響應(yīng)面法優(yōu)化節(jié)瓜中丙醇二酸提取條件的研究

劉 娜,杜 旋,魯 博,田守波,李 丹

(1 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院設(shè)施園藝研究所,上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點實驗室,上海201403;2 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技信息研究所,上海201403;3 上海市奉賢區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,上海201611)

節(jié)瓜(Benincasa hispidaCogn.var.Chieh-qua How.)是葫蘆科冬瓜屬的一個變種,別名毛節(jié)瓜、北瓜、毛瓜,原產(chǎn)于我國華南地區(qū),具有悠久的栽培歷史,是我國傳統(tǒng)的藥食兼用型特色蔬菜品種[1-2]。節(jié)瓜具有清熱解毒、利尿消腫、美容養(yǎng)顏的作用,對治療腎病、糖尿病等也有一定的輔助效果[3-4]。節(jié)瓜果實中富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、粗纖維、鈣、磷、鐵、維生素A、維生素C、維生素B1、維生素B2、有機(jī)酸等營養(yǎng)成分,其中丙醇二酸是一種重要的活性成分[5-6]。丙醇二酸是一種小分子有機(jī)酸,又名羥丙二酸,可抑制人體內(nèi)糖類轉(zhuǎn)化為脂肪,阻止體內(nèi)脂肪堆積,但不妨礙糖類物質(zhì)向人體提供熱量和能量[7-9]。人體自身不能合成丙醇二酸,一般通過飲食獲得。研究發(fā)現(xiàn),只有黃瓜、冬瓜、節(jié)瓜等極少數(shù)果蔬中含有該物質(zhì),其是植物有機(jī)型丙醇二酸的重要來源[10-12]。近年來,隨著生活水平的不斷提高,人們的健康意識逐漸增強(qiáng),越來越注重節(jié)瓜在美容、減肥方面的作用,節(jié)瓜的需求量逐年增加[13-15]。丙醇二酸含量是衡量節(jié)瓜營養(yǎng)品質(zhì)的一個重要指標(biāo)[8]。如何從節(jié)瓜果實中快速、高效地提取丙醇二酸是定量分析其含量的關(guān)鍵環(huán)節(jié),也是進(jìn)一步開發(fā)利用節(jié)瓜的前提。

迄今,國內(nèi)外針對節(jié)瓜的研究報道大多在引種栽培、營養(yǎng)價值、抗病性以及遺傳分析等方面,關(guān)于丙醇二酸的研究主要集中在高含量種質(zhì)資源篩選、配合力分析等方面,而關(guān)于丙醇二酸提取條件方面的報道比較少見[16-19]。前人采用單因素和正交試驗法對丙醇二酸的提取工藝進(jìn)行過一些研究[20-21]。徐立俐等[21]發(fā)現(xiàn),乙醇濃度、料液比、萃取時間、萃取溫度等參數(shù)可以影響丙醇二酸的提取效果,影響大小順序為提取時間、料液比、萃取溫度、乙醇濃度;并通過單因素和正交試驗法優(yōu)化得到了黃瓜中丙醇二酸的最佳提取條件。目前,關(guān)于節(jié)瓜中丙醇二酸的提取條件還未見報道。

響應(yīng)面分析法(Response surface methodology,RSM)是利用合理的試驗設(shè)計并通過試驗得到一定數(shù)據(jù),采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系,通過對回歸方程的分析尋求最優(yōu)工藝參數(shù),解決多變量問題的一種統(tǒng)計方法,已在植物黃酮類、糖類、酚類等物質(zhì)提取上廣泛應(yīng)用[22-25]。本試驗利用單因素試驗及響應(yīng)面法對節(jié)瓜果實中丙醇二酸的提取方法進(jìn)行優(yōu)化,確定最佳提取條件,以期為得到更簡便、精確的提取方式奠定基礎(chǔ),并為進(jìn)一步開發(fā)利用節(jié)瓜中丙醇二酸提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選擇廣東地方節(jié)瓜品種‘J-31’為試驗材料,該品種為短圓柱形瓜,瓜皮綠色,瓜肉淺綠。試材種植于上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院莊行綜合試驗站大棚內(nèi),株距35 cm,行距60 cm,隨機(jī)排列,3 次重復(fù),每重復(fù)種植10 株,統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)田間管理。

1.2 丙醇二酸的提取與測定

節(jié)瓜果實中丙醇二酸含量的測定采用高效液相色譜法(HPLC)。丙醇二酸標(biāo)準(zhǔn)品購自美國Alfa Aesar 公司,純度98%。在授粉后20 d,每重復(fù)分別摘取嫩瓜1個,1 h 內(nèi)轉(zhuǎn)移至實驗室,用榨汁機(jī)榨成糊狀,裝入袋中,分別標(biāo)記后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩z測時,取少量糊狀物于研缽中研磨,然后裝入1.5 mL 離心管中,稱質(zhì)量,12000 r∕min 離心3 min,取上清液過濾(濾膜0.45 μm),取濾液進(jìn)行檢測。每個處理重復(fù)3 次。高效液相色譜儀為DGU-20A3(日本島津化學(xué)實驗儀器廠);色譜檢測儀器為紫外檢測器;流動相為硫酸鈉溶液;流速1.0 mL∕min;進(jìn)樣量10 μL。

1.3 單因素試驗

1.3.1 乙醇濃度的篩選

樣品分別用體積分?jǐn)?shù)(下稱乙醇濃度)為0、15%、30%、45%、60%的乙醇于料液比(樣品∶乙醇)1∶60(g∕mL)、25 ℃條件下提取60 min 后,測定丙醇二酸含量,篩選最佳乙醇濃度。

1.3.2 料液比的篩選

樣品分別以1∶30、1∶45、1∶60、1∶75、1∶90 的料液比(g∕mL)在乙醇濃度15%、25 ℃條件下提取60 min后,測定丙醇二酸含量,篩選最佳料液比。

1.3.3 萃取時間的篩選

樣品分別浸提30 min、45 min、60 min、75 min、90 min 后于料液比1∶60(g∕mL)、乙醇濃度15%、25 ℃條件下提取,測定丙醇二酸含量,篩選最佳萃取時間。

1.3.4 萃取溫度的篩選

樣品分別在5 ℃、15 ℃、25 ℃、35 ℃、45 ℃溫度條件下于料液比1∶60(g∕mL)、乙醇濃度15%中萃取60 min 后,測定丙醇二酸含量,篩選最佳萃取溫度。

1.4 響應(yīng)面法試驗因素設(shè)計

以單因素試驗結(jié)果為基礎(chǔ),運用Box-Benhnken 試驗設(shè)計原理,采用乙醇濃度、料液比、萃取時間和萃取溫度4個因子3個水平試驗設(shè)計(表1)對節(jié)瓜丙醇二酸提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

表1 Box-Benhnken 響應(yīng)面法試驗因素與水平Table 1 Test factors and levels of Box-Behnken response surface method

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Design-Expert 8.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,采用Origin 8.5 軟件進(jìn)行繪圖。當(dāng)P＜0.05 時,差異達(dá)到顯著水平;當(dāng)P＜0.01 時,差異達(dá)到極顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗分析

2.1.1 乙醇濃度對丙醇二酸提取的影響

由圖1 可見,當(dāng)乙醇濃度為15%時,丙醇二酸的提取值最高;當(dāng)乙醇濃度為60%時,丙醇二酸提取值最低。其原因可能是隨著乙醇濃度繼續(xù)增加,樣品中脂溶性成分和一些小分子物質(zhì)溶出,影響了丙醇二酸的提取,導(dǎo)致丙醇二酸提取值降低。

2.1.2 料液比對丙醇二酸提取的影響

由圖2 可見,當(dāng)料液比為1∶45(g∕mL)時,丙醇二酸提取值最高;隨著料液比繼續(xù)增大,丙醇二酸提取值下降,當(dāng)料液比為1∶90(g∕mL)時,丙醇二酸提取值降到最低。因此,料液比以1∶45(g∕mL)左右為宜。

圖1 乙醇濃度對丙醇二酸提取值的影響Fig.1 Effects of ethanol concentration on the extraction value of tartronic acid

圖2 料液比對丙醇二酸提取值的影響Fig.2 Effects of material-liquid ratio on the extraction value of tartronic acid

2.1.3 萃取時間對丙醇二酸提取的影響

由圖3 可見,隨著萃取時間增加,丙醇二酸的提取值呈先升高后降低的變化趨勢。當(dāng)萃取時間為60 min時,丙醇二酸提取值最高。因此,萃取時間以60 min 為宜。

2.1.4 萃取溫度對丙醇二酸提取的影響

由圖4 可見,當(dāng)萃取溫度在5—25 ℃時,隨著溫度升高,溶劑與樣品之間的平均動能增加,促進(jìn)了溶劑與丙醇二酸的接觸,丙醇二酸提取值逐漸升高;當(dāng)溫度超過25 ℃時,提取值逐漸下降,這可能是由于溫度升高,丙醇二酸分解加快或者與其他物質(zhì)反應(yīng),影響了提取效果。因此,萃取溫度以25 ℃左右為宜。

2.2 響應(yīng)面法試驗分析

2.2.1 因子與水平的選取及分析

以單因素試驗結(jié)果為基礎(chǔ),運用Box-Benhnken 試驗設(shè)計原理對節(jié)瓜中丙醇二酸的提取條件進(jìn)行優(yōu)化,通過響應(yīng)面設(shè)計,得到丙醇二酸提取值(表2)。

圖3 萃取時間對丙醇二酸提取值的影響Fig.3 Effects of extraction time on the extraction value of tartronic acid

圖4 萃取溫度對丙醇二酸提取值的影響Fig.4 Effects of extraction temperature on the extraction value of tartronic acid

表2 響應(yīng)面分析方案及試驗結(jié)果Table 2 Response surface analysis scheme and test results

2.2.2 回歸模型的建立及分析

根據(jù)試驗結(jié)果,以丙醇二酸提取值(I)為響應(yīng)值,乙醇濃度(A)、料液比(B)、萃取時間(C)和萃取溫度(D)為自變量擬合得到四元二次回歸模型:I=29.04 -5.61A -1.58B -0.91C -0.22D +2.68AB +2.84AC-1.45AD-0.18BC-0.19BD+0.22CD+1.18A2-7.77B2-9.45C2-6.09D2。

由表3 可知,該回歸模型極顯著(F=11.14,P＜0.0001),表明建立的模型具有意義;失擬項不顯著(F=1.05,P=0.1557),表明該模型受其他因素影響較小,擬合度較好;相關(guān)系數(shù)R2=0.9891,說明真實值與該模型的預(yù)測值具有較高的相關(guān)性。各因素對提取效果影響程度依次為:乙醇濃度(A) ＞料液比(B) ＞萃取時間(C) ＞萃取溫度(D)。料液比(B)影響顯著(P=0.00265),乙醇濃度(A)(P＜0.0001)、料液比的二次項(B2)(P=0.0002)、萃取時間的二次項(C2)(P＜0.0001)、萃取溫度的二次項(D2)(P=0.0003)影響極顯著。

乙醇濃度(A)、料液比(B)、萃取時間(C)和萃取溫度(D)4個因素中任意2個因素取零水平時,其余2個因素相互作用對丙醇二酸提取效果的影響見圖5—10。各因素間的交互作用對丙醇二酸提取效果影響的顯著性可以從響應(yīng)面曲線的坡度和等高線的形狀得到。乙醇濃度和萃取時間相互作用的響應(yīng)面曲線最陡,等高線最扁(圖6),說明乙醇濃度和萃取時間對丙醇二酸提取效果的交互作用最為顯著;同理可得,各因素之間的交互作用對節(jié)瓜中丙醇二酸提取效果的影響順序為AC ＞AB ＞BC ＞AC ＞BD ＞AB。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

圖5 乙醇濃度和料液比對丙醇二酸提取值影響的等高線圖和曲面圖Fig.5 Contour map and curved surface map of the effects of ethanol concentration and material-liquid ratio on the extraction value of tartronic acid

圖6 萃取時間和乙醇濃度對丙醇二酸提取值影響的等高線圖和曲面圖Fig.6 Contour map and curved surface map of the effects of extraction time and ethanol concentration on the extraction value of tartronic acid

圖7 萃取溫度和乙醇濃度對丙醇二酸提取值影響的等高線圖和曲面圖Fig.7 Contour map and curved surface map of the effects of extraction temperature and ethanol concentration on the extraction value of tartronic acid

圖8 萃取時間和料液比對丙醇二酸提取值影響的等高線圖和曲面圖Fig.8 Contour map and curved surface map of the effects of extraction time and material-liquid ratio on the extraction value of tartronic acid

圖10 萃取溫度和萃取時間對丙醇二酸提取值影響的等高線圖和曲面圖Fig.10 Contour map and curved surface map of the effects of extraction temperature and extraction time on the extraction value of tartronic acid

2.2.3 最佳提取條件的確定和驗證

由Design-Expert 8.0.6 軟件分析得到的最大響應(yīng)面值對應(yīng)的最佳條件為:乙醇濃度2.69%、料液比1∶58.08(g∕mL)、萃取時間54.78 min、萃取溫度24.03 ℃,在此條件下,丙醇二酸提取值最高,為34.87 mg∕kg。為檢驗該方法的可靠性,結(jié)合操作的便利性,將各提取條件修正為:乙醇濃度5%、料液比1∶60(g∕mL)、萃取時間55 min、萃取溫度25 ℃。對修正后的提取條件進(jìn)行3 次平行驗證性試驗,得到節(jié)瓜丙醇二酸提取值平均為34.26 mg∕kg,與模型預(yù)測值相比,相對誤差為1.75%,說明該模型有效、可靠,與實際情況擬合良好,在實際操作中具有一定的參考價值。

3 結(jié)論與討論

本試驗以節(jié)瓜為材料,在單因素試驗基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面法對節(jié)瓜中丙醇二酸提取工藝進(jìn)行考察和優(yōu)化,建立了四元二次回歸模型,并分析了各因子對響應(yīng)值的影響,結(jié)果表明:模型擬合可信度高,能較好地分析與預(yù)測節(jié)瓜中丙醇二酸的提取效果。因此,采用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化以得到最大提取率。

正交試驗法和響應(yīng)面法是目前常用的提取工藝優(yōu)化方法。研究表明,與正交試驗相比,響應(yīng)面法可較好地解析各因素與響應(yīng)值的關(guān)系,特別是各因素的互作效應(yīng),在一個連續(xù)區(qū)域內(nèi)篩選最優(yōu)方案,最終更好地優(yōu)化提取工藝,這也是響應(yīng)面法比正交法更能精確地優(yōu)化提取條件的原因[26]。因此,對于影響因素較多、各因素間關(guān)系較復(fù)雜的工藝大都采用較精確的響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化[27]。本研究篩選出節(jié)瓜中丙醇二酸最佳提取工藝為:乙醇濃度5%、料液比1∶60(g∕mL)、萃取時間55 min、萃取溫度25 ℃,實際提取值(34.26 mg∕kg)與模型預(yù)測值(34.87 mg∕kg)相比,相對誤差為1.75%,說明該模型有效、可靠。同時,也說明前期單因素試驗設(shè)計中設(shè)置的乙醇濃度與響應(yīng)面法預(yù)測的最佳提取條件中乙醇濃度有較大偏差?？梢?單純應(yīng)用單因素試驗法研究物質(zhì)的提取條件有較大局限性。在黃瓜果實丙醇二酸提取條件的研究中[21],采用單因素和正交試驗法得出最佳提取條件為:料液比1∶60(g∕mL)、乙醇濃度50%、萃取時間2 h、萃取溫度35 ℃,與本研究得出的條件有所差別。這可能由于黃瓜和節(jié)瓜中其他物質(zhì)種類和含量不同,導(dǎo)致在提取過程中對丙醇二酸的干擾程度不同,因此得到的提取工藝有差異?？梢?同一種物質(zhì)在不同作物間的提取條件不同,應(yīng)根據(jù)具體作物有針對性地進(jìn)行條件優(yōu)化篩選。本研究可為進(jìn)一步提高節(jié)瓜中丙醇二酸的提取和利用奠定基礎(chǔ)。