左心室心肌致密化不全患者致密層心肌Native T1 值與基質(zhì)金屬蛋白酶-9 的相關(guān)性研究

周紅梅，丁海艷，方全，方理剛，林雪

左心室心肌致密化不全（left ventricular noncompaction，LVNC）為胚胎期心外膜向心內(nèi)膜致密化過(guò)程的失敗，導(dǎo)致的心肌組織形成無(wú)功能的肌小梁和致密層心肌變薄的疾病。LVNC 的臨床表現(xiàn)從無(wú)癥狀到難治性心力衰竭、猝死和血栓事件[1-3]。我們認(rèn)為L(zhǎng)VNC 患者心肌致密化層的組織學(xué)改變，尤其是纖維化程度，在此基礎(chǔ)上導(dǎo)致或者合并心肌重構(gòu)，可能是LVNC 患者臨床表現(xiàn)不同的原因。在臨床中尋找與心肌重構(gòu)相關(guān)的方便可靠的、可反映致密層心肌組織改變的指標(biāo)，有助于在具有LVNC 表型患者中篩查出預(yù)后不良患者。

近年來(lái)研究顯示，心臟核磁共振（CMR）Native T1 mapping 可以有效早期檢測(cè)并定量心肌纖維化[4-5]。但對(duì)于LVNC 患者致密層心肌Native T1 mapping 定量檢測(cè)是否存在異常鮮有研究。我們前期研究顯示，致密層Native T1 值與QTc 間期有顯著的相關(guān)性；QTc 間期越長(zhǎng)，Native T1 值越高，且預(yù)后較差[6]。

此外，基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）是臨床研究中常用的與組織重構(gòu)相關(guān)的指標(biāo)，在心肌纖維化的進(jìn)程發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，尤其在終末期心力衰竭中MMP-9 顯著增加，與病理性心肌重構(gòu)密切相關(guān)[7-8]。在本探索性研究中，我們探討了LVNC 患者致密層心肌Native T1 mapping 定量數(shù)值與心肌重構(gòu)指標(biāo)MMP-9 之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

研究納入2008 年12 月至2014 年6 月期間在北京協(xié)和醫(yī)院就診，經(jīng)兩名資深的心內(nèi)科醫(yī)師通過(guò)超聲心動(dòng)圖學(xué)檢查確診的32 例LVNC 患者，排除禁忌證后進(jìn)行CMR 掃描。1 例患者因核磁圖像質(zhì)量不佳被剔除，最終31 例LVNC 患者納入LVNC 組，其中男性17 例，女性14 例，年齡16～65 歲，平均年齡（42.1±15.2）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)臨床確診為L(zhǎng)VNC、NYHA 心功能Ⅰ～Ⅲ級(jí)。排除標(biāo)準(zhǔn)：LVNC患者NYHA 心功能Ⅳ級(jí)、植入心臟起搏器或金屬置入體內(nèi)者、幽閉恐懼癥者及妊娠女性。另招募性別和年齡相匹配的健康志愿者（均為L(zhǎng)VNC 患者家屬）10 名為健康對(duì)照組。健康對(duì)照組入組標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)心血管疾病危險(xiǎn)因素，包括無(wú)吸煙史、高血壓、高血脂、糖尿病等疾病病史；無(wú)長(zhǎng)期服藥史，無(wú)幽閉恐懼癥，無(wú)釓對(duì)比劑過(guò)敏，無(wú)金屬置入體內(nèi)者，常規(guī)十二導(dǎo)聯(lián)心電圖、超聲心動(dòng)圖、血常規(guī)、肝功能、腎功能及血脂檢查均正常。本研究經(jīng)北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 心臟核磁共振掃描方法

采用荷蘭Achieva TX,Philips 3.0 T 超導(dǎo)型磁共振儀，梯度場(chǎng)強(qiáng)45 mT/m，切換率每秒200 T/m。采用胸前置32 通道心臟線圈（InVivo,Gainesville,Florida,美國(guó)），心電門控R 波觸發(fā)成像。所有受試者均行心臟電影成像（CINE）序列：門控導(dǎo)航的穩(wěn)態(tài)自由進(jìn)動(dòng)梯度回波電影序列（bSSFP）掃描參數(shù)：TR 270 ms、TE 1.3 ms、體系（voxel）大小1.8 mm3×1.5 mm3×8.0 mm3，反轉(zhuǎn)角35°、層厚8 mm、層間空隙2 mm。MOLLI序列：在圖像采集過(guò)程中要求患者屏氣，通過(guò)兩個(gè)反轉(zhuǎn)脈沖，在11 個(gè)心臟周期中共采集8 幅具有不同翻轉(zhuǎn)時(shí)間的T1 權(quán)重的圖像。圖像來(lái)自左心室中部的短軸位，共采集三層，層間隔為20 mm，全部圖像可以覆蓋心臟中部的50 mm 以內(nèi)范圍。詳細(xì)的成像參數(shù)為:bSSFP 單次激發(fā)數(shù)據(jù)采集方式，TR/TE=2.5/1.1 ms，F(xiàn)OV:300 mm× 150 mm，voxel 大?。?.5 mm3× 1.5 mm3× 10.0 mm3，35°翻轉(zhuǎn)角。

1.3 CINE 圖像分析

由兩名有經(jīng)驗(yàn)的心內(nèi)科及磁共振診斷醫(yī)師閱片。依據(jù)美國(guó)心臟協(xié)會(huì)（AHA）標(biāo)準(zhǔn)17 節(jié)段分段法[9]，在CINE 圖像上統(tǒng)計(jì)每例LVNC 患者非致密層心?。∟C）的部位和數(shù)量。在左心室舒張末期長(zhǎng)軸位測(cè)量致密層心?。–）厚度、NC 厚度。統(tǒng)計(jì)NC 的最大厚度及相對(duì)應(yīng)的C 值，并計(jì)算相應(yīng)的NC/C值。在CINE 圖像上定量分析左心室舒張末期容積（LVEDV）、左心室收縮末期容積（LVESV）、左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和左心室致密層心肌質(zhì)量（LVCM），測(cè)量分析LVCM 時(shí)未包括乳頭肌質(zhì)量。另外，由于NC 網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)與心腔內(nèi)血液相通，在分析時(shí)很難區(qū)分血液信號(hào)和NC 信號(hào)，故未計(jì)算NC質(zhì)量。以上分析有兩名核磁圖像分析超過(guò)2 年的研究者在MATLAB（MathWorks,Natick,Massachusetts，美國(guó)）平臺(tái)上進(jìn)行，手工測(cè)量每個(gè)心動(dòng)周期從心尖到基底部的每個(gè)相位的圖像。

1.4 外周血MMP-9 實(shí)時(shí)PCR 和蛋白表達(dá)檢測(cè)

LVNC 組患者及健康對(duì)照組受試者均在空腹時(shí)靜脈采血2 ml。血樣放入1.5 mg/ml 的乙二胺四乙酸（EDTA）試管中，離心10 min（3 000 轉(zhuǎn)/min）。提取信使RNA（mRNA）主要應(yīng)用試劑有Trizol 裂解液（Sigma 公司，美國(guó)），紫外分光光度計(jì)上測(cè)定RNA 的吸光光度值。mRNA 逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA）主要應(yīng)用試劑有Easy Script First-Strand cDNA Synthesis SuperMix（北京全式金生物技術(shù)有限公司）。實(shí)時(shí)PCR 引物MMP-9 Forward:TGTACCGCTATGGTTACACTCG，MMP-9，Reverse:GGCAGGGACAGTTGCTTCT，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GRAPH）引物Forward:5'-TCAACGGATTTGGTCGTATT-3',Reverse:5'-CTGTGGTCATGAGTCCTTCC-3'。RNeasy Mini Kit總RNA 提取試劑盒（QIAGEN 公司，德國(guó)）、cDNA Archive Kit（Applied Biosystems 公司，美國(guó)）；GRAPH 試劑盒（Thermo Scientific 公司，美國(guó)）。外周血MMP-9 含量采用ELISA 試劑盒（R&D 公司，美國(guó)）測(cè)定，具體操作步驟根據(jù)操作指南進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有連續(xù)變量值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用非參數(shù)Mann-Whitney 檢驗(yàn)。采用Spearman 非參數(shù)檢驗(yàn)分析外周血MMP-9 蛋白與Native T1 值之間的關(guān)系。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LVNC 組與健康對(duì)照組的臨床基本資料比較（表1）

LVNC 組與健康對(duì)照組的性別、年齡、體表面積的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），除高血壓外，兩組的其他心血管危險(xiǎn)因素的差異也均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。LVNC 組患者中有9 例（29.0%）有LVNC 家族史，24 例（77.4%）患者有胸痛/胸悶癥狀，10 例（32.3%）患者有心悸，2 例（6.5%）患者有系統(tǒng)性血栓，23 例（74.2%）存在心電圖異常。

表1 LVNC 組與健康對(duì)照組的臨床基本資料比較[例（%）]

2.2 LVNC 組與健康對(duì)照組的CMR 的CINE 結(jié)果比較（表2）

LVNC 患者CMR 顯示網(wǎng)狀樣的非致密化心肌顯著增多（圖1）。在校正體表面積后，兩組的左心室舒張末期容積指數(shù)（LVEDVI）、左心室收縮末期容積指數(shù)（LVESVI）及LVEF 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.001）。

2.3 LVNC 組與健康對(duì)照組的致密層心肌Native T1值比較

健康對(duì)照組1 例受試者和LVNC 組1 例患者的Native T1 maps 圖像見圖2。數(shù)據(jù)分析顯示，LVNC 組患者Native T1 值高于健康對(duì)照組[（1 159.0±47.4）ms vs.（1 096.0±41.5）ms，P＜0.001]。

2.4 外周血MMP-9 mRNA 水平及MMP-9 蛋白水平（圖3）

LVNC 組MMP-9 mRNA 水平顯著高于健康對(duì)照組（19.59±17.76 vs.1.76±0.72，P=0.003）。LVNC組MMP-9 蛋白水平顯著高于健康對(duì)照組[（92.44±62.26）ng/ml vs.（58.32± 28.19）ng/ml，P=0.025]。

2.5 外周血MMP-9 蛋白與Native T1 值的相關(guān)性分析（圖4）

Spearman 非參數(shù)檢驗(yàn)結(jié)果顯示，LVNC 患者外周血MMP-9 蛋白水平與Native T 值呈顯著正相關(guān)（r=0.40，P=0.044）。

表2 兩組心臟核磁共振成像參數(shù)比較（±s）

表2 兩組心臟核磁共振成像參數(shù)比較（±s）

注：LVNC：左心室心肌致密化不全

圖1 一例LVNC 患者的心臟核磁共振成像檢查結(jié)果

圖2 健康對(duì)照組和LVNC 組患者的Native T1 maps 圖像

圖3 兩組外周血MMP-9 mRNA 水平及MMP-9 蛋白水平比較

圖4 Spearman 非參數(shù)檢驗(yàn)結(jié)果

3 討論

本組研究中發(fā)現(xiàn)，LVNC 患者致密層心肌的Native T1 值、MMP-9 mRNA 水平及蛋白水平的表達(dá)均顯著高于健康對(duì)照組，且外周血MMP-9 的濃度與Native T1 值呈正相關(guān)。

根據(jù)既往的臨床工作積累推測(cè)，LVNC 患者已經(jīng)存在的致密層心肌纖維化，并在此基礎(chǔ)上出現(xiàn)心臟重構(gòu)，可能是導(dǎo)致疾病進(jìn)展的使動(dòng)因素。LVNC的臨床表現(xiàn)多樣，預(yù)后不同，可能因?yàn)槟壳岸喾N診斷標(biāo)準(zhǔn)主要基于不同心臟平面非致密化心肌與致密化心肌的厚度之比來(lái)進(jìn)行形態(tài)學(xué)診斷，但這些診斷標(biāo)準(zhǔn)無(wú)心肌組織特征，無(wú)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)，無(wú)生物學(xué)診斷內(nèi)容[10]，Kohli 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在無(wú)心臟疾病的受試者中有8%的人群滿足目前LVNC 的超聲心動(dòng)圖診斷標(biāo)準(zhǔn)。在影像學(xué)表現(xiàn)類似的患者中，致密層的組織學(xué)改變尤其應(yīng)該受到重視。LVNC 患者多數(shù)存在致密層厚度減少，但是鮮有研究探索致密層的組織學(xué)改變。本研究結(jié)果中LVNC 患者致密層心肌的Native T1 值顯著高于健康對(duì)照組，提示致密層心肌存在纖維化，這與既往研究一致[12]。

心肌Native T1 值可以直觀反映心肌組織病變異常程度，Native T1 mapping 是近些年新發(fā)展起來(lái)的用于評(píng)估心肌組織特征的一項(xiàng)新技術(shù)，可以提高疾病的診斷水平、判斷疾病的受累程度及潛在的預(yù)后。Native T1 參數(shù)是指組織的T1 常數(shù)經(jīng)過(guò)展縮編碼到對(duì)應(yīng)的圖像區(qū)域的灰度值中，用來(lái)衡量組織成分的變化[4-5]。它不需要釓對(duì)比劑，適用于腎功能異常及對(duì)比劑過(guò)敏的患者[13]。目前Native T1 mapping 已被應(yīng)用于擴(kuò)張型心肌病[14]、肥厚型心肌病[15]和急性心肌梗死[16-17]等疾病中，用于評(píng)價(jià)心肌纖維化病變程度，并且有研究發(fā)現(xiàn)在評(píng)價(jià)心肌纖維化方面優(yōu)于釓對(duì)比劑延遲強(qiáng)化（LGE）技術(shù)，Native T1 mapping 在檢測(cè)心肌纖維化方面與心肌活檢有較高的一致性。同時(shí)有研究顯示Native T1 mapping 作為一種可量化的技術(shù)，可以用于疾病活動(dòng)的分級(jí)、監(jiān)測(cè)進(jìn)展和指導(dǎo)治療。Native T1 mapping 彌補(bǔ)了LGE 對(duì)彌漫性心肌纖維化識(shí)別不足的缺點(diǎn)，比LGE 更加敏感，能早期發(fā)現(xiàn)心肌病變。盡管心肌活檢是目前檢測(cè)心肌纖維化的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但為有創(chuàng)檢查，并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)較大，且受標(biāo)本取材的局域性影響，患者難以接受等，不能作為臨床工作中的常規(guī)檢查，因此目前Native T1 mapping 被認(rèn)為是比心肌活檢更為優(yōu)越的無(wú)創(chuàng)檢測(cè)心肌纖維化的方法。

為探索致密層心肌的組織學(xué)改變是否會(huì)伴隨一定程度的心肌重構(gòu)，本研究對(duì)LVNC 患者外周血MMP-9 的水平進(jìn)行了定量分析，發(fā)現(xiàn)LVNC 患者的MMP-9 mRNA 水平及蛋白水平均顯著高于健康對(duì)照組，與既往很多研究結(jié)果一致[18-19]。MMP-9 在許多心血管疾病中參與了心肌重構(gòu)的過(guò)程，MMP-9 上調(diào)導(dǎo)致了與內(nèi)源性MMP 抑制物失衡，造成了細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解的動(dòng)態(tài)平衡被打破，細(xì)胞外基質(zhì)沉積，進(jìn)一步導(dǎo)致炎癥細(xì)胞的聚集，炎癥細(xì)胞分泌一些細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子，從而又加劇了心肌重構(gòu)的進(jìn)程[20]。

同時(shí)本組研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MMP-9 蛋白水平與致密層心肌Native T1 值正相關(guān)，意味著在致密心肌出現(xiàn)纖維化的同時(shí)，已經(jīng)伴隨出現(xiàn)了心肌重構(gòu)。心肌重構(gòu)的原因一方面可能來(lái)自于先天的心肌發(fā)育障礙，但同時(shí)也有可能是因?yàn)楹喜⒘藢?dǎo)致或者加重心肌重構(gòu)的伴隨因素。在臨床中我們也觀察到不少具有LVNC 表型的患者，在一定的誘因情況下出現(xiàn)嚴(yán)重的心力衰竭甚至心室內(nèi)血栓形成，尤其在具有家族史的患者中更為明顯，經(jīng)過(guò)積極治療后這些患者的心功能可以全部或者部分恢復(fù)，這意味著LVNC 患者更容易受到誘因影響，導(dǎo)致心力衰竭，因此對(duì)于具有LVNC 表型的患者控制心血管危險(xiǎn)因素如高血壓、糖尿病、容量負(fù)荷過(guò)重和病毒感染等非常重要，而這些危險(xiǎn)因素往往也是導(dǎo)致心室重構(gòu)的重原因。

本研究是一個(gè)小樣本的探索性研究，樣本量雖小，初步證實(shí)了LVNC 患者致密層心肌改變可能與心肌重構(gòu)指標(biāo)相關(guān)，需在更大規(guī)模和長(zhǎng)期隨訪中進(jìn)一步明確致密層T1 mapping 數(shù)值評(píng)估預(yù)后的閾值。Native T1 mapping 也有一定局限性，例如易受一些參數(shù)的影響，如機(jī)器方面，不同廠家、不同型號(hào)的機(jī)器標(biāo)準(zhǔn)值均不一樣，同時(shí)標(biāo)準(zhǔn)值受磁場(chǎng)影響也較大；另外，Native T1 值也受患者的自身生理參數(shù)如心率、紅細(xì)胞壓積等因素影響[5]。未來(lái)將進(jìn)一步研究，采用細(xì)胞外容積比（ECV）方法減輕其局限性。

總之，LVNC 患者致密層心肌Native T1 值顯著增高，且與血清中MMP-9 的表達(dá)有較高的一致性，提示LVNC 患者致密層心肌的組織學(xué)改變與心肌重構(gòu)可能有關(guān)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突