減味壽胎丸治療自然流產(chǎn)活性成分和作用機制的網(wǎng)絡藥理學研究

何 珊 寧 艷 蔣紹艷 劉大艷 鄧少潔 劉雪芳 曾 丹

1.南方醫(yī)科大學附屬深圳婦幼保健院藥劑科，廣東深圳 518028；2.南方醫(yī)科大學附屬深圳婦幼保健院中醫(yī)科，廣東深圳 518028；3.南方醫(yī)科大學附屬深圳婦幼保健院生殖醫(yī)學中心，廣東深圳 518028

自然流產(chǎn)（spontaneous abortion，SA）是指妊娠未達28 孕齡發(fā)生的胚胎和胎兒丟失，主要包括在此時期內(nèi)出現(xiàn)的胚胎及胎兒停止發(fā)育或自然排出[1]。SA 是產(chǎn)科和生殖領(lǐng)域最常見的疾病，目前臨床上西醫(yī)的激素治療和免疫治療的安全性和效果尚不明確。祖國醫(yī)學對SA 認識已久，屬于“滑胎”范疇，“胎漏”“胎動不安”“墮胎”等最早在《脈經(jīng)》中可查。中醫(yī)認為SA 的病機是腎虛，故治療大法為補腎安胎。壽胎丸記載自《醫(yī)學衷中參西錄》[2]治女科方中，是補腎安胎之代表方，臨床在先兆流產(chǎn)及復發(fā)性流產(chǎn)中的治療效果確切，由菟絲子、桑寄生、續(xù)斷和阿膠四味藥組成。郜潔等[3-4]證實去阿膠的減味壽胎丸（JWSTP）不僅減輕了患者的經(jīng)濟負擔，而且與原方具有基本相同的安胎效果。同時JWSTP 的方藥組成也是臨床上常用保胎方劑的基礎(chǔ)方，如滋腎育胎丸、保胎靈等。雖然已有不少關(guān)于JWSTP 安胎機制的研究報道，但是整體作用機制并不明確。網(wǎng)絡藥理學以大數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，系整體地揭示中藥方劑的內(nèi)在機制和活性化學成分作用，展現(xiàn)中藥多成分、多靶點和多通路的作用關(guān)系，正同中醫(yī)基礎(chǔ)理論的整體觀念和辨證論治不謀而合[5]。本研究應用網(wǎng)絡藥理學技術(shù)探討JWSTP 在分子水平多成分、多靶點及多通路對SA 的整體調(diào)節(jié)作用，是JWSTP 治療SA 作用機制和活性成分的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 JWSTP 活性成分-靶點預測

與JWSTP 相關(guān)的所有化合物來自中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺[6]（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）。參考相關(guān)文獻報道[7]，篩選條件如下：類藥性（drug likeness，DL）≥0.18 和口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，得到JWSTP 中菟絲子、續(xù)斷和桑寄生3 味藥的生物活性化合物及相關(guān)的潛在靶點。

1.2 靶點收集

通過限定物種為人類、校正靶點為官方名稱（official gene symbol）、剔除非人源靶點和去除沒有靶點的活性成分等方式，在Uniprot 數(shù)據(jù)庫（http://www.Uniprot.org/）建立活性成分-作用靶點數(shù)據(jù)集。采用Cytoscape 3.7.2（http://www.cytoscape.org/）構(gòu)建活性成分-作用靶點網(wǎng)絡[8]。通過附加CytoNCA 計算網(wǎng)絡中每個節(jié)點的網(wǎng)絡拓撲學參數(shù)，本研究應用度中心性（degree centrality，DC）篩選活性成分-靶點網(wǎng)絡的核心網(wǎng)絡，并進行文獻驗證。應用關(guān)鍵詞“spontaneous abortion”或“abortion，spontaneous”在OMIM（https://www.omim.org/）和GeneCards（https://www.genecards.org/）中收集疾病相關(guān)靶點[9]。采用Venny 2.1（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）分析活性成分和SA 的靶點，得到JWSTP 治療SA 的潛在靶點，以韋恩圖的形式展現(xiàn)。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡構(gòu)建

將“1.2”項得到的靶點集上傳到STRING 11.0 數(shù)據(jù)庫[10]。0.95 被設(shè)置為minimum required interaction score 的confidence 值，孤立的靶點蛋白給予剔除，獲取潛在靶點蛋白在系統(tǒng)水平上的相互作用關(guān)系，在Cytoscape 軟件對作用關(guān)系進行可視化及網(wǎng)絡拓撲學的分析，并篩選核心作用靶點。

1.4 JWSTP 治療SA 潛在靶點的功能注釋分析

基因本體（GO）生物過程和京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫（KEGG）代謝通路的富集分析在DAVID 6.8（https://david.ncifcrf.gov/）進行。選擇物種為“Homo sapiens”，由多到少對富集靶標數(shù)量進行排序，選取排序前10 的生物過程與通路作為主要分析對象。結(jié)合文獻對該10 條通路進行分析，得到可能的關(guān)鍵通路。

1.5 “活性成分-有效靶點-關(guān)鍵通路”網(wǎng)絡

將JWSTP 的活性成分、有效作用靶點、關(guān)鍵KEGG 通路信息導入Cytoscape 軟件中構(gòu)建網(wǎng)絡，并進行可視化，來自成分-靶標-通路三者之間構(gòu)建的復雜網(wǎng)絡關(guān)系將被展現(xiàn)，直觀顯示該藥治療SA 的作用機制。

2 結(jié)果

2.1 JWSTP 活性成分的篩選

通過檢索TCMSP，以O(shè)B≥30%和DL≥0.18 為限制條件，共收集到18 個活性成分，其中菟絲子11 個，桑寄生2 個，續(xù)斷8 個，菟絲子和桑寄生共有成分為槲皮素，菟絲子和續(xù)斷共有成分為β-谷甾醇，續(xù)斷和桑寄生的共有成分為谷甾醇。見圖1。

2.2 JWSTP 活性成分-作用靶點網(wǎng)絡模型

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索，18 個活性成分中有14 個檢索到對應的219 個作用靶點，其中菟絲子對應的靶點有216 個，續(xù)斷對應的靶點有53 個，桑寄生對應的靶點有151 個。構(gòu)建的網(wǎng)絡圖見圖2A，網(wǎng)絡共有233 個節(jié)點，361 條邊，每個節(jié)點平均與3 個節(jié)點相連。同時可見多個靶點與1 個活性成分作用，也有1 個靶點與多種活性成分作用，可見JWSTP 的作用特點是多成分、多靶點的。

圖1 減味壽胎丸藥物-活性成分網(wǎng)絡圖

網(wǎng)絡中每一節(jié)點的DC 值借助CytoNCA 計算，得到DC 中位數(shù)為1。根據(jù)相關(guān)文獻[11]的報道，DC 大于2 倍中位數(shù)值的節(jié)點為重要節(jié)點，即以DC＞2 篩選得到核心作用網(wǎng)絡（圖2B），有42 個節(jié)點和120 條邊在此網(wǎng)絡中。在此網(wǎng)絡中，有14 個活性成分，其中有較大DC 的在菟絲子中有8 個，分別是槲皮素、異鼠李素、β-谷甾醇、山奈酚、膽固醇、芝麻素、豆甾-5，24（28）-二烯-3-醇、異巖藻甾醇；續(xù)斷中有4 個，分別是β-谷甾醇、谷甾醇、龍膽山酮、林生續(xù)斷苷Ⅲ_qt；桑寄生中有2 個，分別是槲皮素和谷甾醇。盧浩等[12]的實驗研究證明，槲皮素為黃酮類化合物，通過抑制單核細胞趨化蛋白-1 的生成，阻止巨噬細胞向子宮內(nèi)膜遷移，并且下調(diào)CD14 的表達，減少腫瘤壞死因子-α 的分泌，從而發(fā)揮抗流產(chǎn)的作用。山奈酚同樣為黃酮類化合物，能影響平滑肌細胞膜上L 型電壓依賴性Ca2+通道狀態(tài)及細胞內(nèi)鈣釋放量的多少來拮抗縮宮素等引起的妊娠家兔離體子宮平滑肌劇烈收縮活動[13]。董曦等[14]的研究表明，異鼠李素也是黃酮類化合物，能夠抑制H2O2引起的細胞氧化應激損傷，其機制為影響線粒體凋亡通路以及激活Nrf2/ARE 信號通路，實現(xiàn)抗氧化、抗凋亡功能。β-谷甾醇是一種植物甾醇，研究顯示其擁有抗氧化活性，可增加超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性，從而降低過氧化氫酶活性，且在抗氧化酶合成時不產(chǎn)生毒性或異常[15]。

在核心網(wǎng)絡（圖2B）中，共31 個作用靶點，其中有較大DC 值的靶點為NCOA2（DC=8）、PTGS2（DC=7）、DPP4（DC=5）、GABRA1（DC=5）、HSP90（DC=5）、PIK3CG（DC=5）、PRKACAmRNA（DC=5），以上靶點被認為是JWSTP 的關(guān)鍵作用靶點。

2.3 JWSTP 對SA 作用靶點的預測

通過檢索GeneCards 和OMIM 數(shù)據(jù)庫，共收集到1736 個SA 相關(guān)靶點。將JWSTP 的3 味藥的活性成分靶點分別與SA 靶點匹配后，得到108 個JWSTP 治療SA 的潛在靶點，以韋恩圖的形式展現(xiàn)。見圖3。

2.4 靶蛋白PPI 網(wǎng)絡模型分析

PPI 網(wǎng)絡包括107 節(jié)點（未參與相互作用的有1 個蛋白），204 條邊，其中靶點蛋白用節(jié)點表示，靶點之間的作用關(guān)系由邊表示，邊數(shù)代表一個節(jié)點的DC 值，邊寬度與Combine score 值成正比，節(jié)點的大小與DC成正比，顏色代表顯著性，顏色越深代表顯著越高，見圖4。節(jié)點平均DC 為4.916，大于平均DC 的節(jié)點有37 個。其中轉(zhuǎn)錄因子AP-1（JUN，DC=19）、腫瘤壞死因子（TNF，DC=16）、蛋白激酶（AKT1，DC=15）、白介素-6（IL-6，DC=14）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA，DC=13）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1，DC=13）等靶點蛋白DC 值較大，與其他靶點蛋白的相互作用較強，可能是JWSTP 治療SA 的關(guān)鍵靶點。以JUN 為中心的PPI 網(wǎng)絡見圖5。

2.5 GO 生物過程和KEGG 代謝通路富集分析結(jié)果

在JWSTP 治療SA 的108 個靶蛋白中，有107 個靶蛋白參與GO 的生物過程富集，見表1。JWSTP 治療SA 的生物過程主要涉及RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控（30.8%）、藥物反應（24.3%）、DNA 模板的轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控（23.4%）等。由此可知，JWSTP 可能是通過調(diào)節(jié)這些生物過程治療SA。

圖2 減味壽胎丸活性成分-作用靶點網(wǎng)絡

圖3 減味壽胎丸治療自然流產(chǎn)相關(guān)靶點的韋恩圖

在JWSTP 治療SA 的108 個靶蛋白中，只有98 個靶蛋白參加了KEGG 代謝通路富集。主要涉及PI3K/AKT信號通路、MAPK 信號通路和TNF 信號通路，見表2。

2.6 活性成分-潛在作用靶點-關(guān)鍵通路網(wǎng)絡構(gòu)建結(jié)果

把JWSTP 治療SA 的關(guān)鍵通路與活性成分、作用靶標一一對應，構(gòu)建整體網(wǎng)絡。其中，藥物應用三角形代表，活性成分由菱形代表，作用靶標由圓形代表，關(guān)鍵通路由V 形代表。從所構(gòu)建的網(wǎng)絡可知，JWSTP 治療SA 涉及活性成分有8 個，它們作用的靶標主要有PTGS2、PIK3CG、CASP3、NOS3、AKT1、JUN、TNF 等42 個；上述靶蛋白主要涉及PI3K-Akt、MAPK 和TNF 信號通路。見圖6。

圖4 減味壽胎丸治療自然流產(chǎn)相關(guān)靶點PPI 網(wǎng)絡

3 討論

本文基于網(wǎng)絡藥理學，通過對JWSTP 進行成分、靶點和作用通路與疾病構(gòu)建整體網(wǎng)絡，初步探討了JWSTP 治療SA 的整體機制。在JWSTP 中，以菟絲子為君藥，補益腎精，腎旺則能蔭胎；以續(xù)斷和桑寄生為輔，補肝腎、固沖任，強壯胎氣。三藥共奏補腎安胎之功?；谙嚓P(guān)數(shù)據(jù)庫，共檢索到14 個有效活性成分，有對應的219 個作用靶點，其中君藥菟絲子對應的靶點最多，有216 個，桑寄生為151 個，續(xù)斷對應的有53 個。多個靶點與1 個活性成分作用，同時也有1 個靶點與多種活性成分作用，可見JWSTP 的作用特點是多成分、多靶點的。靶點和活性成分的對應及分布，可以反映JWSTP 的科學內(nèi)涵。

圖5 以JUN 為中心的PPI 網(wǎng)絡

對JWSTP 作用于SA 有效靶點的PPI 進行網(wǎng)絡拓撲學分析，根據(jù)網(wǎng)絡節(jié)點的DC 值篩選出JUN、TNF、AKT1、IL-6、VEGFA、MAPK1 為關(guān)鍵核心靶點。目前認為MAPK 家族成員ERKs、JNK、Fos 調(diào)控激酶在基因水平和蛋白質(zhì)水平對JUN 活性進行調(diào)控[16]。JUN 在人胎盤中有廣泛表達，活化的JUN 可以作用于胎兒發(fā)育和調(diào)控胎盤的形成[17]。王麗紅等[18]的研究表明血清TNF-α、IL-6 等細胞因子表達與妊娠的成功與否具有相關(guān)性，也可以作為判斷先兆流產(chǎn)預后的參考指標之一。AKT1 在細胞存活、生長和增殖等過程中扮演著重要的角色，可介導新生血管的生成，因此缺失AKT1 會影響胎盤功能，引起胎兒生長緩慢[19]。TNF-α 是具有多功能的細胞因子，存在于輸卵管、卵巢、子宮、胎盤和胚胎組織中，目前認為TNF-α 參與免疫性妊娠丟失的發(fā)生，并且介導了各種胚胎應激[20]。

表1 減味壽胎丸治療自然流產(chǎn)靶點的生物過程分析

表2 減味壽胎丸對自然流產(chǎn)作用靶點的KEGG 通路富集結(jié)果（前10）

GO 生物過程富集分析表明JWSTP 主要通過RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、藥物反應、DNA模板轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、凋亡過程的負調(diào)控等生物過程，從而達到治療SA 的作用。KEGG 分析結(jié)果顯示，靶點參與的通路主要涉及SA 發(fā)病機制中PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路和TNF 信號通路。有研究發(fā)現(xiàn)，PI3K-Akt 信號通路可對卵巢功能及雌孕激素分泌有影響作用，胚胎的植入、著床及滋養(yǎng)細胞的增殖、分化、遷移和侵襲均與此通路有關(guān)[21-25]?；罨甜B(yǎng)細胞的此通路，能夠?qū)θ焉镌缙谧甜B(yǎng)層細胞的增殖、遷移和侵襲有促進作用[26-28]。抑制或使失活滋養(yǎng)細胞中的此信號通路，可顯著抑制滋養(yǎng)細胞增殖、遷移和侵入能力，導致胎盤發(fā)育及結(jié)構(gòu)異常，發(fā)生流產(chǎn)、早產(chǎn)、胎兒生長受限、胎兒先天異常等不良妊娠[29-30]。文獻報道[31-32]MAPK 信號通路之一的p38MAPK 信號通路可植入胎盤，可維持正常妊娠和胎兒發(fā)育。王永清等[33]的研究發(fā)現(xiàn)，p38MAPK 信號通路可以使人絨毛滋養(yǎng)細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶的表達量上調(diào)，使基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑的表達量下調(diào)，從而促進滋養(yǎng)細胞的侵襲行為。TNF 信號通路主要包括Caspase 家族介導的細胞凋亡、銜接蛋白TRAF 介導的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 和JNK 蛋白激酶的活化等3 條信號傳遞通路。在母胎界面，高表達的TNF-α 可引起信號通路中TNFR1、FADD、Caspase-8、Caspase-3 的高表達，進而導致細胞凋亡，最終導致胚胎失養(yǎng)而流產(chǎn)[34]。由此可以預測JWSTP 主要是通過以上的代謝途徑治療SA。本研究結(jié)果表明，JWSTP 通過多個活性成分、作用靶點及生物過程治療SA，具有復雜多樣的作用機制，這與中藥治療疾病的特點相吻合。但本研究結(jié)果是以大數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)的分子機制上的預測探討，日后仍需通過相關(guān)的實驗研究對此結(jié)果予以驗證。

圖6 活性成分-作用靶標-關(guān)鍵通路網(wǎng)絡