雷公藤紅素對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231 的抑制作用研究

史曉娜 徐 霞 謝閨娥

廣州醫(yī)科大學(xué)金域檢驗(yàn)學(xué)院，廣東廣州 510182

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[1-2]。其中三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是孕激素受體、雌激素受體和人表皮生長(zhǎng)因子受體-2 都呈陰性表達(dá)的乳腺癌，復(fù)發(fā)率和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高，臨床預(yù)后較差[3]?；熕幬锸菍?duì)抗包括TNBC 在內(nèi)的乳腺癌的重要手段[4-5]，然而腫瘤耐藥性的產(chǎn)生嚴(yán)重影響治療效果[6-7]，因此，探索新型化療藥物已成為乳腺癌治療的一個(gè)重大課題。

雷公藤紅素又名南蛇藤素，分子式為C29H38O4，分子量為450.61，結(jié)構(gòu)式如圖1 所示。雷公藤紅素有抗炎[8]、抗氧化[9]、免疫抑制[10]及抗腫瘤活性[11-13]等多種藥理活性。它能抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，但其對(duì)乳腺癌的作用及其機(jī)制尚未完全明確。本研究探索雷公藤紅素對(duì)生物學(xué)特性與TNBC 最接近的MDA-MB-231細(xì)胞[14]的抗腫瘤作用，以期為探索抗乳腺癌的化療新藥提供依據(jù)。

圖1 雷公藤紅素結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 材料

人MDA-MB-231 乳腺癌細(xì)胞系來(lái)自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所；雷公藤紅素（Sigma，批號(hào)：042M4608V）；TUNEL 試劑盒（Roche，批 號(hào)：39006700）、Annexin V細(xì)胞凋亡試劑盒（BD Pharmingen，批號(hào)：6301518）；p-AKT、AKT、Bcl-xL 及Survivin 抗體（Cell Signaling，貨號(hào)分別為9271、9272、2762、2803）。

酶標(biāo)儀（Synerge-HTX，BioTek）；熒光顯微鏡（Cytation5，BioTek）；流式細(xì)胞儀（FACS Canto Ⅱ，Becton Dickinson）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試劑配制 雷公藤紅素溶解于二甲基亞砜，配制成10 mmol/L 母液，-20℃避光貯存。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) MDA-MB-231 于37℃、5% CO2培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM 中。

1.2.3 MTT 比色 MTT 實(shí)驗(yàn)方法參照本課題組前期研究論文中所述[15]。

1.2.4 Annexin V-FITC 熒光染色 實(shí)驗(yàn)分為兩組：對(duì)照組和處理組。對(duì)照組未經(jīng)任何處理，處理組用2.0 μmol/L 雷公藤紅素作用后，消化細(xì)胞，洗滌重懸后，加入Annexin V-FITC 與碘化丙啶（propidium iodide，PI），室溫避光孵育15 min 后在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)凋亡情況。

1.2.5 TUNEL 染色 固定細(xì)胞并用Triton X-100 打孔，加rTdT 反應(yīng)液37℃孵育1 h；再加PI 室溫避光孵育15 min；PBS 洗滌，干燥后用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，綠色熒光信號(hào)為T(mén)UNEL 染色陽(yáng)性。

1.2.6 免疫印跡法（Western blot）取30 μg 細(xì)胞總蛋白電泳后電轉(zhuǎn)印PVDF 膜，封閉后加1∶500 稀釋的一抗于4℃反應(yīng)過(guò)夜，第2 天洗滌后，用1∶1000 稀釋的HRP 標(biāo)記的二抗在室溫孵育1 h，ECL 法發(fā)光顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雷公藤紅素對(duì)MDA-MB-231 生長(zhǎng)的影響

MTT 比色表明，雷公藤紅素能抑制MDA-MB-231的生長(zhǎng)，其抑制作用呈濃度依賴(lài)性，作用48 h 后，半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為0.93 μmol/L。見(jiàn)圖2。

圖2 雷公藤紅素對(duì)MDA-MB-231 的生長(zhǎng)抑制曲線(xiàn)

2.2 雷公藤紅素對(duì)MDA-MB-231 凋亡的影響

Annexin V-FITC 染色結(jié)果顯示，處理組凋亡細(xì)胞比率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 Annexin V-FITC 熒光染色檢測(cè)雷公藤紅素對(duì)MDA-MB-231 的凋亡誘導(dǎo)作用

TUNEL 染色結(jié)果顯示，處理組TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞比率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見(jiàn)圖4。

2.3 雷公藤紅素對(duì)Akt 信號(hào)通路的調(diào)節(jié)

Western blot 試驗(yàn)表明，與對(duì)照組比較，處理組p-Akt、Survivin 和Bcl-xL 的蛋白表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；兩組Akt 總蛋白表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見(jiàn)圖5。

圖5 雷公藤紅素對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞Akt 信號(hào)通路的影響

3 討論

雷公藤紅素可抑制多種腫瘤的生長(zhǎng)[11-13,16-18]，但其對(duì)乳腺癌的作用及其機(jī)制尚未完全明確。本研究提示雷公藤紅素能抑制MDA-MB-231 乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，作用48 h 的IC50為0.93 μmol/L。

乳腺癌的發(fā)生及其化療抵抗可能與細(xì)胞凋亡異常有關(guān)[19-21]。本研究中處理組凋亡細(xì)胞比率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），提示雷公藤紅素能誘導(dǎo)MDA-MB-231 細(xì)胞發(fā)生凋亡。

Akt 通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[22]和乳腺癌化療敏感性[23-25]的關(guān)鍵信號(hào)通路。本研究表明雷公藤紅素能抑制Akt 磷酸化。Survivin[26]和Bcl-xL[27]是Akt 下游的凋亡抑制分子。雷公藤紅素作用后，伴隨Akt 去磷酸化，Survivin 和Bcl-xL 的表達(dá)隨之降低。

本研究揭示了雷公藤紅素對(duì)MDA-MB-231 的生長(zhǎng)抑制作用，但不足之處在于僅探討了這一種乳腺癌細(xì)胞系，沒(méi)有以正常乳腺上皮細(xì)胞系如MCF-10A 作為對(duì)照，也沒(méi)有陽(yáng)性藥物對(duì)照，后續(xù)本課題組會(huì)繼續(xù)完善和深入雷公藤紅素抗乳腺癌作用研究，以期為探索抗乳腺癌新藥提供更充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。