原發(fā)免疫性血小板減少癥患者外周血CD4+T 淋巴細胞表面PD-1 表達水平分析

陳 哲 張 靈 劉 潔 張 斌 高炳華

1.河北北方學院附屬第一醫(yī)院血液科，河北張家口 075000；2.河北北方學院附屬第一醫(yī)院檢驗科，河北張家口 075000

原發(fā)免疫性血小板減少癥（immune thrombocy topenia，ITP）既往又稱為特發(fā)性血小板減少性紫癜，是一種常見的出血性疾病，臨床以皮膚黏膜出血為主，嚴重者可有內臟甚至顱內出血，患者可有明顯乏力癥狀[1]。體液和細胞免疫介導的血小板過度破壞以及巨核細胞數(shù)量和質量異常導致血小板生成不足是ITP 疾病發(fā)生的重要機制[2]。有研究證實，細胞免疫紊亂在ITP 發(fā)病過程中具有重要作用，其中以自身反應性T 淋巴細胞活化最為關鍵[3-6]。T 細胞活化過程除受第一信號、協(xié)同刺激型號等調控外，還受到負性信號分子反饋調控。程序性死亡因子-1（PD-1）/PD-L1 屬于B7/CD28 家族的一對負性共刺激分子，在T 細胞活化及免疫耐受中發(fā)揮重要的負性調節(jié)作用[7-10]?；诖?，本研究通過檢測ITP 患者CD4+T 淋巴細胞表面PD-1 的表達，探討PD-1 在ITP 發(fā)病中的作用，從而為ITP 的治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取河北北方學院附屬第一醫(yī)院（以下簡稱“我院”）血液科2015 年12 月—2017 年12 月收治的100 例新診斷的ITP 患者納入研究組，男36 例，女64 例；年齡23～68 歲，平均（42.59±6.35）歲。納入標準：①符合《成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療中國專家共識（2016 年版）》[11]的診斷標準；②對本研究知情同意并簽署知情同意書，配合治療和隨訪。排除標準：①患有假性血小板減少、繼發(fā)性血小板減少或先天性血小板減少癥；②妊娠或哺乳期婦女；③合并造血系統(tǒng)疾病；④參與本次研究前30 d 內接受過血小板輸注、糖皮質激素和丙種球蛋白治療。

同期選取我院門診體檢的健康志愿者50 名作為對照組，男18 名、女32 名；年齡22～71 歲，平均（43.34±6.82）歲。兩組年齡、性別構成比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。本研究經我院醫(yī)學倫理委員會審核通過。

1.2 治療方法

研究組給予0.15 mg/（kg·d）的地塞米松（廠家：辰欣藥業(yè)股份有限公司；批號：1509 092211；規(guī)格：5 mg/支）靜脈輸注，1 次/d 或0.8 mg/（kg·d）的甲潑尼龍（廠家：輝瑞制藥有限公司；批號：AT9833；規(guī)格：40 mg/支）靜脈輸注，1 次/d。病情好轉后改為1 mg/（kg·d）潑尼松（廠家：浙江仙琚制藥股份有限公司；批號：151124；規(guī)格：5 mg/片）頓服，一共連續(xù)治療4 周。

1.3 觀察指標

采集研究組及對照組治療前后晨起空腹靜脈血2 mL。采用流式細胞術檢測CD4+T 淋巴細胞表面PD-1 表達情況，鼠抗人CD45-PerCP-Cy5.5（批號：9247247）、CD3-APC（批號：561811）、CD4-FITC（批號：9239677）、PD-1-BV421（批號：565935）單克隆抗體均購自美國BD 公司，BD FACSCantoTMⅡ流式細胞儀來自美國BD 公司，流式分析軟件為BD FACSDiva Software。

隨訪患者4 周，觀察研究組治療前后血小板計數(shù)及CD4+T 淋巴細胞表面PD-1 陽性表達率的變化。按治療效果將研究組分成3 個亞組[11]：完全反應組即治療后血小板計數(shù)≥100×109/L 且沒有出血；有效組即治療后血小板計數(shù)≥30×109/L 并且至少比基礎血小板計數(shù)增加2 倍且沒有出血；無效組即治療后血小板計數(shù)<30×109/L 或者增加不到基礎血小板計數(shù)的2 倍或者有出血。血小板計數(shù)均檢測2 次且兩次間隔7 d，結果取平均值。然后比較3 個亞組間CD4+T 淋巴細胞表面PD-1陽性表達率的差異。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間及組內比較采用t 檢驗，計數(shù)資料采用例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組治療前后血小板計數(shù)比較

治療前，研究組血小板計數(shù)低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。治療后，研究組血小板計數(shù)較治療前升高，但研究組仍低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）。見表1。

表1 兩組治療前后血小板計數(shù)比較（×109/L，）

表1 兩組治療前后血小板計數(shù)比較（×109/L，）

2.2 兩組治療前后CD4+T 淋巴細胞表面PD-1 陽性表達率比較

治療前研究組CD4+T 淋巴細胞表面PD-1 陽性表達率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。治療后，研究組CD4+T 淋巴細胞表面PD-1 陽性表達率較治療前降低，但研究組仍高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）。見表2。

表2 兩組治療前后CD4+T 淋巴細胞表面PD-1 陽性表達率比較（%，）

表2 兩組治療前后CD4+T 淋巴細胞表面PD-1 陽性表達率比較（%，）

注：PD-1：程序性死亡因子-1

2.3 不同治療效果亞組間CD4+T 淋巴細胞表面PD-1陽性表達率比較

完全反應亞組共33 例，有效亞組共39 例，無效亞組共28 例。三組治療前CD4+T 淋巴細胞表面PD-1陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。治療后，完全反應組和有效組CD4+T 淋巴細胞表面PD-1陽性表達率均較治療前降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05），無效組治療前后CD4+T 淋巴細胞表面PD-1 陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。三組CD4+T 淋巴細胞表面PD-1 陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），完全反應組CD4+T 淋巴細胞表面PD-1 陽性表達率低于有效組和無效組，有效組低于無效組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）。見表3。

3 討論

ITP 是一種臨床常見的出血性疾病，約占全部出血性疾病的30%，該病發(fā)病率為（5～10）/10 萬人口[12]。ITP 患者常有較為明顯的出血癥狀，嚴重者可發(fā)生內臟出血或顱內出血，威脅生命；另一方面，目前該病無特效藥物，治療后易反復發(fā)作，因此需要進行長期維持性治療，嚴重降低了患者的生活質量。

表3 不同治療效果組CD4+T 淋巴細胞表面PD-1 陽性表達率比較（%，）

表3 不同治療效果組CD4+T 淋巴細胞表面PD-1 陽性表達率比較（%，）

注：與有效組比較（t=9.141，aP <0.001）；與無效組比較（t=13.810，bP<0.001）；與無效組比較（t=7.398，cP <0.001）。PD-1：程序性死亡因子-1

現(xiàn)在研究發(fā)現(xiàn)ITP 的主要發(fā)病機制是自身免疫失耐受所致體液免疫和細胞免疫異常，導致血小板破壞增加、生成減少[13-15]，其中自身T 細胞免疫失耐受起著重要的作用，主要表現(xiàn)在血小板自身抗原反應性T細胞過度增殖活化、調節(jié)性T 細胞數(shù)量及功能異常、輔助性T 細胞異常等。PD-1 即CD279，為CD28 超家族的成員，其缺乏近膜端半胱氨酸殘基，因此常以單體形式主要表達在活化的T 細胞、B 細胞、單核細胞等表面，在維持淋巴細胞穩(wěn)態(tài)方面起關鍵作用。PD-L1和PD-L2 是PD-1 的兩個配體，PD-L1 主要在活化的T 細胞、B 細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和腫瘤細胞廣泛表達，而PD-L2 主要表達于樹突狀細胞表面[16-17]。目前許多研究表明，PD-1/PD-L1 是T 細胞重要的負性調控信號，一旦表達異常將會造成自身免疫調節(jié)失衡、免疫耐受被破壞[18]，與多種自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關，如類風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等[19-20]。但目前關于PD-1 與ITP 的相關性研究仍較少。

本研究結果顯示，ITP 患者CD4+T 淋巴細胞表面PD-1 陽性率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），經糖皮質激素治療后，ITP 患者血小板明顯升高，但其仍低于對照組，CD4+T 淋巴細胞表面PD-1 陽性率明顯降低，但其仍高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）。且本研究結果顯示，治療后完全反應和有效組CD4+T 淋巴細胞表面PD-1 陽性率明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P >0.05），而無效組PD-1 陽性率與治療前比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05），提示治療反應越好者其治療后CD4+T 淋巴細胞表面PD-1 陽性率下降越明顯，提示CD4+T 淋巴細胞表面PD-1 的表達可能與ITP 患者體內的免疫失衡程度有關，其表達升高可能是機體自身的代償性負反饋。本研究結果與常規(guī)理論推斷自身免疫性疾病患者CD4+T 淋巴細胞表面PD-1 比例應該會下降不符，但與Stefanski 等[20]關于ITP 患者的研究結果一致。Wang 等[21]研究顯示新發(fā)ITP 患者CD4+T 淋巴細胞表面PD-1 比例升高并且PD-1/PD-L1 升高與ITP 患者疾病活動程度之間有一定關系。也有許多關于其他自身免疫病的研究發(fā)現(xiàn)外周血CD4+T 淋巴細胞表面PD-1 比例升高，且與疾病的活動度可能相關，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡等[19-20]。

綜上所述，ITP 患者CD4+T 淋巴細胞表面PD-1表達增高，可能與ITP 患者體內的免疫失衡程度有關。糖皮質激素治療能減低其表達，其降低水平與ITP 治療反應程度有關。但鑒于ITP 發(fā)病機制的復雜多樣性，因此該指標是否可以用作ITP 患者疾病發(fā)展程度及預后的評估尚需進一步深入研究。