草果揮發(fā)油及其包合物GC-MS 成分分析及抑菌試驗研究

劉 娜 丁 雄 趙 毅 蘇劉艷 趙蓉羽

云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，云南昆明 650500

草果（Amomum tsaoko），是姜科豆蔻屬植物的果實，香味濃郁，具有燥濕健脾，除痰截瘧的功效。主治脘腹脹滿，反胃嘔吐，食積瘧疾等癥[1-3]。揮發(fā)油是草果主要活性成分之一[4]，但易揮發(fā)、易氧化、不穩(wěn)定、水溶性差等缺點，限制了其在醫(yī)藥方面的應(yīng)用[5]。本研究用β-環(huán)糊精（β-CD）將其制成包合物，增加穩(wěn)定性，提高利用度[6]，掩蓋揮發(fā)油的異味[7-8]。本研究對草果揮發(fā)油及其包合物進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）成分分析，同時，進(jìn)行相關(guān)抑菌活性研究，以期為草果的綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

電子天平CP114（精密度0.1 mg，奧豪斯儀器上海有限公司）；SG8200HPT 型超聲波清洗器（上海冠特超聲儀器有限公司）；SHZ-CBZ 型循環(huán)水式多用真空泵（鞏義市予華儀器有限公司）；低溫冷卻液循環(huán)泵DLSB-20L/30（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；101-4AS 電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；FA2104 分析天平（精密度0.1 mg，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；HP6890GC/5973MS 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent Technologies 公司）。

1.2 試藥

草果[產(chǎn)地：怒江州，經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)楊雅竹副教授鑒定為姜科植物草果（Amomum tsaoko）的干燥果實]。正己烷（分析純，廣東光華科技股份有限公司，20181221）。氟康唑分散片（南昌弘益藥業(yè)有限公司，181001）；DMSO（BioFRoxx，EZ2921C395）；沙氏液體培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，1076161）；沙氏固體培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，1076641）；亞甲藍(lán)M-H 瓊脂培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，1081661）；LB 固體培養(yǎng)基（Solarbio，20190529）；瓊脂（Agar，BioFRoxx，EZ1609C222）；氯化鈉（分析純，天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，20181203）。

1.3 培養(yǎng)基和菌株

①試藥：抗真菌活性檢測陽性對照藥物氟康唑溶于DMSO，離心取上清液，貯存濃度為50 mg/mL，4℃密封避光保存。②培養(yǎng)基：沙氏液體培養(yǎng)基、沙氏固體培養(yǎng)基、亞甲藍(lán)M-H 瓊脂培養(yǎng)基、LB 液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基。③菌株：白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株SC5314、白色念珠菌臨床分離耐藥株23#（昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院李玉葉惠贈）、金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922。

2 方法與結(jié)果

2.1 草果揮發(fā)油的制備

采用水蒸氣蒸餾法提取草果揮發(fā)油[9-10]。精密量取揮發(fā)油0.5 mL，至10 mL 量瓶，加正己烷，定容至刻度，混勻，過0.45 μm 微孔濾膜，進(jìn)行GC-MS分析。

2.2 草果揮發(fā)油包合物的制備

β-CD 為包合材料[11]，超聲法制備揮發(fā)油包合物。精密稱取包合物3 g 加100 mL 水超聲破壞30 min。置于圓底燒瓶中重提揮發(fā)油，精密量取揮發(fā)油0.5 mL，至10 mL 量瓶，加正己烷，定容至刻度，混勻，過0.45 μm 微孔濾膜，進(jìn)行GC-MS 分析。

2.3 GC-MS 條件與結(jié)果

2.3.1 GC-MS 條件

2.3.1.1 GC 條件HP-5MS 石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25mm×0.25 mm）；柱溫：起始溫度40℃，程序以3℃/min 升溫至80℃，再以5℃/min 升溫至280℃，保持5 min；柱流量為1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度250℃；柱前壓100 kPa；進(jìn)樣量1.0 mL；分流比10∶1；載氣為高純氦氣。

2.3.1.2 MS 條件 電離方式EI；電子能量70；傳輸線溫度250℃；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；質(zhì)量范圍35～500；采用wiley7n.l 標(biāo)準(zhǔn)譜庫計算機(jī)檢索定性。

2.3.2 GC-MS 成分分析結(jié)果

參考文獻(xiàn)[12-14]對草果揮發(fā)油及其包合物進(jìn)行GCMS 測試，2 種揮發(fā)油的總離子流（TIC）如圖1、2 所示。對2 種揮發(fā)油的GC-MS 成分分析，見表1。將各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)由wiley7n.l 標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索并結(jié)合有關(guān)參考文獻(xiàn)[15-17]等，鑒定了60 個化合物，用峰面積歸一化法計算各成分在揮發(fā)油的相對百分含量。見表1。

草果揮發(fā)油分離出68 個化合物，鑒定68 個；草果包合物揮發(fā)油分離出64 個化合物，鑒定60 個。其中共有含量較高的主要成分有13 個序號分別為：14、10、40、44、4、6、54、30、37、42、47、63、51（按化合物占草果揮發(fā)油總化合物的含量從高到低排序），以上13 個化合物占總化合物比例分別為：占草果揮發(fā)油的81.03%；占草果包合物揮發(fā)油的79.89%。

草果揮發(fā)油包合前后60 個化合物未發(fā)生改變，分別占草果揮發(fā)油總化合物的99.11%，占草果包合物揮發(fā)油總化合物的99.65%。數(shù)據(jù)顯示揮發(fā)油經(jīng)超聲包合處理后，99%以上的成分都包合進(jìn)入β-CD中，形成穩(wěn)定的包合物。

圖1 草果揮發(fā)油總離子流圖

圖2 草果包合物揮發(fā)油總離子流圖

揮發(fā)油中有8 個化合物經(jīng)包合后CG-MS 未檢出序號分別是1、9、13、28、34、49、65、67，以上8 個化合物在草果揮發(fā)油中占總化合物的0.89%；草果包合物揮發(fā)油中有4 個成分占總化合物的0.35%，在原揮發(fā)油中未檢出，也未鑒定出。本研究推測原油中的8 個化合物可能在超聲作用下不穩(wěn)定（如順式結(jié)構(gòu)）轉(zhuǎn)化成其他更加穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)[18]，或者是分子結(jié)構(gòu)過大，沒有被包合。包合后的揮發(fā)油中未鑒定出的4 個化合物，有可能是原油中的化合物在超聲作用下發(fā)生結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生的，本課題組將進(jìn)行后續(xù)的相關(guān)研究。

2.4 抑菌試驗實驗方法與結(jié)果

2.4.1 抑菌試驗實驗方法K-B 法（標(biāo)準(zhǔn)濾紙片法）

①取純菌落，制備菌懸液，調(diào)整濃度為1×107CFU/mL，每個平板各加載菌液500 μL，立即用棉拭子均勻涂板，放置10 min 左右，待菌液完全吸收，用鑷子加載直徑為6 mm 的無菌濾紙片。②加載紙片后，取一定量的待測樣品（樣品為揮發(fā)油、和包合物重蒸后揮發(fā)油，均為液體狀）加載在濾紙片的正中心，防止抑菌圈畸形，待樣品均勻、完全的吸收后，放入恒溫恒濕箱中，孵育24 h 后，測量抑菌環(huán)的直徑。③在不反光的黑色背景下讀取抑菌圈的直徑，抑菌圈的直徑包括紙片的直徑。

2.4.2 揮發(fā)油抑菌活性實驗結(jié)果

針對草果具有燥濕健脾，除痰截瘧的功效，參考文獻(xiàn)資料[19-21]，本研究選擇了4 種菌種進(jìn)行抑菌活性實驗，結(jié)果見表2：草果揮發(fā)油及其包合物對白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株和耐藥株抑菌圈的直徑都已經(jīng)超過整個培養(yǎng)皿（>40 mm），整個培養(yǎng)皿不長菌，有很好的抑菌效果，并且抑菌效果明顯優(yōu)于氟康唑。對金黃色葡萄球菌抑菌效果較好；對大腸埃希菌有一定的抑菌效果。綜上所述，草果揮發(fā)油及其包合物對4 種菌種均有抑制作用，且包合前后的抑菌效果沒有顯著性的差異。

3 討論

采用水蒸氣蒸餾法[22]提取草果揮發(fā)油，β-CD 作為包合材料[23]，超聲法進(jìn)行草果揮發(fā)油的包合，通過GC-MS 成分分析，揮發(fā)油99%以上的成分都包合進(jìn)入β-CD 中，形成穩(wěn)定的包合物。同時，包合前后的抑菌效果沒有顯著性的差異，再次佐證了包合物對揮發(fā)油成分進(jìn)行物理包合，工藝穩(wěn)定。本研究對β-CD 包合理論[24]提供實驗數(shù)據(jù)支持。草果揮發(fā)油及其包合物對白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株以及耐藥株都很好的抑菌效果，可為云南省草果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[25]提供科學(xué)依據(jù)。

表1 草果揮發(fā)油和包合物的GC-MS 成分分析表

表2 草果揮發(fā)油和揮發(fā)油包合物抑菌活性實驗匯總表（mm）