金屬硫蛋白-3與肝細胞肝癌TACE治療近、遠期療效的關系

吳 軍， 閆雪華， 陳小勇， 楊禎忠， 張繼續(xù)， 張 沅

肝細胞癌（HCC）是全球第二大腫瘤死亡原因，嚴重危害著人們的生命安全［1］。我國是HCC的高發(fā)國家，發(fā)病率占全球患者總數(shù)的55%左右［2］。HCC是一類血供的惡性腫瘤，約90%以上血供來自于肝動脈［3］。TACE已被公認為是治療不能切除HCC有效的常用方法之一［4］。目前，臨床缺乏準確率高的評價TACE治療療效的生物標志物。

金屬硫蛋白-3（metallothionein-3，MT-3）是一種分子量為6～7 kD，富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)，有維持體內(nèi)鋅離子穩(wěn)態(tài)和清除自由基的作用［5］。有文獻報道MT在HCC組織中低表達，HCC分化程度低者MT表達水平低，其與HCC發(fā)病及進展有關［6］。目前有報道證實MT-3可下調(diào)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞自噬水平［7］。癌細胞的自噬水平與化療靈敏度密切相關［8］。推測HCC病灶內(nèi)MT-3水平可反映癌細胞的自噬水平，檢測其水平可了解TACE治療療效，遂開展本研究，以期為HCC患者TACE治療療效評估提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選擇2013年3月至2015年1月在蘭州市第二人民醫(yī)院院確診的104例HCC患者作為研究對象。參照《原發(fā)性肝癌規(guī)范化診治專家共識》［9］診斷和治療HCC。納入標準：①經(jīng)穿刺病理檢查確診為HCC；②接受TACE治療；③有保存在液氮罐中完好的HCC組織；④年齡18～70歲；⑤Child-Pugh分級A級或B級。排除標準：①腫瘤分期Ⅲb期或Ⅳ期；②存在TACE治療禁忌；③生存期低于3個月；④美國東部協(xié)作組（ECOG）體力狀況（PS）評分高于2分；⑤接受過射頻消融術、微波消融術、根治性手術或靶向藥物治療等。104例HCC患者中男72例，女32例，年齡51～70歲，平均（62.7±5.3）歲。本研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 臨床信息收集 收集HCC患者年齡、性別、腫瘤分期、腫瘤數(shù)目、腫瘤直徑、乙肝病毒表面抗原（HBsAg）、Child-Pugh分級、甲胎蛋白（AFP）、TACE治療后近、遠期療效等。

1.2.2 HCC組織中MT-3水平檢測 采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blotting）［10］檢 測HCC組織中MT-3水平。步驟如下：將細胞裂解液滴加至裝有HCC組織的試管中，裂解癌組織細胞；4℃下以3 500 r/min轉速離心10 min（離心半徑8 cm），分離上清液；用BCA蛋白定量試劑盒對蛋白進行定量；電泳120 V 100 min，轉膜200 mA 90 min；滴加兔抗人MT-3單克隆抗體（上海群己生物科技有限公司），4℃孵育過夜，次日滴加二抗，室溫下孵育1 h；曝光顯影，用Image J軟件分析實驗結果。

1.2.3 TACE治療方法 術前檢查所有HCC患者血、尿、糞便常規(guī)，凝血功能，肝，腎功能及心電圖等。術中患者取仰臥位，常規(guī)消毒、鋪巾，局部麻醉。經(jīng)股動脈入路，置入導管鞘，插管至腹腔動脈或肝總動脈造影，了解腫瘤病灶的供血情況。將化療藥物（奧沙利鉑100 mg/m2和5-氟尿嘧啶500 mg/m2）和5～20 mL已充分乳化的化療藥物與超液化碘化油混懸液灌注至腫瘤病灶供血動脈［11］。根據(jù)腫瘤病灶大小和血供情況判斷乳化劑用量，最大程度做到完全栓塞。術后給予鎮(zhèn)痛、保肝和止吐藥物，同時給予營養(yǎng)支持，密切觀察有無相關并發(fā)癥發(fā)生，如發(fā)熱、惡心、嘔吐及肝區(qū)悶痛等，如有相關并發(fā)癥發(fā)生給予對癥治療［12］。術后1個月復查CT，若有新生腫瘤病灶或病灶內(nèi)有強化區(qū)域，再次給予TACE治療；若腫瘤病灶壞死且無增大或碘油沉積濃密，則暫不給予TACE治療。若發(fā)生TACE治療抵抗，則采取綜合治療方案，如聯(lián)合靶向治療、消融治療等。

1.2.4 TACE治療療效判斷 于患者出院后1個月開始隨訪，首次隨訪采用復診方式，復查CT或MRI，了解有無腫瘤復發(fā)、轉移等情況。后續(xù)隨訪通過電話和復診方式了解HCC患者預后情況。每月隨訪1次，末次隨訪時間為2020年1月18日。

近期療效：采用改良實體瘤療效評價標準（mRECIST）［13］評價TACE治療的近期療效（術后4周）。經(jīng)CT或MRI檢查，所有目標病灶內(nèi)動脈期無增強顯影，則定義為完全緩解（CR）；經(jīng)CT或MRI檢查，目標病灶的直徑總和降低30%，則定義為部分緩解（PR）；經(jīng)CT或MRI檢查，目標病灶的直徑總和降低，但未達到PR標準或升高程度低于20%，則定義為疾病穩(wěn)定（SD）；經(jīng)CT或MRI檢查，目標病灶的直徑總和升高20%或有新病灶出現(xiàn)，則定義為疾病進展（PD）。本研究將CR、PR和SD定義為治療有效，將PD定義為治療無效［14］。

遠期療效：用HCC患者5年生存預后評價TACE治療的遠期療效。通過電話及復診等方式了解HCC患者生存及死亡等情況。

1.3 統(tǒng)計學分析

用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計學分析。正態(tài)分布的定量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組獨立數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗。定性資料用例或率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。用受試者工作特征（ROC）曲線評價MT-3診斷TACE治療療效的價值。用Kaplan-Meier繪制不同MT-3水平的HCC患者生存曲線，用Log-Rank法比較差異。用Cox回歸分析影響HCC患者生存預后的因素。將P＜0.05定義為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組基線資料比較

104例HCC患 者 經(jīng)TACE治 療 后，CR 18例（17.3%），PR 31例（29.8%），SD 21例（20.2%），PD 34例（32.69%）。有效組（70例）和無效組（34例）在年齡、性別、Child-Pugh分級、腫瘤分期、腫瘤數(shù)目、腫瘤直徑、HBsAg和AFP水平方面比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

2.2 MT-3評價TACE療效的價值

有效組HCC組織中MT-3水平為（4.29±1.01），高于無效組（3.07±0.68），差異有統(tǒng)計學意義（t=7.275，P＜0.001）。MT-3評 價 接 受TACE治 療 的HCC患者近期療效的ROC曲線下面積（AUC）為0.825（95%CI：0.738～0.892），最大約登指數(shù)為0.550，其所對應的最佳截斷點、靈敏度和特異度分別為3.52、76.5%和78.6%，見圖1①。104例HCC患者1年、3年和5年生存率分別為85.6%（89/104）、72.1%（75/104）和59.6%（62/104）。MT-3評價接受TACE治療的HCC患者遠期療效的ROC AUC為0.913（95%CI：0.842～0.960），最大約登指數(shù)為0.720，其所對應的最佳截斷點、靈敏度和特異度分別為3.58、88.10%和83.87%，見圖1②。

表1 兩組患者基線資料比較

圖1 MT-3診斷TACE治療近遠期療效的ROC曲線

2.3 MT-3與接受TACE治療的HCC患者預后的關系

以MT-3評價接受TACE治療的HCC患者遠期療效的最佳截斷點為界，將104例HCC患者分為兩組：高表達組（MT-3≥3.58，n=63）和低表達組（MT-3＜3.58，n=41）。高表達組中位生存時間高于低表達組（60個月比26個月），差異有統(tǒng)計學意義（Log-Rank Chi-square=45.373，P＜0.001），見圖2。

2.4 影響接受TACE治療的HCC患者預后的因素分析

圖2兩組患者生存曲線

將HCC患者5年生存預后作為因變量，將年齡、性別、Child-Pugh分級、腫瘤分期、腫瘤數(shù)目、腫瘤直徑、HBsAg、AFP和MT-3水平作為自變量，納入Cox單因素回歸分析，結果顯示腫瘤分期、Child-Pugh分級、腫瘤直徑和MT-3水平與HCC患者5年生存預后有關（P＜0.05）。將腫瘤分期、Child-Pugh分級、腫瘤直徑和MT-3作為自變量，將HCC患者5年生存預后作為因變量，納入Cox多因素回歸分析，結果顯示腫瘤分期、Child-Pugh分級和腫瘤直徑是HCC患者5年生存預后的獨立危險因素（P＜0.05），MT-3是HCC患者5年生存預后的獨立保護因素（P＜0.05），見表2。

表2影響HCC患者5年生存預后的因素分析

3 討論

MT可螯合致癌金屬離子和維持氧化還原穩(wěn)態(tài)在正常細胞發(fā)揮抑癌作用。MT在部分惡性腫瘤表達上調(diào)，與腫瘤惡性程度高度相關，且與放化療靈敏度有關［15-16］。MT與鉑類化療藥物耐藥有關，被視為預后不良的標志物［17-18］。MT-3作為MT家族的一員，在不同類型惡性腫瘤中表達水平差異較大，其在乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肺癌、多形性成膠質(zhì)細胞瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤中高表達［6，19-24］，但在HCC、胃癌、食管癌和白血病中低表達［6，25-27］，并與患者 預后關系密切。

本研究主要探究HCC組織中MT-3表達水平與TACE治療近、遠期療效的關系，結果顯示有效組HCC組織中MT-3水平高于無效組，該結果提示MT-3可能與TACE治療近期療效有關。此外，本研究結果還顯示MT-3評價接受TACE治療的HCC患者近期療效的ROC曲線AUC、靈敏度和特異度分別為0.825、76.47%和78.57%，該結果表明MT-3對TACE治療近期療效的價值較高，靈敏度和特異度尚可；MT-3評價接受TACE治療的HCC患者遠期療效的ROC曲線AUC、靈敏度和特異度分別為0.913、88.10%和83.87%，該 結 果 表 明MT-3對TACE治療遠期療效的價值極高，靈敏度和特異度均較高。為進一步分析MT-3與TACE治療HCC遠期預后的價值，本研究比較了MT-3高表達和低表達組5年生存預后，結果顯示高表達組中位生存時間高于低表達組，該結果表明HCC組織中MT-3水平可能與HCC患者預后有關。

張長坤等［28］研究表明HCC患者Child-Pugh分級、腫瘤直徑和AFP與預后密切相關。劉光華等［11］研究曾證實HCC腫瘤分期、腫瘤數(shù)目多發(fā)、病灶直徑大于5 cm及AFP是其預后不良的獨立危險因素。為避免混雜因素影響分析結果，本研究采用Cox單因素和多因素回歸分析影響HCC患者5年生存預后的因素，結果顯示腫瘤分期、Child-Pugh分級和腫瘤直徑是HCC患者5年生存預后的獨立危險因素，而AFP和腫瘤數(shù)目與預后無關，與上述文獻結果存在出入，推測與樣本量大小、地域及納排標準等有關，后續(xù)還需開展大樣本、多中心研究予以驗證。此外，本研究還證實MT-3是HCC患者5年生存預后的獨立保護因素，推測MT-3通過下調(diào)HCC細胞自噬水平增加對化療藥物的靈敏度，檢測HCC組織中MT-3水平可了解癌細胞的自噬水平，進而了解化療靈敏度，從而評價TACE治療療效。

綜上所述，HCC組織中MT-3水平高提示接受TACE治療的近、遠期療效均較好。本研究尚未探究MT-3參與HCC發(fā)病及進展的病理生理機制以及其與HCC細胞化療靈敏度的關系，下一步將開展基礎研究進行闡明。