江蘇地區(qū)人群線粒體DNA 12S rRNA A1555G和C1494T 位點(diǎn)突變分析

李孟蘭 林 寧 石 慧 王麗娟 姜志欣 黃麗麗 吳玉璘

江蘇省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所實(shí)驗(yàn)篩檢中心 江蘇省生殖健康檢驗(yàn)中心，江蘇南京 210036

耳聾是我國(guó)常見的一種感覺神經(jīng)系統(tǒng)缺陷性疾病，嚴(yán)重影響著患者本人及家庭人員的生活質(zhì)量。耳聾是由遺傳因素、環(huán)境因素或遺傳與環(huán)境因素交互作用引起的，其中由遺傳因素造成的耳聾約占所有耳聾患者的50%～60%[1]。按照遺傳方式分類，遺傳性耳聾又可分為常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳、X 連鎖遺傳和線粒體遺傳等[2-3]，其中線粒體遺傳是一種母系遺傳，其突變基因只能由母親遺傳給子代[4]，可能的原因是受精后的卵母細(xì)胞內(nèi)存在可以針對(duì)性地破壞父源性線粒體DNA 的物質(zhì)[5]。線粒體DNA 12S rRNA是氨基糖苷類抗生素誘導(dǎo)的非綜合癥性耳聾研究中的一個(gè)熱點(diǎn)區(qū)域，其中A1555G 和C1494T 這兩個(gè)位點(diǎn)的突變是目前公認(rèn)的與藥物性耳聾密切相關(guān)的致病性突變，可引起突變攜帶者對(duì)氨基糖苷類抗生素表現(xiàn)出高度敏感[6]，在應(yīng)用常規(guī)治療劑量甚至微量的氨基糖苷類抗生素之后，即可在短時(shí)間內(nèi)引起聽力不可逆的損傷，導(dǎo)致“一針致聾”的現(xiàn)象的發(fā)生[7-8]。了解江蘇地區(qū)藥物性耳聾基因線粒體DNA 12S rRNA 的突變情況，為制訂本地區(qū)藥物性耳聾的防治策略提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇江蘇鎮(zhèn)江、泰興、如皋、高郵、漣水、沭陽(yáng)6 個(gè)項(xiàng)目點(diǎn)中參加耳聾基因篩查的1843 例作為研究對(duì)象，按是否耳聾以及有無家族史分為三組，其中非綜合征性耳聾患者904 例為耳聾組，男460 例，女444 例；平均年齡（25.39±12.04）歲；聽力正常的耳聾患者家庭人員299 例為耳聾高危組，男139 例，女160 例；平均年齡（28.38±15.23）歲；聽力正常的非耳聾患者家庭人員640 例為正常對(duì)照組，男288 例，女352 例；平均年齡（28.04±5.12）歲。904 例耳聾患者按地區(qū)分為蘇南、蘇中、蘇北三組，其中鎮(zhèn)江的254 例為蘇南組，男126 例，女128 例；平均年齡（24.26±12.53）歲，泰興、如皋、高郵的287 例為蘇中組，男153 例，女134 例；平均年齡（26.13±13.13）歲，漣水、沭陽(yáng)的363 例為蘇北組，男181 例，女182 例；平均年齡（25.59±10.63）歲。耳聾組、耳聾高危組、正常對(duì)照組三組及蘇南、蘇中、蘇北三組的一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），具有可比性。所有研究對(duì)象自愿參加并簽署知情同意書。本研究通過江蘇省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 資料收集及標(biāo)本采集 收集所有研究對(duì)象的基本信息、耳聾家族史、是否耳聾、以及耳聾發(fā)病原因等資料。抽取外周靜脈血2～3 mL，EDTA 抗凝，冷鏈運(yùn)輸至本實(shí)驗(yàn)室后置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因組DNA 提取 采用血液基因組DNA 提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，貨號(hào)：DP319]，按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程提取全血基因組DNA，將經(jīng)微型分光光度計(jì)（博奧晶芯NanoQTM）檢測(cè)DNA 濃度和純度均符合實(shí)驗(yàn)要求的DNA 樣本置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 線粒體DNA 12S rRNA A1555G 和C1494T 突變檢測(cè) 采用遺傳性耳聾基因微陣列芯片檢測(cè)試劑盒（博奧生物有限公司，貨號(hào)：CP300065）、PCR 擴(kuò)增儀（ABI Veriti 96 well Thermal Cycler）、芯片雜交儀（晶芯BioMixerTMⅡ）、芯片洗干儀（晶芯SlideWasherTM24）、芯片掃描儀（晶芯LuxScan 10K-B）等儀器對(duì)受檢樣本的線粒體DNA 12S rRNA 兩個(gè)常見的突變位點(diǎn)A1555G 和C1494T 的突變檢測(cè)，所有試驗(yàn)操作均嚴(yán)格按照SOP 進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組線粒體DNA 12S rRNA A1555G 和C1494T突變率比較

耳聾組、耳聾高危組、正常對(duì)照組三組的A1555G和C1494T 突變檢出率比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；耳聾組和耳聾高危組A1555G 和C1494T突變檢出率顯著高于正常對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；耳聾高危組與耳聾組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見表1。

表1 三組線粒體DNA 12S rRNA A1555G 和C1494T 的突變率比較[例（%）]

2.2 不同地區(qū)耳聾患者線粒體DNA 12S rRNA A1555G和C1494T 突變率比較

蘇南、蘇中、蘇北三組A1555G 和C1494T 突變率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；蘇北組A1555G和C1494T 突變率高于蘇中組和蘇南組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；蘇中組和蘇南組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見表2。

表2 不同地區(qū)耳聾患者線粒體DNA 12S rRNA A1555G和C1494T 的突變率比較[例（%）]

2.3 耳聾患者發(fā)病原因分析

904 例耳聾患者中，40 例有氨基糖苷類抗生素用藥史，165 例有打針/用藥史但具體用藥不詳；109 例A1555G 和C1494T 位點(diǎn)突變的耳聾患者中，9 例有氨基糖苷類抗生素用藥史，31 例有打針/用藥史但具體用藥不詳。見表3。

表3 耳聾患者發(fā)病原因分析[例（%）]

3 討論

藥物性耳聾是指由氨基糖苷類藥物如鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素等抗生素誘發(fā)的一種非綜合征性遺傳性耳聾[9]，其主要的致病機(jī)制為藥物性耳聾基因線粒體DNA 12S rRNA 發(fā)生突變，其中最常見的突變位點(diǎn)為A1555G 和C1494T。A1555G 和C1494T 突變可使機(jī)體對(duì)線粒體蛋白的合成降低30%～40%，而氨基糖苷類抗生素的應(yīng)用可在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步降低線粒體蛋白的合成[10]，導(dǎo)致氧化磷酸化過程中ATP 生成減少以及毛細(xì)胞能量代謝障礙，最終引起聽力下降甚至聽力喪失。另有研究表明，C1494T 突變雖然可引起線粒體功能的輕度障礙和對(duì)氨基糖苷類抗生素的高度敏感，但尚不足以導(dǎo)致耳聾的發(fā)生，提示核修飾基因、線粒體單體型以及氨基糖苷類抗生素的應(yīng)用等對(duì)耳聾表型的表達(dá)起著重要的調(diào)節(jié)作用[11-12]。氨基糖苷類抗生素具有較大的毒副作用，可引起聽覺、前庭系統(tǒng)和腎臟不同程度的損傷[13]，其中對(duì)聽覺和前庭系統(tǒng)的損傷往往都是不可逆的[14]。因其抗菌譜廣、臨床起效快、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，目前仍被應(yīng)用于臨床，尤其是在發(fā)展中國(guó)家和一些偏遠(yuǎn)地區(qū)，更是臨床的常規(guī)用藥之一[15]。

線粒體遺傳屬于母系遺傳，平均每檢測(cè)出一個(gè)線粒體DNA 12S rRNA 基因突變攜帶者，可以發(fā)現(xiàn)10 個(gè)甚至10 個(gè)以上的攜帶有相同突變位點(diǎn)、但未發(fā)生藥物性耳聾的母系家庭成員[16]。對(duì)于這些突變基因攜帶者，尤其是有生育計(jì)劃的孕前女性，突變基因會(huì)100%遺傳給下一代[17-18]。我國(guó)地域廣闊，各地經(jīng)濟(jì)、衛(wèi)生發(fā)展不均衡，且耳聾基因的分布類型以及分布頻率在不同地區(qū)、不同民族間也具有差異性[19]。

本研究發(fā)現(xiàn)耳聾患者中A1555G 和C1494T 突變檢出率為12.06%，明顯高于徐彬等[20]報(bào)道的5.63%和李守霞等[21]等報(bào)道的2.61%，其中主要的突變位點(diǎn)和突變類型為A1555G 均質(zhì)突變（11.06%），可能與研究對(duì)象不完全相同有關(guān)；耳聾高危組突變檢出率為9.03%，均為A1555G 均質(zhì)突變；正常對(duì)照組突變檢出率為0.31%，均為A1555G 位點(diǎn)均質(zhì)突變，與趙艷輝等[22]、巫靜帆等[23]報(bào)道的數(shù)據(jù)相近。A1555G 和C1494T 突變具有母系遺傳的特點(diǎn)，先證者所有母系家庭人員均攜帶相同的基因突變位點(diǎn)和突變類型，而本研究的研究對(duì)象中既有散發(fā)病例，也有耳聾家系，其中有部分耳聾家系被證實(shí)為藥物性耳聾家系，其所有的母系家庭人員均攜帶相同的A1555G 均質(zhì)突變[24-25]，從而導(dǎo)致A1555G 和C1494T 總的突變檢出率相對(duì)較高。不同地區(qū)耳聾基因突變檢出率不同，可能是耳聾基因的突變類型和突變頻率在不同地區(qū)之間有一定的地域差異；與蘇南、蘇中比較，蘇北經(jīng)濟(jì)、衛(wèi)生發(fā)展相對(duì)落后，對(duì)藥物性耳聾的防控知識(shí)的宣傳相對(duì)較少，在農(nóng)村等偏遠(yuǎn)地區(qū)氨基糖苷類抗生素應(yīng)用頻率較高，導(dǎo)致部分突變基因攜帶者因誤用氨基糖苷類抗生素而導(dǎo)致聽力的損失。而在蘇南和蘇中地區(qū)，部分突變基因攜帶者可能因未接觸氨基糖苷類抗生素，其聽力仍然表現(xiàn)為正常或僅輕度異常。對(duì)耳聾患者和具有A1555G 和C1494T 位點(diǎn)陽(yáng)性突變的耳聾患者的發(fā)病原因進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)有氨基糖苷類抗生素用藥史的比例分別為4.42%、8.26%，部分有打針/用藥史但具體的藥物不詳（18.25%、28.44%），大部分人群發(fā)病原因不明或未報(bào)告發(fā)病原因，可能是本研究中氨基糖苷類抗生素用藥史比例較低的原因。

綜上所述，在江蘇地區(qū)人群中尤其是耳聾和耳聾高危人群中開展線粒體DNA 12S rRNA A1555G 和C1494T 突變篩查，不僅可以為突變基因攜帶者提供及時(shí)的用藥指導(dǎo)，避免藥物性耳聾的發(fā)生或者加重已有的聽力損失程度，而且對(duì)有突變母親的子代亦可從新生兒期即開始采用有效的防控手段，終身避免使用氨基糖苷類抗生素，避免或推遲藥物性耳聾的發(fā)生以及“因聾致啞”現(xiàn)象的發(fā)生，對(duì)優(yōu)生優(yōu)育的開展、出生缺陷的防治以及全人口綜合素質(zhì)的提高均具有重要的臨床意義和社會(huì)意義。