p38絲裂原活化蛋白激酶、上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化在胃食管反流病及食管腺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

鐘江利 王紅 趙凌葦

胃食管反流?。╣astroesophageal reflux disease，GERD）是一個(gè)多因素造成的以食管下括約肌為主的胃腸動(dòng)力障礙性疾病，影響了北美國(guó)家超過1/5的人口[1]，我國(guó)發(fā)病率也超過5%[2]，其高發(fā)病率及并發(fā)癥嚴(yán)重影響了人們的生活質(zhì)量，長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作的胃食管反流病癌變的風(fēng)險(xiǎn)較高，且Barrett食管是食管腺癌的癌前病變，確診后的食管腺癌預(yù)后極差。p38絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路是MAPK家族中重要的炎癥信號(hào)通路。p38 MAPK受外界刺激活化后可使腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleuin-6，IL-6）、IL-8等上調(diào)從而誘發(fā)炎癥反應(yīng)[3]。在胃食管反流病中，p38 MAPK能夠被胃酸、胰蛋白酶等激活，通過炎癥因子介導(dǎo)食道黏膜組織的病變過程[4-5]。同時(shí)越來越多的證據(jù)表明在反流性食管炎-Barrett食管-食管腺癌的演變過程中，食管黏膜細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）扮演極其重要的作用。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在膽管癌細(xì)胞系ICBD上細(xì)菌脂多糖（Lipopolysac-charide，LPS）能夠激活Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR4）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，活化下游的p38 MAPK信號(hào)通路表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致上皮細(xì)胞標(biāo)志物（Epithelial-cadherin，E-cadherin）的表達(dá)顯著降低，而間皮細(xì)胞的標(biāo)志物Vimentin蛋白的表達(dá)顯著升高，誘導(dǎo)EMT的發(fā)生[6]。本研究旨在探討p38 MAPK、Vimentin、E-cadherin在胃食管反流病及食管腺癌發(fā)病過程中的作用。

資料與方法

一、對(duì)象

收集2017年1月至2019年4月遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科42例胃食管反流病患者蠟塊標(biāo)本（來源于消化內(nèi)科內(nèi)鏡活檢患者）為胃食管反流病組、2013年1月至2019年4月9例食管腺癌患者標(biāo)本（來源于胸外科行食管腺癌切除術(shù)患者）為食管腺癌組、9例食管腺癌癌旁組織標(biāo)本（來源于食管腺癌患者癌旁黏膜組織）為癌旁組，所有標(biāo)本均具有完整的信息及病史資料，病理類型由我院病理科醫(yī)師診斷，標(biāo)本的使用經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)的同意和許可。42例胃食管反流病標(biāo)本中，其中男性27例、女性15例；年齡：≥60歲14例、＜60歲28例；幽門螺旋桿菌（helicobacter pylori，Hp）感染：有Hp感染16例、無Hp感染26例；GERD類型：反流性食管炎21例、Barrett食管21例。

二、方法

1.主要試劑：兔抗p38 MAPK單克隆抗體、兔抗E-cadherin單克隆抗體、兔抗Vimentin單克隆抗體由CST公司提供，多聚-L-賴氨酸、檸檬酸鹽緩沖液、PBS緩沖液、DAB顯色液由上?；蚩萍加邢薰咎峁ㄓ眯蜕窖蜓逵杀本┲猩冀饦蚬咎峁?。

2.免疫組化法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)：所有組織標(biāo)本經(jīng)石蠟切片后、依次進(jìn)行脫蠟、去除內(nèi)源性過氧化物酶、抗原修復(fù)、一抗孵育、滴加二抗、DAB顯色等步驟，所用抗體濃度分別為p38 MAPK （1∶400），E-cadherin （1∶400），Vimentin（1∶200）。p38 MAPK特異性染色主要表達(dá)于胞漿和胞核，呈黃色、棕黃色或棕褐色顆粒，E-cadherin特異性染色主要表達(dá)于細(xì)胞膜，呈黃色、棕黃色或棕褐色顆粒，Vimentin特異性染色主要表達(dá)于胞質(zhì)和間質(zhì)，呈棕黃色、棕褐色顆粒。判讀結(jié)果以每張切片上染色強(qiáng)度和染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別計(jì)分，在顯微鏡下排除非特異性染色區(qū)域后，找到5個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞著色最強(qiáng)的視野，分別計(jì)數(shù)細(xì)胞的染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分率，按兩數(shù)據(jù)之積計(jì)分[7]（兩者相乘0分為陰性，1～4分為弱陽(yáng)性，5～8分為陽(yáng)性，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性）。染色強(qiáng)度：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽(yáng)性細(xì)胞百分率：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～30%為2分，51%～75%為3分，≥75%為4分。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例數(shù)（百分率）表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、p38 MAPK、E-cadherin、V-imentin的表達(dá)

p38 MAPK主要表達(dá)在胞漿和胞核，呈黃色、棕黃色、棕褐色顆粒，在食管腺癌癌旁組織、胃食管反流病組織及食管腺癌組織中陽(yáng)性率分別為11.1%（1/9）、59.5%（25/42）、88.9%（8/9），（見圖1、表1）。

圖1 -p38 MAPK在3組中的表達(dá)（×400）

表1 p38 MAPK、E-cadherin、Vimentin在食管腺癌癌旁組織、胃食管反流病組織、食管腺癌組織中的陽(yáng)性率（%）

E-cadherin特異性染色主要表達(dá)于細(xì)胞膜，呈黃色、棕黃色或棕褐色顆粒，在食管腺癌癌旁組織、胃食管反流病組織及食管腺癌組織中陽(yáng)性率分別為88.9%（8/9）、76.2%（32/42）、22.2%（2/9），（見圖2、表1）。

圖2 -E-cadherin在3組中的表達(dá)（×400）

Vimentin特異性染色主要表達(dá)于胞質(zhì)和間質(zhì)，呈棕黃色、棕褐色顆粒，V-imentin在食管腺癌癌旁組織、胃食管反流病組織及食管腺癌組織中陽(yáng)性率分別為11.1%（1/9）、69.0%（29/42）、88.9%（8/9），（見圖3、表1）。

圖3 -E-Vimentin在3組中的表達(dá)（×400）

二、p38 MAPK、E-cadherin、Vimentin在胃食管反流病的表達(dá)與臨床特征之間的關(guān)系

p38 MAPK、Vimentin在胃食管反流病中的表達(dá)情況與性別、年齡及Hp感染均無關(guān)（P＞0.05），與GERD類型有關(guān)（P＜0.05）。E-cadherin在胃食管反流病中的表達(dá)情況與性別、年齡、Hp感染及GERD類型均無關(guān)（P＞0.05），（見表2）。

討 論

p38 MAPK通路已被認(rèn)定為炎癥反應(yīng)中細(xì)胞因子協(xié)同釋放的重要調(diào)節(jié)因子[8]，激活之后活化下游MAPK激活蛋白激酶2（MK2），MK2通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子TNF-α、IL-6、IL-8和IL-1來產(chǎn)生炎癥分子，抑制p38激酶可以導(dǎo)致這些促炎介質(zhì)的顯著減少和炎癥過程的產(chǎn)生[9]。GERD是一種多因素疾病，酸暴露環(huán)境通過調(diào)節(jié)p38 MAPK的活化影響其發(fā)生、發(fā)展。胃酸和胰蛋白酶等反流物的刺激引起食道黏膜組織中炎癥細(xì)胞聚集，繼而引起IL-8、TNF-α等炎癥因子的釋放，這些炎癥因子通過下調(diào)緊密連接蛋白的表達(dá)來誘導(dǎo)上皮屏障功能的損傷，這會(huì)導(dǎo)致黏膜上皮的炎癥反應(yīng)加重，形成惡性循環(huán)[10]。柳剛[11]通過原代培養(yǎng)人食管上皮，給予酸、胰蛋白酶刺激及胃底結(jié)扎加幽口限制法誘導(dǎo)形成反流性食管炎模型并運(yùn)用免疫組化、PCR、Western blotting分析等方法驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)，在胃食管反流病中p38 MAPK通路在胰蛋白酶和酸的刺激下激活誘發(fā)炎癥，從而造成食管黏膜上皮的炎性損傷。另有研究報(bào)道，抑制p38 MAPK激活，通過調(diào)節(jié)食管屏障功能和調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞的聚集，以及NO和活性氧的形成可以減輕酸性反流性食管炎（reflux esophagitis，RE）大鼠食管黏膜損傷[12]。與沒有Barrett食管（Barrett esophagus，BE）的人相比，BE的存在增加了食管腺癌30至120倍的風(fēng)險(xiǎn)，但最近的幾項(xiàng)研究表明，即使在沒有BE的存在下，長(zhǎng)期存在GERD本身就是一種腺癌的風(fēng)險(xiǎn)因子，這種風(fēng)險(xiǎn)與GERD頻率、嚴(yán)重程度以及反流癥狀的持續(xù)時(shí)間相關(guān)[13]。BE是一種癌前病變，長(zhǎng)期存在GERD癥狀，主要由酸和膽鹽的反流所致，膽汁酸和鹽酸可誘導(dǎo)活性氧和一氧化氮的產(chǎn)生，與DNA損傷和基因突變有關(guān)[14-15]。這些機(jī)制涉及MAPK途徑從細(xì)胞表面到細(xì)胞核的信號(hào)[16]。在有和沒有Barrett食管的GERD患者的活檢中，發(fā)現(xiàn)了酸暴露激活的MAPK通路的差異，這些差異可能是Barrett食管化生發(fā)展的基礎(chǔ)[17]。本試驗(yàn)中，p38 MAPK蛋白在食管腺癌癌旁組織、胃食管反流病、食管腺癌中陽(yáng)性表達(dá)率逐漸升高，且與GERD患者性別、年齡、是否存在Hp感染均無關(guān)，而是隨著胃食管反流病的發(fā)病過程呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，在RE、BE中差異明顯，說明p38 MAPK通路在胃食管反流病的不同類型中表達(dá)不同，并可能參與了胃食管反流病及食管腺癌的發(fā)病，但由于標(biāo)本量較少，胃食管反流病組與腺癌組差異不太明顯。

目前有關(guān)EMT的研究認(rèn)為上皮細(xì)胞的不同程度轉(zhuǎn)化受細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的精確調(diào)控。細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通過與細(xì)胞表面特異性受體相結(jié)合將信號(hào)轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，再通過胞內(nèi)的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、Wnt、Notch、Hedgehog、磷脂酰肌醇3激酶、NF-κB、MAPK等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，活化核內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因表達(dá)，在發(fā)育、傷口愈合、纖維化和癌癥進(jìn)展中都有著十分重要的作用。有研究表明，EMT在食管炎到食管癌的的纖維化過程中有著十分重要的作用。ROS可以活化NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而促進(jìn)蛋白磷酸化及TGF-β表達(dá)增加，從而導(dǎo)致食管的纖維化過程[18]。炎癥在GERD損傷中的作用已得到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛認(rèn)可，從GERD患者的食管可活檢出IL-6、IL-8和IL-1β等炎性介質(zhì)[19]。酸和TLR4配體LPS刺激食管上皮下肌成纖維細(xì)胞，可激活NF-κB和辣椒素受體1，并促進(jìn)IL-6、IL-8等炎癥因子分泌，造成食管黏膜炎癥性損害以及食管高敏狀態(tài)，表明上皮-間質(zhì)的相互作用可能和胃食管反流病發(fā)生、發(fā)展存在著相關(guān)性[20]。在膽汁反流動(dòng)物模型中觀察到炎癥細(xì)胞、IL-6和腫瘤壞死因子-α的過表達(dá)，膽汁可能通過誘導(dǎo)食管炎癥反應(yīng)而促BE的發(fā)展[21]。另外，Zhang等[22]用酸性膽汁鹽處理Barrett食管細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A（vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A）分泌迅速增加，VEGF-A的增加伴隨著VEGFR2磷酸化的增加，下游信號(hào)通路的激活導(dǎo)致E盒結(jié)合鋅指蛋白的上調(diào)，E-cadherin的下調(diào)和細(xì)胞遷移的增加。抑制VEGF/VEGFR2信號(hào)（通過VEGF阻斷抗體，VEGF-A基因缺失，藥理性VEGFR2抑制或VEGFR2 shRNA）消除了這些EMT功能。這項(xiàng)研究表明，酸性膽汁鹽可以通過激活VEGF/VEGFR2信號(hào)傳導(dǎo)來誘導(dǎo)食管Barrett細(xì)胞的EMT功能，即EMT導(dǎo)致Barrett食道患者發(fā)生腸化生。腸型化生黏膜取代胃食管反流酸和膽汁損傷的食管鱗狀黏膜，是食管腺癌的主要危險(xiǎn)因素。本試驗(yàn)中，從食管腺癌癌旁組織、胃食管反流病至食管腺癌中，E-cadherin呈遞減趨勢(shì)表達(dá)，Vimentin呈遞增趨勢(shì)表達(dá)，提示E-cadherin、Vimentin可能參與了胃食管反流病及食管腺癌的發(fā)病過程。但可能由于標(biāo)本量較少，導(dǎo)致E-cadherin的表達(dá)在胃食管反流病組與癌旁組相比差異不明顯，Vimentin的表達(dá)在胃食管反流病組與腺癌組相比差異不明顯。E-cadherin的表達(dá)與性別、年齡、是否存在Hp感染及GERD臨床類型均無關(guān)。Vimentin的表達(dá)與性別、年齡、是否存在Hp感染均無關(guān)，在BE、RE中，表達(dá)有顯著差異。這也許是因?yàn)樵谘装Y向腫瘤發(fā)展的早期階段可能會(huì)發(fā)生間質(zhì)向上皮的轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致早期疾病中波形蛋白陽(yáng)性表達(dá)的趨勢(shì)較高[23]。

在胃食管反流病中，p38 MAPK能夠被胃酸、胰蛋白酶等激活誘導(dǎo)食道黏膜上皮細(xì)胞的炎癥因子分泌，p38 MAPK失活可以抑制這一反應(yīng)，并抑制食道黏膜上皮中這些緊密連接功能蛋白的表達(dá)下調(diào)，緊密連接蛋白的降低通常認(rèn)為是細(xì)胞EMT化的重要前期指針。本實(shí)驗(yàn)僅說明在胃食管反流病、食管腺癌的發(fā)病過程中，p38 MAPK、EMT都有著十分重要的作用，可能是在酸和膽鹽的刺激下p38 MAPK活化后調(diào)控下游TNF-α、IL-6等炎癥因子，通過其各自的途徑促進(jìn)了EMT[24，25]?？赡苁莗38 MAPK激活了活性氧簇，從而誘發(fā)了食管纖維化的EMT導(dǎo)致了胃食管反流病發(fā)展的過程，也可能是更多通路的共同作用，這就需要在本試驗(yàn)的基礎(chǔ)上加大樣本量研究，并結(jié)合動(dòng)物學(xué)、細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)來進(jìn)一步闡明其中的機(jī)制。