有高度可變的富含堿性氨基酸區(qū)域，使蛋白C端形成了可富集正電荷的游離尾部(圖1)。同時(shí)檀香SaRac1和擬南芥Rac基因家族進(jìn)化樹(shù)分析表明，SaRac1蛋白和AtRac1～6、AtRac9和AtRac11蛋白同屬于典型且保守的植物Rac Ⅰ 家族蛋白(圖2)。

At. 擬南芥；Os. 水稻；Sa. 檀香圖1 檀香SaRac1蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果At. Arabidopsis thaliana；Os. Oryza sativa；Sa. Santalum albumFig.1 Domain prediction of SaRac1

At. 擬南芥；Sa. 檀香圖2 檀香SaRac與擬南芥AtRac蛋白的進(jìn)化樹(shù)分析At. Arabidopsis thaliana；Sa. Santalum albumFig.2 Phylogenetic tree analysis of Rac proteins from Santalum album and Arabidopsis thaliana

2.2 SaRac1蛋白亞細(xì)胞定位

通過(guò)擬南芥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法進(jìn)一步檢測(cè)了SaRac1蛋白的亞細(xì)胞定位，以帶有GFP空載體為對(duì)照，通過(guò)比較SaRac1蛋白融合GFP的載體定位情況，發(fā)現(xiàn)SaRac1蛋白主要定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)(圖3)。

2.3 SaRac1基因組織特異性分析

由圖4可知，SaRac1基因在檀香各個(gè)組織均有表達(dá)，但組織間表達(dá)水平差異很大。在根和吸器中表達(dá)量最高，幼葉和莖中表達(dá)量較高，而在成熟葉和老葉中表達(dá)量最低。以成熟葉中SaRac1表達(dá)量作為衡量標(biāo)準(zhǔn)，SaRac1基因在根和吸器中表達(dá)量分別是成熟葉的8和6.7倍，而幼葉、莖和老葉中表達(dá)量分別為成熟葉的2.8、2.6和0.6倍。

不同字母表示處理間差異顯著，P < 0.05，下同圖4 檀香SaRac1基因在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量Different letters represent significant differences among tissues, P < 0.05. The same as belowFig.4 Relative expression level of SaRac1 gene in different tissues of S. album

35S∶GFP表示GFP空載體；SaRac1-GFP表示SaRac1蛋白和GFP蛋白融合表達(dá)載體；NLS-mKate表示核定位marker圖3 檀香SaRac1蛋白亞細(xì)胞定位35∶GFP was plasmid containing GFP alone; SaRac1-GFP was fusion plasmid; NLS-mKate was used as a nuclear localization markerFig.3 Subcellular localization of SaRac1

圖5 不同處理對(duì)檀香SaRac1基因相對(duì)表達(dá)量和檀香吸器數(shù)量影響Fig.5 The relative expression level of SaRac1 gene and haustoria development after treatments

2.4 SaRac1基因?qū)ξ髡T導(dǎo)因子的響應(yīng)分析

采用RT-PCR方法，對(duì)吸器誘導(dǎo)因子DMBQ處理不同時(shí)間后SaRac1的響應(yīng)情況進(jìn)行了分析。與空白對(duì)照和DBQ陰性對(duì)照相比，SaRac1基因受到吸器誘導(dǎo)因子DMBQ強(qiáng)烈誘導(dǎo)，且在4 h時(shí)表達(dá)量最高；同時(shí)，DMBQ處理顯著促進(jìn)了檀香吸器發(fā)育，其吸器數(shù)量分別比空白對(duì)照和陰性對(duì)照提高55.51%和80.96%(圖5)。

3 討 論

植物Rac蛋白通過(guò)與下游不同的蛋白耦合，廣泛參與根毛發(fā)育、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗逆等生理過(guò)程[23]。植物Rac蛋白通常都有GTP酶活性結(jié)構(gòu)域、Mg2+離子結(jié)合效應(yīng)區(qū)、GTP結(jié)合位點(diǎn)等保守結(jié)構(gòu)域。但這些蛋白的C末端結(jié)構(gòu)差異較大，此結(jié)構(gòu)決定著Rac蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位[19]。一般認(rèn)為，Rac蛋白一般與質(zhì)膜耦聯(lián)或者游離于細(xì)胞質(zhì)中[23]。檀香Rac1蛋白和其他植物Rac蛋白類(lèi)似，包含所有的保守結(jié)構(gòu)域，其C末端結(jié)構(gòu)為CSIL[19,23]。本研究采用原生質(zhì)體進(jìn)行亞細(xì)胞定位試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)部分SaRac1蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)中，這與之前報(bào)道的很多植物Rac蛋白類(lèi)似[19]。但是意外的是，與之前報(bào)道的植物Rac蛋白不同，我們?cè)诩?xì)胞核中也檢測(cè)到了大量的SaRac1蛋白，表明SaRac1蛋白在細(xì)胞核內(nèi)可能也行使著獨(dú)特的生物學(xué)功能。

為了解SaRac1基因的組織表達(dá)模式，本研究通過(guò)定量PCR方法檢測(cè)檀香6個(gè)組織中SaRac1的表達(dá)情況。結(jié)果表明，SaRac1基因在根和吸器中表達(dá)水平較高。一般而言，蛋白在特定組織的表達(dá)情況往往與其功能密切相關(guān)[24]。SaRac1基因在根和吸器中表達(dá)水平較高暗示著該基因可能參與了吸器發(fā)育過(guò)程。

在水稻中過(guò)表達(dá)OsRac1基因可產(chǎn)生大量的ROS，且伴隨著大量的抗病基因表達(dá)和植保素合成，進(jìn)而表現(xiàn)出很強(qiáng)的稻瘟病抗性[25]。在擬南芥中，過(guò)表達(dá)AtRac1基因也可以誘導(dǎo)產(chǎn)生大量ROS，但這種誘導(dǎo)作用可以被NADPH氧化酶抑制劑DPI所抑制，說(shuō)明DPI可以抑制Rac1依賴(lài)的活性氧產(chǎn)生[25-26]。植物Rac蛋白的一個(gè)重要功能就是通過(guò)調(diào)節(jié)植物NADPH氧化酶活性進(jìn)而參與ROS產(chǎn)生[27]。我們的前期研究表明，ROS信號(hào)是檀香吸器發(fā)育所必需[3]。在本研究中，吸器誘導(dǎo)因子DMBQ顯著促進(jìn)了檀香吸器發(fā)育，同時(shí)SaRac1受到吸器誘導(dǎo)因子DMBQ的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，這些結(jié)果暗示著SaRac1可能通過(guò)ROS生成參與了檀香吸器發(fā)育過(guò)程。在后續(xù)研究中，我們將通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化和生化試驗(yàn)進(jìn)一步探究SaRac1調(diào)控ROS信號(hào)生成的機(jī)理，并進(jìn)一步驗(yàn)證檀香吸器發(fā)育是否受該過(guò)程的影響。

目前，對(duì)寄生植物特有的吸器發(fā)育過(guò)程而言，分子機(jī)理水平研究十分欠缺。SaRac1蛋白受到吸器誘導(dǎo)因子DMBQ的顯著誘導(dǎo)，且與ROS信號(hào)密切相關(guān)。本研究對(duì)該基因進(jìn)行了克隆、亞細(xì)胞定位和表達(dá)模式分析，并初步驗(yàn)證了該基因參與了吸器發(fā)育過(guò)程，為深入研究SaRac1參與調(diào)節(jié)ROS信號(hào)和吸器發(fā)育過(guò)程奠定基礎(chǔ)。